一种改良型EMSA试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术领域，具体涉及一种改良型EMSA试剂盒。

背景技术：

凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是研究启动子结合蛋白的经典方法，是一种用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技术。EMSA基本过程是将³²P或³³P标记或非放射性标记的包含特异的DNA位点的DNA片段与DNA结合蛋白共同孵育后进行电泳分析，蛋白-DNA复合物通过EMSA与游离DNA分离开来，蛋白质阻碍与其所结合的DNA片段的移动性。因此，游离DNA比DNA-蛋白质复合物移动的更快，凝胶的图像可以揭示游离和结合的标记的DNA的位置。EMSA不仅简单、迅速、灵敏度高；且可以用竞争性试验来评价蛋白和核酸结合的特性。目前，EMSA可以用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性抗体来检测特定的蛋白质，EMSA还可以结合蛋白双向电泳及质谱技术进行未知蛋白的鉴定分析。

随着EMSA技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重要。Jiang X等用EMSA方法证明了AP1能够结合在启动子的功能区域，并且调控LoVo细胞的PPARdelta的表达(Jiang,X.,et al.,Transcription factor AP1binds the functional region of the promoter and regulates gene expression of human PPARdelta in LoVo cell.Tumour Biol,2013.6(34):p.3619-3625)。Katanin是参与微管切断ATP酶家族成员的蛋白质，它的两种异源二聚体结构由KATNA1和KATB1编码，而Elk1能够与微管相互作用，Selcuk E等用EMSA方法证明Elk1能够结合KATB1启动子，调控其表达(Selcuk,E.,D.Canbaz and A.Et,Katanin-p80gene promoter characterization and regulation via Elk1.PLoS One,2013.7(8):p.e69423)。凝胶阻滞电泳分析显示青蒿素激活PXR与CYP3A4DNA结合的能力，表明CYP3A4的诱导是由青蒿素通过PXR的活化所介导(Hu,D.,et al.,Artemisinin protects against dextran sulfate-sodium-induced inflammatory bowel disease,which is associated with activation of the pregnane X receptor.Eur J Pharmacol,2014(738C):p.273-284)。

现如今的研究中，EMSA探针主要是合成生物素标记的单链探针，再通过变性、复性实验得到的双链探针。如Kim JR等运用生物公司合成的3’末端被生物素标记的正、反单链EMSA探针，并在室温下复性得到双链探针(Kim,J.,S.Mathew and P.Mathew,Blimp-1/PRDM1regulates the transcription of human CS1(SLAMF7)gene in NK and B cells.Immunobiology,2015.221(1):p.31-39)。又如GrycováA等、Hsu FT等亦分别通过设计合成包含转录因子结合位点的单链EMSA探针，之后通过低温复性得到双链探针，进而开展凝胶迁移率实验(Aneta,G.,D.Aneta and D.Zdenek,Impurities contained in antifungal drug ketoconazole are potent activators of human aryl hydrocarbon receptor.TOXICOLOGY LETTERS,2015.239(2):p.67-72；Hsu,F.,B.Chang and C.John,Synergistic Effect of Sorafenib and Radiation on Human Oral Carcinoma in vivo.SCIENTIFIC REPORTS,2015.5)。

上述EMSA探针的合成方法具有3点较明显的缺点：(1)通过复性得到的双链探针的比例难以保证，容易造成实验结果的假阴性；(2)复性不彻底的单链探针的显影亮度远高于蛋白-DNA复合物结合条带的显影亮度，造成假阴性，且双链探针比例较低影响阳性结果的显影；(3)需要合成大量的单链探针，成本较高。

为了克服现有EMSA探针制备方法存在的缺陷，本申请的申请人在公开号为CN 105506150 A的中国发明专利申请中公开了一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法。该方法不采用传统的两条单链探针复性得到双链探针的方法，而是由单链探针PCR制得双链探针，不会出现由于复性不彻底造成的假阴性，也克服了单链自由探针带来的显影误差。但是，EMSA方法过程中需要多种试剂和探针，现有EMSA试剂盒不适用于这种改良型的EMSA方法。

技术实现要素：

有鉴于此，有必要针对现有技术中的不足，提供一种改良型EMSA试剂盒。

一种改良型EMSA试剂盒，包含盒体和位于盒体内的海绵垫，海绵垫上开设有容器孔，所述容器孔内放置装有试剂或探针的EP管，装有探针的EP管包含第一探针EP管、第二探针EP管和第三探针EP管，所述第一探针EP管内装有野生型生物素标记探针，第二探针EP管内装有野生型未标记竞争探针，第三探针EP管内装有突变型未标记竞争探针。

优选地，所述容器孔有两组，第一组容器孔内放置封闭液EP管、洗涤液EP管和平衡液EP管，第二组容器孔内放置结合缓冲液EP管、蓝色上样缓冲液EP管、无色上样缓冲液EP管、第一探针EP管、第二探针EP管、第三探针EP管、装有Buffer 1的EP管、装有Buffer 2的EP管、装有PMSF的EP管、装有DTT的EP管和装有protease inhibitor cocktail的EP管。

优选地，所述第一组容器孔位于海绵垫的中部及左部，所述第二组容器孔位于海绵垫的右部。

优选地，所述第一组容器孔位于海绵垫的中部，所述第二组容器空位于海绵垫的两端。

优选地，所述第一组容器孔包含6个容器孔，分为2或3排；所述第二组容器孔包含11个容器孔，分为2-4排。

优选地，每个容器孔旁标有编号，其内EP管上标有相同的编号。

优选地，所述第一组容器孔用于放置50mL的EP管，所述第二组容器孔用于放置1mL的EP管。

优选地，所述封闭液EP管、洗涤液EP管和平衡液EP管各有两管；所述结合缓冲液EP管、蓝色上样缓冲液EP管、无色上样缓冲液EP管、第一探针EP管、第二探针EP管、第三探针EP管、装有Buffer 1的EP管、装有Buffer 2的EP管、装有PMSF的EP管、装有DTT的EP管和装有protease inhibitor cocktail的EP管各一管。

优选地，所述结合缓冲液EP管内装有10×结合缓冲液，所述蓝色上样缓冲液EP管内装有10×蓝色上样缓冲液，所述无色上样缓冲液EP管内装有10×无色上样缓冲液，所述装有DTT的EP管内装有200×DTT，所述装有protease inhibitor cocktail的EP管内装有100×protease inhibitor cocktail。

优选地，平衡液EP管、第一探针EP管、第二探针EP管和第三探针EP管为棕色EP管。

优选地，所述海绵垫为黑色海绵垫。

优选地，所述试剂盒还含有盖子，所述盖子可开合的盖在所述盒体上。

传统EMSA实验相对科研用户来说比较复杂，且实验结果特异性较低，灵敏度不高。本实用新型改良型EMSA试剂盒使用新型的EMSA探针，简化了EMSA实验操作流程，提高探针特异性，使EMSA实验变得简单方便。

附图说明

图1为实施例1中改良型EMSA试剂盒的一种结构示意图。

图2为实施例1中改良型EMSA试剂盒的另一种结构示意图。

图3为实施例2中改良型EMSA试剂盒的一种结构示意图。

附图标记如下：

盒体1，海绵垫2，容器孔3，第一组容器孔31，第二组容器孔32，盖子4。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图和具体实施例作进一步说明。

实施例1

如图1和图2所示，一种改良型EMSA试剂盒，包含盒体1、盖子4和位于盒体1内的海绵垫2，所述盖子4可开合的盖在所述盒体1上，海绵垫2上开设有多个容器孔3。所述容器孔3分为两组，第一组容器孔31分别用于放置封闭液EP管、洗涤液EP管或平衡液EP管，封闭液EP管内装有封闭液，洗涤液EP管内装有洗涤液，平衡液EP管内装有平衡液。第二组容器孔32用于放置结合缓冲液EP管、蓝色上样缓冲液EP管、无色上样缓冲液EP管、装有探针的EP管、装有PMSF的EP管、装有Buffer 1的EP管、装有Buffer 2的EP管、装有200×DTT的EP管和装有100×protease inhibitor cocktail的EP管。所述结合缓冲液EP管内装有10×结合缓冲液，蓝色上样缓冲液EP管内装有10×蓝色上样缓冲液，无色上样缓冲液EP管内装有10×无色上样缓冲液。所述装有探针的EP管包含第一探针EP管、第二探针EP管、第三探针EP管，所述第一探针EP管内装有野生型生物素标记探针，第二探针EP管内装有野生型未标记竞争探针，第三探针EP管内装有突变型未标记竞争探针。

在某些具体实施例中，如图1所示，第一组容器孔31位于海绵垫的中部及左部，有3个，单排排列，用于放置50mL的EP管；第二组容器孔32位于海绵垫的右部，有11个，分为3排，上下两排每排4个，中间一排3个，用于放置1mL的EP管。

在另一些具体实施例中，如图2所示，第一组容器孔31位于海绵垫的中部，有3个，单排排列，用于放置50mL的EP管；第二组容器孔32位于海绵垫的右部，有11个，分为2排，分别位于第一组容器孔的两侧，每排5或6个，用于放置1mL的EP管。

优选地，平衡液EP管、第一探针EP管、第二探针EP管、第三探针EP管为棕色EP管，以防止试剂、探针的降解；其他EP管为白色EP管。为进一步防止试剂、探针的降解，所述海绵垫2采用黑色海绵垫。

本实施例中试剂盒的使用方法如下：

本实施例中所用的EMSA探针根据公开号为CN 105506150A的中国发明专利申请制备。所述EMSA探针包含第一条链和与其互补的第二条链，所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列。所述接头序列为回文序列，所述接头序列的长度为8-15nt，所述接头序列经生物书标记和LNA修饰。

EMSA方法如下：

S1、核蛋白提取

取10⁷个细胞用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀；加入400μL预冷含0.5mM PMSF、1×DTT、1×protease inhibitor cocktail的蛋白抽提试剂Buffer 1。最高速剧烈振荡(Vortex)5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长时间)。4℃12,000-16,000g离心5分钟。完全吸尽上清，向剩余沉淀中加入2.5倍体积(50μL)添加了含0.5mMPMSF、1×DTT、1×protease inhibitor cocktail的蛋白抽提试剂Buffer 2。最高速剧烈振荡15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈振荡15-30秒，共30分钟。4℃12,000-16,000g离心10分钟。立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存备用。

S2、结合反应

结合反应组别及反应体系设置如表1所示。

表1、结合反应组别及反应体系设置表

结合反应的简要步骤如下：

在加入野生型标记探针前，先将其他成分混匀，消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷竞争探针优先反应，然后加入野生型标记探针混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。

S3、电泳分析

向结合反应后的混合物中加入1.5μl EMSA/Gel-Shift无色上样缓冲液(10×)，混匀后立即上样。在多余的某个上样孔内加入10μl稀释好的1×的EMSA/Gel-Shift蓝色上样缓冲液，用于观察电泳进行的情况。用0.5×TBE作为电泳液，按照10V/厘米的电压预电泳10分钟；按照10V/厘米的电压电泳，电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。本实施例中电泳使用PAGE胶，按照常规配方配制。

S4、电转运及紫外交联

取和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜及两片滤纸，用0.5×TBE浸泡至少10～15分钟；采用湿法电转膜装置，以0.5×TBE为转膜液，4℃，380mA(约100V)转膜50分钟。用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm²，交联1-5分钟。

S5、信号检测

37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液，交联过的尼龙膜加入15ml封闭液，缓慢摇动15分钟。封闭液封闭的尼龙膜，转入15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液，缓慢摇动15分钟。尼龙膜转移至15-20ml洗涤液中，缓慢摇动漂洗1分钟，重复漂洗3次(共漂洗4次)。尼龙膜转移至20-25ml检测平衡液的容器内，缓慢摇动5分钟；取出尼龙膜在表面小心加上BeyoECL Plus Reagent工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜，室温静置2-3分钟。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒内。用X光片压片1～5分钟，显影定影。

实施例2

如图3所示一种改良型EMSA试剂盒，包含盒体1、盖子4和位于盒体1内的海绵垫2，所述盖子4可开合的盖在所述盒体1上，海绵垫2上开设有多个容器孔3。所述容器孔3分为两组，第一组容器孔31用于放置封闭液EP管、洗涤液EP管和平衡液EP管，每种试剂的EP管各两只，封闭液EP管内装有封闭液，洗涤液EP管内装有洗涤液，平衡液EP管内装有平衡液。第二组容器孔32用于放置结合缓冲液EP管、蓝色上样缓冲液EP管、无色上样缓冲液EP管、EMSA探针EP管、装有PMSF的EP管、装有Buffer 1的EP管、装有Buffer 2的EP管、装有200×DTT的EP管和装有100×protease inhibitor cocktail的EP管，每种试剂或探针的EP管各一只。所述结合缓冲液EP管内装有10×结合缓冲液，蓝色上样缓冲液EP管内装有10×蓝色上样缓冲液，无色上样缓冲液EP管内装有10×无色上样缓冲液。

第一组容器孔31位于海绵垫的中部及左部，有6个，分为2排，每排3个，用于放置50mL的EP管；第二组容器孔32位于海绵垫的右部，有9个，分为3排，每排3个，用于放置1mL的EP管。

优选地，容器孔旁分别标有编号01-17，其内EP管上标有相同的编号。通过编号的形式，可以直接根据编号确认EP管内所装成分，也可避免EP管放错位置，便于实验操作。如编号01、02的容器孔内放置封闭液EP管，编号03、04的容器孔内放置洗涤液EP管，编号05、06的容器孔内放置平衡液EP管，编号07-09的容器孔内依次放置结合缓冲液EP管、蓝色上样缓冲液EP管、无色上样缓冲液EP管，编号09-12的容器孔内依次放置第一探针EP管、第二探针EP管、第三探针EP管，编号13-17的容器孔内依次放置装有Buffer 1的EP管、装有Buffer 2的EP管、装有PMSF的EP管、装有200×DTT的EP管和装有100×protease inhibitor cocktail的EP管。

优选地，平衡液EP管、EMSA探针EP管为棕色EP管，以防止试剂、探针的降解。为进一步防止试剂、探针的降解，所述海绵垫2为黑色海绵垫。

本实施例中试剂盒的使用方法与实施例1相同。

以上所述实施例仅表达了本实用新型的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型专利的保护范围应以所附权利要求为准。