一种呼吸道病毒快速检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及医学诊断领域，具体涉及一种多用途的呼吸道病毒快速检测试剂盒及其制备方法。

发明背景

目前已证明，95％的急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由细菌外的病原引起，其中以呼吸道病毒最常见，包括呼吸道合胞病毒(RSV)A型、B型、腺病毒(ADV)、流感病毒A(FluA)、流感病毒B(FluB)、副流感病毒1(PIV1)、副流感病毒2(PIV2)、副流感病毒3(PIV3)、柯萨奇B组病毒等。其中，多种病毒具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点，并且近来新的致病性病毒还在不断地被发现，如人类偏肺病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒以及如今风靡全球的H1N1甲型流感病毒等，给临床疾病诊断和治疗造成极大的困难。

呼吸道感染是世界范围内低龄儿童(<5岁)死亡的首位原因，每年可造成约5百万儿童死亡。儿童上呼吸道感染的患病次数平均为3-8次/年，下呼吸道感染率比URTI低，在1岁儿童中感染的比例约1～3％，学龄儿童至5％～10％。呼吸道病毒习惯上是指侵害呼吸道的病毒，至少涉及到8个科，200多种型别的病毒。临床常见的可导致呼吸道感染的病毒有腺病毒(AdV)、甲型/乙型流感病毒(FluA和FluB)和呼吸道合胞病毒(RSV)等。

腺病毒(AdV)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，线状双链DNA病毒。分为两个属，6个亚群(A-F)，包括51个血清型。腺病毒可通过人、水、媒介物和器械传播,室温条件下,腺病毒在污物中存在周期可延长至3周。腺病毒在儿童和军营人员中更易发生感染和大规模流行,大多数婴幼儿在出生后的5年内至少感染过1种腺病毒株。该病毒可导致肺炎、发热上呼吸道疾病、结膜炎、膀胱炎、肠胃炎等，根据感染者的免疫和心肺功能的不同可导致严重的呼吸窘迫甚至死亡。ADV感染全年散发，冬春季相对较多，阳性检出率最高可达15％。可从呼吸道分泌物标本、眼拭、咽拭或粪便中分离到病毒，也可采用IFT、RIA或ELISA等方法测定病毒抗原作出快速诊断，在病毒分离阳性的病人中阳性率为60％～65％，在感染后7天可出现中和抗体、血凝抑制抗体和补体结合抗体。用血清学方法测定抗体可明确诊断。

甲型流感病毒和乙型流感病毒(FluA和FluB)主要包括内部的核心和外部的病毒囊膜，核心是由核蛋白卷曲包绕螺旋形RNA组成，核蛋白的抗原稳定，很少发生变异，具有型特异性。根据核蛋白抗原性的不同，将流感病毒分甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，三型病毒具有相似的生化和生物学特征。猪和禽类可携带甲型流感，乙、丙型流感仅在人之间转播。甲型和乙型流感的临床症状相似，但是甲型流感病毒导致的住院率四倍于乙型流感病毒。乙型流感通常有肌炎及胃肠道症状。丙型流感很少有下呼吸道症状，但偶尔会造成上呼吸道疾病。可引起急起高热、显著乏力，全身肌肉酸痛，而鼻塞、流涕和喷嚏等上呼吸卡他症状相对较轻。本病具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。一般出现于冬季，北半球通常在1、2月份达到高峰，南半球的流行时间较晚，热带地区可常年发病。世界性大流行常有2～3个流行波，一般流行3～4周会自然停止。世界卫生组织估计北半球每年1亿人感染流感，5000万次就诊，30万次住院，主要是高危人群和老年人，每年1万人死于流感，主要是虚弱的老年人。

呼吸道合胞病毒(RSV)是一种RNA病毒，于1950年首先从实验室患上呼吸道感染的猩猩中分离而得，是有包膜的单股RNA病毒，直径为120～200nm，属于副粘病毒科的肺病毒属，仅有1个血清型。多见于新生儿和6个月以内的婴儿，可由空气飞沫和密切接触传播，潜伏期3～7日，传染性强。应用单克隆抗体可将RSV分为A、B两个亚型,有文献报道RSV A亚型感染起病急,病情重；B亚型感染病情相对较轻。RSV是世界各地婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的主要病原体之一，严重威胁婴幼儿健康，尤其是早产儿、先天性心脏病患儿、免疫缺陷的婴儿和儿童易发严重性RSV感染。从新生儿到成年人任何年龄组都会感染合胞病毒。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。有研究表明RSV流行季节集中于每年的冬春季(11月至翌年3月，高峰出现在12月至翌年1月)，我国北京地、杭州、苏州及其他温带国家(如日本、美国)均一致，就诊的儿童患者阳性率可达42.50％。

呼吸道病毒感染是临床最常见的疾病之一，且病原学复杂，精确的病原学分析不仅是确诊依据，也是合理选择治疗方案的基础。因此了解呼吸道病毒检测手段和开展快速病毒检测，已成为当务之急。临床目前对于病毒感染主要是检测机体对病毒产生的相关抗体，由于受机体免疫力等多种因素的影响而不能满足临床诊断需要。检测呼吸道感染主要病毒，目前国内外多采用病毒分离培养法、间接免疫荧光法(IF)、直接免疫荧光法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(APAAP)、生物素-链霉亲和素-过氧化物酶法、酶联免疫吸附法(ELISA)、病毒快速检测法、分子生物学法，如多重逆转录聚合酶链反应(mRT-PCR)、巢式PCR及核酸杂交、多重实时PCR、基因芯片技术、悬浮阵列技术等多种检测手段。

但是上述检测方法均需要特殊的仪器设备和专业培训人员，并且在实验室才能进行检测，费用高昂、操作复杂，耗时长，不适于临床筛查，更不适宜于现场即时检测。例如病毒培养是病毒检测的金标准，但这种检测方法周期很长，一般要3～7天的时间，灵敏度不高。

RT-PCR能够4-8小时内对样本实现检测，且灵敏度和特异性很高，但是并不适于在机场、口岸、火车站、医院等人口密度大、人流量大、不易让人群长时间聚集的公共场所。

因此，目前临床上急需建立一种快速、简便、高效，能够一次同时鉴定多种病毒并能广泛推广的快速呼吸道病毒检测方法。

技术实现要素：

针对现有检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测呼吸道病毒的胶体金法检测试纸及其制备方法。采用本发明的试纸条或试剂盒，可通过一次操作实现快速检测呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)，从而简化操作过程，实现快速检测的目的。

本发明所述用于检测呼吸道病毒的胶体金法检测试纸，所述试纸包括样品垫、含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中样品垫、含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，所述硝酸纤维素膜包括包被有甲型流感病毒抗体的检测区、包被有乙型流感病毒抗体的检测区、包被有呼吸道合胞病毒抗体的检测区、包被有腺病毒抗体的检测区和包被有抗鼠免疫球蛋白抗体的控制区，所述胶体金颗粒标记物包括胶体金标记抗腺病毒抗体、胶体金标记抗呼吸道合胞病毒抗体、胶体金标记甲型流感病毒抗体和胶体金标记乙型流感毒抗体。

本发明所述的胶体金法检测试纸的原理为：将待测样品滴入检测试剂板的样品垫后，玻璃纤维膜上的胶体金颗粒标记物被溶解。若样品中存在呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)中任一种或其任意组合，则胶体金颗粒标记物分别与样品中的相应病毒抗原形成免疫复合体。该免疫复合体因毛细管作用在硝酸纤维素膜中移动，被硝酸纤维素膜相应检测区中固定化的甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体或腺病毒抗体捕捉，因胶体金的作用形成紫红色条带。本试纸的紫红色条带可以目测确认，判断样品中是否存在腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒或乙型流感病毒中的任一种或其任意组合。应注意的是，检测区固定的抗体与相对应同一病毒的胶体金标记的抗体为不同的抗体，例如来源于不同的公司、用不同的方法制备、种属不同或者针对同一病毒但结合位点不同的抗体，优选的是两者为针对同一病毒但结合位点不同的抗体，这样可以保证胶体金标记免疫复合体因毛细管作用在硝酸纤维素膜中移动时被相应检测区中固定化的抗体所识别。

另一方面，无论样品中是否存在腺病毒、呼吸道合胞病毒抗原、甲型流感病毒或乙型流感病毒中的任一种或其任意组合，剩余的胶体金标记抗体继续在硝酸纤维素膜移动，在控制区被固定化的抗鼠免疫球蛋白抗体捕捉，因胶体金而形成紫红色条带。这显示了胶体金标记抗体的正常移动。

优选的，检测试纸中玻璃纤维膜上的胶体金标记抗腺病毒抗体、胶体金标记抗呼吸道合胞病毒抗体、胶体金标记甲型流感病毒抗体和胶体金标记乙型流感毒抗体的用量分别为25-45μg/cm²，更优选为30-36μg/cm²。

优选的，检测试纸中硝酸纤维素膜上检测区含有的甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体和腺病毒抗体的用量为0.1-0.5μg/mm，更优选为0.2-0.3μg/mm。

优选的，检测试纸中硝酸纤维素膜上控制区含有的抗鼠免疫球蛋白抗体的用量为0.1-0.5μg/mm，更优选为0.3-0.4μg/mm。

本发明检测试纸中所述的甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体和腺病毒抗体均为鼠源抗体，更优选为鼠源单克隆抗体。

本发明检测试纸中所述的抗鼠免疫球蛋白抗体可以为兔抗鼠免疫球蛋白抗体、羊抗鼠免疫球蛋白抗体或驼羊抗鼠免疫球蛋白抗体，优选为羊抗鼠免疫球蛋白抗体。

本发明还提供了一种用于检测呼吸道病毒的胶体金法检测试纸的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用化学还原法制备胶体金溶液，将抗腺病毒抗体、抗甲型流感病毒抗体和抗乙型流感病毒抗体和抗呼吸道合胞病毒抗体分别加入到胶体金溶液中，将制备得到胶体金-抗体颗粒标记物均匀的结合在玻璃纤维素膜上，冷冻干燥；

(2)将包被有甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体、腺病毒抗体和抗鼠免疫球蛋白抗体的缓冲液分别喷洒于硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线，充分干燥；

(3)在底板的一面顺次相互搭接地粘附样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，即得检测试纸。

上述方法中，检测试纸中玻璃纤维膜上的胶体金标记抗腺病毒抗体、胶体金标记抗呼吸道合胞病毒抗体、胶体金标记甲型流感病毒抗体和胶体金标记乙型流感毒抗体的用量分别为25-45μg/cm²，更优选为30-36μg/cm²。

上述方法中，检测试纸中硝酸纤维素膜上检测区含有的甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体和腺病毒抗体的用量为0.1-0.5μg/mm，更优选为0.2-0.3μg/mm。

上述方法中，检测试纸中硝酸纤维素膜上控制区含有的抗鼠免疫球蛋白抗体的用量为0.1-0.5μg/mm，更优选为0.3-0.4μg/mm。

上述方法中，检测试纸中所述的甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体和腺病毒抗体均为鼠源抗体，更优选为鼠源单克隆抗体。其中，应注意胶体金标记抗体和检测区相对应的抗体应为不同的抗体。

上述方法中，检测试纸中所述的抗鼠免疫球蛋白抗体可以为兔抗鼠免疫球蛋白抗体、羊抗鼠免疫球蛋白抗体或驼羊抗鼠免疫球蛋白抗体，优选为羊抗鼠免疫球蛋白抗体。

上述方法中，确保样品垫一端压住玻璃纤维膜一端0.5～1mm，玻璃纤维膜另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5～1mm，吸水纸的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5～1mm，得检测试纸。

将组装后的检测试纸在切条机上切成0.5cm款的试剂条待用，铝箔包装后，即可作为成品入库。

本发明的另一目的是提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测试纸、使用说明书和包装盒。

本发明制备得到的检测试纸具有较高的灵敏度，具有操作安全(无放射物污染)、简便(简单操作一步完成)、适合单人/份检测(放免、酶免不适合单人/份或少量样品检测)和快速(15分钟左右即可有结果)等优点，可实现对呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)抗原现场和家庭自检，弥补现阶段层析试剂盒灵敏度不高及不能实现分型的缺陷，将能够最大限度地降低人群聚集感染的风险、在疫情现场减低疾病造成的危害。

本发明的试纸可以实现在一条纸条上同时检测4种病毒，缩短了检测周期，减少因为单一检测某种分型而漏检的现象，并节约了一次性耗材，因而相对于现有检测试剂盒具有明显的技术优势。

附图说明

图1：检测试纸的结构示意图。其中，1为样品垫，2为玻璃纤维膜，3为硝酸纤维素膜，4为吸水纸，5为底板，6为检测区(T线)，7为控制区(C线)，8为待检抗原，9为胶体金标记抗体，10为胶体金标记抗体与病毒抗原形成的免疫复合体，11为检测区抗体，12为控制区抗体。

图2：含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜制备示意图

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1呼吸道病毒快速检测试纸的制备

(1)胶体金的制备

采用化学还原法，向氯金酸水溶液中加入柠檬酸三钠还原剂，制备成所需要的胶体金颗粒。方法先将0.01％HAuCL4溶液500ml，加热至沸腾，迅速加入8.0ml的柠檬酸三钠水溶液，加热至出现红色后继续煮沸10-15min。恢复体积至500ml。

(2)胶体金-抗体结合物制备

a.取胶体金溶液500ml，在磁力搅拌器搅拌的状态下，用0.2M的K₂CO3溶液将PH调制8.0。

b.将抗呼吸道合胞病毒的鼠单克隆抗体(日本tuno公司)用0.01MPBS稀释成1.5mg/ml，取5支离心管各加入1ml的胶体金溶液，分别在前4管中加入30ul、40ul、45ul、50ul待标记抗体，最后一管作为对照，混合均匀后室温放置5min。然后在前4管中各加入100ul浓度为10％的NaCl溶液。混匀后室温放置10min。以没有变蓝色的一管所加入的抗体量作为最佳蛋白标记量。

抗腺病毒的鼠单克隆抗体、抗甲型流感病毒(FluA)的鼠单克隆抗体和抗乙型流感病毒(FluB)的鼠单克隆抗体(均购自日本tuno公司)的制备同上。

c.根据体积和标记实用量计算所需抗体的量，将1.5mg/ml的上述4种抗体分别缓慢加入到胶体金溶液中，室温搅拌20min。

d.加10％BSA，至终浓度2％，室温搅拌5min。

e.加10％PEG，至终浓度1％，室温搅拌5min。

f.10000rpm/min离心30min，小心吸取上清，用100ml的胶体金保存液悬浮沉淀。置4℃保存备用。

(3)金标垫的处理

取15mm*300mm的玻璃纤维素膜摆放在不锈钢盘上，将胶体金抗体结合液均匀的含浸在玻璃纤维素膜上，然后放到冻干机上冷冻过夜，至完全干燥。

(4)抗体固相硝酸纤维素膜的制备

a.将抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体(购自Abcam公司)用0.01M的PBS稀释成浓度2.8±0.1mg/ml的抗体溶液，用点膜仪以1μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线。

与此类似，将抗腺病毒的单克隆抗体、抗甲型流感病毒(FluA)的单克隆抗体和抗乙型流感病毒(FluB)的单克隆抗体(购自Abcam公司)用0.01M的PBS稀释成浓度2.8±0.1mg/ml的抗体溶液，用点膜仪以1μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，彼此间隔0.5-0.8cm。

b.将羊抗鼠IgG多克隆抗体(购自Abcam公司)用0.01MPBS稀释成2.0±0.1mg/ml的抗体溶液，用点膜仪以1μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成质控线，和检测线之间的间距为0.8cm。

c.将固定有抗体的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中充分干燥。

d.置干燥环境中保存备用。

(5)组装

a.在塑料衬片中间位置粘贴抗体固相硝酸纤维素膜。

b.在塑料衬片上固定硝酸纤维素膜位置的顶端，粘贴吸水纸；下端粘贴金标垫；吸水垫和金标垫同硝酸纤维素膜边沿约2mm。

c.标记垫的下方粘贴样品垫，样品垫覆盖金标垫约2mm。

d.组装后的衬片，在切条机上切成0.5-1cm款的试剂条待用。检测试纸的成品结构如图1所示。其中，1为样品垫，2为玻璃纤维膜，3为硝酸纤维素膜，4为吸水纸，5为底板，6为检测区(T线)，7为控制区(C线)，8为待检抗原，9为胶体金标记抗体，10为胶体金标记抗体与病毒抗原形成的免疫复合体，11为检测区抗体，12为控制区抗体。

(6)包装

(7)成品入库。最终成品试剂盒包括上述制备的检测试纸、使用说明书和包装盒。

实施例2试剂盒的检测应用

本试剂盒能定性的检测鼻腔擦拭液、咽喉擦拭液、鼻腔抽吸液样本中的病毒样本；通过对临床样本的检测，阳性、阴性的符合率高，具有较高的灵敏度和特异性。

于三家不同医院检测未知感染源病人临床样本1180份，其中阳性410份，阴性770份。

灵敏度：410份阳性样本中检出阳性399份，灵敏度为97.3％。其中检测到呼吸道合胞病毒样本97份，腺病毒114份，甲型流感病毒(FluA)85份，乙型流感病毒(FluB)103份。

特异性：770份阴性样本中检测出阴性760份，特异性为98.7％。

实施例3：腺病毒检测对比研究

利用免疫层析原理，定性检测咽喉擦拭液标本中的腺病毒抗原。将灭菌棉棒从口腔完全插入咽喉中，以咽后壁、上颚扁桃的发红部位为中心，摩擦数次，采集粘膜表皮。采集时，要注意不要碰到唾液。

预先在附属的抽提用管子中加入0.5ml样本抽提液(到下方的基准线为止)，放在立架上。将采集样本后的灭菌棉棒浸在抽提用管子中的样本抽提液中搅拌。从抽提用管子的外侧，用手指挤压灭菌棉棒数次，使样本抽提液充分浸透灭菌棉棒，然后拔出灭菌棉棒，绞出的液体作为样品待测。挤压抽提用管子，滴3滴到检测板的样品滴下部，15min后读结果。

本采样方式免疫荧光法确认：咽喉擦拭液204例，包括经免疫荧光法确认的70例ADV阳性样本和134例ADV阴性样本；被考核试剂检测阳性的为70例，二者检测阳性一致的为69例；被考核试剂检测阴性的为134例，二者检测阴性一致的为133例，详见下表：

灵敏度＝69/70×100％＝98.6％

特异性＝133/134×100％＝99.2％

总一致性＝(69+133)/(70+134)×100％＝99.0％

实施例4：甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)检测对比研究

4.1样品的调制方法

预先在采样用管子中加入0.5ml样本抽提液，放在立架上。

①鼻腔抽吸液

将鼻腔抽吸液0.5ml悬浊于运输培养基或2ml生理盐水中。在已经加入了样本抽提液的采样用管子中加入0.5ml悬浊液，充分混合后作为样品待测。

②鼻咽拭子(鼻腔擦拭液)、口咽拭子(咽喉擦拭液)

将采集样本后的棉棒浸在采样用管子中的样本抽提液中搅拌。从采样用管子的外侧，用手指挤压棉棒数次，使样本抽提液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出的液体作为样品待测。

4.2.检测操作方法

①将采样用管子的样品滴下100μL(约3滴)到检测板的样品滴下部。

②15分钟后观察结果。

4.3、检测试纸的性能

本品的最小检出量：甲型流行性感冒病毒最小检测灵敏度为3.0×10⁴TCID₅₀/每次检测。乙型流行性感冒病毒最小检测灵敏度为1.5×10⁵TCID₅₀/每次检测。

对流行性感冒病毒的反应性：

①甲型流感病毒：亚型的H1N1：5株、H2N2：3株、H3N2：7株，全被确认有反应。

②流感B病毒：流感B病毒9株，全被确认有反应。

实施例5：呼吸道合胞病毒检测对比研究

呼吸道合胞病毒传播广泛，对婴幼儿危害大，甚至导致死亡，且危害有逐渐上升的趋势。而现有的检测的手段，如经典的实验室诊断技术一病毒分离和培养耗时太长不能做到及时检测，而血清学需要等病情达到一定程度后才能检测完全失去了检测的意义。而现行医院多使用大型的仪器，不仅仪器十分昂贵，即使一次性投入购得仪器后，后续需要使用到的试剂也是十分昂贵的。

本发明制备的检测试纸为呼吸道合胞病毒的快速准确的检测提供了方便，为尽早诊断、减少疾病的传播以及确定正确的治疗方案，防止滥用抗生素提供重要依据。

从方法学角度，胶体金免疫层析法与其他方法学比较如下：

本发明产品同市面上同类单一胶体金产品检测呼吸道合胞病毒性能对比：