一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法与流程

本发明属于药物检测分析领域，具体涉及一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法。

背景技术：

丹红注射液（国药准字z20026866）是通过现代工艺从丹参（唇形科植物丹参salviamiltiorrhizabunge.的干燥根及根茎）和红花（菊科植物红花carthamustinctoriusl.的干燥花）两味传统中药提炼而成的标准化的水溶性成分制剂。丹参和红花是两味传统中药，常常被合用来治疗心脑血管疾病。根据传统的中医理论，丹参性主寒，红花性主温，一升一降，共奏活血化瘀，通经活络之功效。近年来临床上应用丹红注射液治疗瘀血闭阻所致的胸痹及中风获得肯定疗效，但对其治疗缺血性脑病的物质基础仍旧不明确。因此用科学、准确的方法来评估丹红注射液对脑缺血再灌注损伤的药效物质基础，了解其的代谢产物和途径对于丹红注射液的临床运用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法，具体采用“杆-阱”扫描ida工作模式在一针进样中同时完成丹红注射液代谢产物鉴定检测方法；

本发明采用的技术方案如下：

一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取丹红注射液尾静脉注射sd大鼠，注射量为10～12mg/kg，在10min～6h各时间点眼眶采血，血样置肝素化离心管中，离心分离血浆；

(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆200μl，加甲醇：乙腈混合液，血浆与混合液体积比1：2.5～3，旋涡混合，离心，取上清作为样品待测；

(3)采用高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：

a、液相色谱条件：shimadzuuflcxr

流动相a:h2o(含0.05%fa+5mmnh4fa)

流动相b:ch3oh:ch3cn(1:1)

流速:0.1～0.5ml/min

进样体积:4～10ul

色谱柱:poroshell120ec-c18

柱温：40～70℃

梯度洗脱；

b、质谱条件:absciexqtrap4500system

扫描模式scanmode：esi,neg/pos

质谱模式msmode：ems(100～750)-ida-epi，mrm-ida-epi，prec/nl-ida-epi

增强子离子扫描范围epirange：m/z80-750

动态填充时间dynamicfilltime：开启

动态背景扣除dbs：开启

气帘气cur：30psi

碰撞气cad：medium/high

喷雾电压is：-4500v

离子源温度tem：550℃

雾化气gas1：50psi

加热气gas2：50psi

(4)qtrap液质联用仪结合ida(数据依赖性扫描，自动采集ms²)信息相关扫描方式，ems-ida-epi筛查高含量的有效成分及代谢物，(p)mrm-ida-epi高灵敏度的筛查目标有效成分及预测代谢物，nl/pre-ida-epi筛查具有特征中性丢失和特征子离子的代谢物。(p)mrm-ida-epi是三种扫描方式中灵敏度最高的模式，pmrm=predictivemrm，预测性mrm检测，pmrm根据结构类似物或代谢物具有相同的碎片预测mrm。数据采集及处理：metabolitepilot™代谢物鉴定软件；

进一步，所述步骤（1）中，取丹红注射液尾静脉注射sd大鼠，注射量为12mg/kg，在10min，30min，60min，6h各时间点眼眶采血，血样置肝素化离心管中，4000r/min离心分离血浆；

所述步骤（2）中，血样处理方法：微量加样器吸取血浆200μl，加甲醇：乙腈（1:9）混合液，血浆与混合液体积比1：3，旋涡混合30s，13000r离心15min，取上清液作为样品待测；

所述步骤（3）中，流速:0.3ml/min，进样体积:5ul；

所述步骤（3）中，柱温：50℃；

所述步骤（3）中：色谱柱:poroshell120ec-c18尺寸规格150mm×2.1mm，填料粒径2.7μm；

所述步骤（3）中：梯度洗脱程序：0～2min，流动相b的体积分数为2%；2～10min，流动相b的体积分数从2%增加为40%；10～13min，流动相b的体积分数从40%增加到95%；13～16min，流动相b的体积分数为95%，16～16.1min，流动相b的体积分数从95%减少到2%，16.1min～21min，之后，流动相b的体积分数保持2%；梯度洗脱中，流动相a和流动相b的体积分数之和为100%；

更具体的，优选本发明方法按以下步骤操作：

(1)取丹红注射液尾静脉注射sd大鼠，注射量为12mg/kg，在10min，30min，60min，6h各时间点眼眶采血0.3ml，血样置肝素化离心管中，4000r/min离心分离血浆；

(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆200μl，加甲醇：乙腈（1:9）混合液，血浆与混合液体积比1：3，旋涡混合30s，13000r离心15min，取上清作为样品待测；

(3)采用高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：

a、液相色谱条件：shimadzuuflcxr

流动相a:h2o(含0.05%fa+5mmnh4fa)

流动相b:ch3oh:ch3cn(1:1)

流速:0.3ml/min

进样体积:5ul

色谱柱:poroshell120ec-c18(150×2.1mm,2.7um)

柱温：50℃

梯度洗脱：0～2min，流动相b的体积分数为2%；2～10min，流动相b的体积分数从2%增加为40%；10～13min，流动相b的体积分数从40%增加到95%；13～16min，流动相b的体积分数为95%，16～16.1min，流动相b的体积分数从95%减少到2%，16.1min～21min，之后，流动相b的体积分数保持2%；梯度洗脱中，流动相a和流动相b的体积分数之和为100%；

b、质谱条件:absciexqtrap4500system

扫描模式scanmode：esi,neg/pos

质谱模式msmode：ems(100～750)-ida-epi，mrm-ida-epi，prec/nl-ida-epi

增强子离子扫描范围epirange：m/z80-750

动态填充时间dynamicfilltime：开启

动态背景扣除dbs：开启

气帘气cur：30psi

碰撞气cad：medium/high

喷雾电压is：-4500v

离子源温度tem：550℃

雾化气gas1：50psi

加热气gas2：50psi

(4)qtrap液质联用仪结合ida(数据依赖性扫描，自动采集ms²)信息相关扫描方式，ems-ida-epi筛查高含量的有效成分及代谢物，(p)mrm-ida-epi高灵敏度的筛查目标有效成分及预测代谢物，nl/pre-ida-epi筛查具有特征中性丢失和特征子离子的代谢物。(p)mrm-ida-epi是三种扫描方式中灵敏度最高的模式，pmrm=predictivemrm，预测性mrm检测，pmrm根据结构类似物或代谢物具有相同的碎片预测mrm。数据采集及处理：metabolitepilot™代谢物鉴定软件；

本检测方法发现注射液中含量较高的有效成分丹参素，原儿茶酸，原儿茶醛，迷迭香酸的ii相代谢物，主要是甲基化，硫酸化，甲基化后硫酸化，葡萄糖醛酸化等一系列代谢物，原型丹参素及迷迭香酸在代谢样品中未检测到，随着给药时间的推移变化，大部分代谢物在10min及30min达cmax，给药6h后原药及代谢物已大部分消除。基于qtrap系统独有的informationdependentacquisition的工作模式，在单针进样中可同时得到待测物的ms和ms²信息，以最少的样品量获得最大量的信息，结合中药特定的分子结构在质谱中的碎裂规律，建立多种surveyscan-ida-enhancedproductionscan的方法采集分析数据，该检测方法更快速、更灵敏；

下面将结合附图、实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

附图说明

图1：丹红注射液代谢产物列表图；

图2：丹参素(danshensu,dss)代谢物提取离子流图及二级质谱图；

图3：原儿茶酸(protocatechuicacid,dba)代谢物提取离子流图及二级质谱图；

图4：原儿茶醛(protocaterchuicaldehyde,pa)代谢物提取离子流图及二级质谱图；

图5：迷迭香酸(rosmarinicacid,ra)代谢物提取离子流图及二级质谱图；

图6：丹参素主要代谢物在血浆中的时间变化曲线图；

图7：原儿茶酸与其主要代谢物在血浆中的时间变化曲线图；

图8：原儿茶醛与其主要代谢物在血浆中的时间变化曲线图；

图9：迷迭香酸主要代谢物在血浆中的时间变化曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案、积极效果更加清楚明白，通过以下实施例对本发明进行进一步详细说明。以下对于具体实施方案的描述仅用于解释本发明，并不限定本发明；

一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法：

一、仪器：qtrap液质联用仪（质谱absciexqtrap4500system，液相shimadzuuflcxr）；

二、样品准备

丹红注射液尾静脉注射sd大鼠，注射量为12mg/kg，在10min，30min，60min，6h各时间点眼眶采血0.3ml，血样置肝素化离心管中，4000r/min离心分离血浆。微量加样器吸取血浆200μl，加甲醇：乙腈（1:9）混合液，血浆与混合液体积比1：3，旋涡混合30s，13000r离心15min，取上清作为样品待测；

三、检测条件

a、液相色谱条件：shimadzuuflcxr

流动相a:h2o(含0.05%fa+5mmnh4fa)

流动相b:ch3oh:ch3cn(1:1)

流速:0.3ml/min

进样体积:5ul

色谱柱:poroshell120ec-c18(150×2.1mm,2.7um)

柱温：50℃

梯度洗脱：0～2min，流动相b的体积分数为2%；2～10min，流动相b的体积分数从2%增加为40%；10～13min，流动相b的体积分数从40%增加到95%；13～16min，流动相b的体积分数为95%，16～16.1min，流动相b的体积分数从95%减少到2%，16.1min～21min，之后，流动相b的体积分数保持2%；梯度洗脱中，流动相a和流动相b的体积分数之和为100%；

b、质谱条件:absciexqtrap4500system

扫描模式scanmode：esi,neg/pos

质谱模式msmode：ems(100～750)-ida-epi，mrm-ida-epi，prec/nl-ida-epi

增强子离子扫描范围epirange：m/z80-750

动态填充时间dynamicfilltime：开启

动态背景扣除dbs：开启

气帘气cur：30psi

碰撞气cad：medium/high

喷雾电压is：-4500v

离子源温度tem：550℃

雾化气gas1：50psi

加热气gas2：50psi

四、分析方法

qtrap液质联用仪结合ida(数据依赖性扫描，自动采集ms2)信息相关扫描方式，灵敏度、稳定性、重现性与三重四极杆完全一致，同时具有高灵敏度、高扫描速度和多级扫描的定性功能，且还具有独特的扫描功能，即杆-阱相互关联的扫描，实时动态背景扣（dbs），一次进样，可运用实时正负切换数据采集，ems-ida-epi、(p)mrm-ida-epi、nl/pre-ida-epi等多种扫描模式，同时结合智能的代谢物鉴定软件metabolitepilot™，具有快速鉴定代谢物的独特功能；

1、ems-ida-epi，mrm-ida-epi，pre/nl-ida-epi等多种扫描模式结合，发现丹红注射液中含量较高的有效成分丹参素，原儿茶酸，原儿茶醛，迷迭香酸的ii相代谢物，主要是甲基化，硫酸化，甲基化后硫酸化，葡萄糖醛酸化等一系列代谢物。丹红注射液代谢产物列表见图1所示，原型丹参素及迷迭香酸在代谢样品中未检测到；

2、如图2～5所示，分别是丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸(rosmarinicacid,ra)代谢物提取离子流图及二级质谱图；

3、丹红注射液四个重要活性成分（丹参素，迷迭香酸，原儿茶醛，原儿茶酸）的代谢物追踪：分别在10min、30min、60min、6h不同时间点采集的血样，采用液质联用仪开展对母药及各代谢产物开展定量分析，测定不同时间点的血药浓度，绘制时间变化曲线图，结果如图6～9所示，检测到的各代谢物含量随着给药时间的推移变化，大部分代谢物在10min及30min达cmax，给药6h后原药及代谢物已大部分消除；

本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。