检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法与流程

技术特征：

1.一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括：ELISA反应板，重组FAdV-4fiber-2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。

2.根据权利要求1所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述重组FAdV-4fiber-2蛋白是通过如下步骤获得的：

(1)原核表达：以NCBI数据库中血清4型FAdV JSJ13(KM096544)基因组序列作为参考，设计特异性引物，扩增FAdV-4fiber-2基因完整的开放阅读框，将其克隆至pET-32a原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达；

(2)蛋白纯化和复性：将重组菌株超声处理后，提取菌体沉淀进行亲和层析纯化，然后通过梯度透析法复性，获得FAdV-4fiber-2蛋白。

3.根据权利要求2所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述FAdV-4fiber-2蛋白的基因序列扩增引物如下：

上游引物：5’-CCGGATATCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’；

下游引物：5’-CCGAAGCTT TTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’。

4.根据权利要求1所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：

所述包被液为碳酸盐缓冲液，其通过称取NACO₃ 1.5g及NaHCO₃ 2.9g，加入900mL超纯水溶解后，定容至1000mL获得；

可选的，所述洗涤液为PBST，并且所述PBST为含有体积分数0.05％吐温-20的PBS溶液；

可选的，所述封闭液为5％脱脂乳，其通过将5g脱脂乳溶解于100mL PBS中获得；

可选的，所述底物显色液为双组份TMB显色液；

可选的，所述终止液为2mol/L稀硫酸。

5.一种使用权利要求1所述间接ELISA试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)包被：使用包被液将重组FAdV-4fiber-2蛋白稀释，将已稀释的蛋白加至ELISA反应板中，4℃包被过夜；

(2)洗涤；

(3)封闭：将封闭液加至ELISA反应板中，于37℃封闭；

(4)洗涤；

(5)孵育待检血清：以封闭液稀释待检血清样品，将已稀释的待检血清样品加至ELISA反应板中，于37℃孵育；

(6)洗涤；

(7)孵育酶标二抗：以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，将已稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体加至ELISA反应板中，于37℃孵育；

(8)洗涤；

(9)显色：每孔加入显色液，于37℃显色；

(10)终止：每孔加入终止液，终止显色反应；

(11)读数：将ELISA反应板置于酶标仪中，在450nm波长下测定OD₄₅₀；

(12)检测：利用统计学方法计算出阴性标准样品的平均值和标准差(SD)，样品则判定该样品为FAdV-4阳性。

6.一种根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)包被：使用包被液将重组FAdV-4fiber-2蛋白稀释至1-2μg/mL，将已稀释的蛋白以100μL/孔的量加至ELISA反应板中，4℃包被过夜；

(2)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(3)封闭：将封闭液以300uL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃封闭2h；

(4)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(5)孵育待检血清：以封闭液稀释待检血清样品50-300倍，将已稀释的待检血清样品以100μL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃孵育15-45min；

(6)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(7)孵育酶标二抗：以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体4000-8000倍，将已稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体以100μL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃孵育15-45min；

(8)每孔加入300μL洗涤液洗涤ELISA反应板3次；

(9)显色：每孔加入100μL显色液，37℃显色5-15min；

(10)终止：每孔加入50μL的终止液，终止显色反应；

(11)读数：将ELISA反应板置于酶标仪中，在450nm波长下测定OD₄₅₀；

(12)检测：利用统计学方法计算出阴性标准样品的平均值和标准差(SD)，样品则判定该样品为FAdV-4阳性。

7.根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于：所述重组FAdV-4fiber-2蛋白被稀释至1.5μg/mL，所述待检血清样品被稀释200倍，所述酶标二抗被稀释6000倍，在所述步骤(5)和(7)中的孵育时间均为30min，所述显色时间为10min。

8.根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于：所述样品OD_450nm大于临界值0.130则判定该样品为FAdV-4阳性。

9.根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于：所述阴性标准血清为采集自无特定病原的鸡血清。

10.根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于：所述待检血清还包括阳性标准血清，并且所述阳性标准血清为经噬斑纯化后FAdV-4型毒株灭活后通过皮下注射途径免疫无特定病原鸡，21天后再经滴口途径感染无特定病原鸡，二次免疫后14天采集免疫鸡的血分离的血清。