用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置及其检测方法与流程

本发明涉及一种无损检测测量技术的技术领域，具体涉及一种用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置及其检测方法。

背景技术：

活性氧的产量是光动力治疗过程中把握剂量的一个关键，主要是通过基于直接或间接监测单线态氧产率、产量而获得治疗剂量信息。但目前无论是基于单线态氧发光检测方法，还是基于单线态氧捕捉，或者其他间接剂量监测方式，这些技术都存在信号弱，灵敏度低，实时性差，或不易检测，与活性氧产率相关程度低等各种限制，而且使用探针直接捕捉单线态氧的检测方式不仅对单线态氧形成了淬灭和消耗，而且检测的精确度也会受到影响，因而不能提供精确、实时的、易于实施的光动力剂量监测。

技术实现要素：

本发明的目的在于：克服现有技术的不足，提供一种用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置及其检测方法，全新的纳米药物高效输运和肿瘤治疗及监测体系，为高精度、高效治疗肿瘤提供了一种可行性方案；提出了替代比率法检测单线态氧的新思路，通过选择性检测与单线态氧同步产生的氧自由基，利用其和单线态氧在产出上的比率关系，反推单线态氧的产率产量，从而巧妙地避免了光动力反应中单线态氧直接检测的诸多难题，实现了在不影响单线态氧产生的基础上，高灵敏地监测光动力剂量，进行精准治疗；提出了与光动力反应同步的耦合反馈式单线态氧精确检测的新途径，首次直接将单线态氧的产生和检测整合在同一个纳米探针上实现了一体化、直接耦合检测，直接反馈剂量信息；本发明利用上转换纳米材料的优异的光学特性，同步实现了基于近红外光的光敏剂激发和检测探针的荧光激发，产生的红色荧光也有利于携带的剂量信息高效穿透组织，该方法可提供治疗剂量的精确监测和高效控制。

本发明所采取的技术方案是：

用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置，包括计算机、数据采集卡、控制盒、近红外光激光器、光纤、准直器、扩束镜、ccd、滤光系统、采集镜头、跟踪驱动系统和三维电动平台，所述计算机与数据采集卡电连接，所述数据采集卡通过控制盒与近红外光激光器电连接，所述近红外激光器通过光纤与扩束镜光信号连接，所述光纤上设有准直器，所述数据采集卡通过ccd与采集镜头光信号连接，并且ccd位于采集镜头的成像交点处，所述ccd通过滤光系统与采集镜头光信号连接，所述数据采集卡通过跟踪驱动系统与三维电动平台电连接，所述扩束镜和采集镜头分别设于三维电动平台上，还包括设于三维电动平台一侧的样品台，并且所述样品台位于扩束镜和采集镜头的正下方。

本发明更进一步改进方案是，所述计算机为带有采集控制软件和图像分析重建软件以及电机控制软件的计算机。

本发明更进一步改进方案是，所述的采集控制软件和图像分析重建软件均为matlab软件；所述的电机控制软件为labview软件。

本发明更进一步改进方案是，所述三维电动平台包括前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台，所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机分别驱动。

本发明更进一步改进方案是，所述三维电动平台的前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台的各自移动最小步距均为10μm。

本发明更进一步改进方案是，所述跟踪驱动系统的最大跟踪工作范围为5cm。

本发明更进一步改进方案是，所述三维电动平台由装有电机控制软件的计算机控制实现伺服跟踪；每采集完一次光荧光信号，图像分析重建软件分析图像得出样品位置变动信息，并控制三维电动平台进行位置校正，图像分析重建软件利用比值计算出单线态氧数据后，将结果和设定的阈值相比较，比较结果转变为控制激光强度和照射时间的信号，输出至激光控制盒控制激光。

本发明更进一步改进方案是，所述近红外光激光器发出的激光为连续激光，功率在0~20w的范围内，波长在700nm~1000nm的范围内。

本发明更进一步改进方案是，所述扩束镜的透光波长在650～1050nm的范围内。

本发明更进一步改进方案是，所述滤光系统为693nm带通的滤光片。

利用如上所述的用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置进行检测的方法，包括以下步骤：

1）使用溶剂热法合成纳米粒子：将定量的稀土氧化物充分溶解后，置于烧瓶内除水除氧，在氩气保护下温控加热，并通过多次结晶技术形成核壳结构的近红外激发的上转换纳米粒子；

2）将双羧基聚乙二醇peg和不饱和磷脂分子用edc和nhs活化后，共价连接形成pl-peg-cooh，层析提纯待用；将光敏剂rosebengal和pl-peg-cooh的羧基分别用dec和nhs活化，再按照5:1的摩尔比例混合，然后和步骤1）中制备得到的纳米粒子混合孵育反应，离心去上清，三遍后用二氯甲烷溶解备用；靶向分子使用c(rgdyk)，pl-peg-cooh经dec和nhs活化后和rgd共价连接，层析提纯，将pl-peg-rgd加去离子水震荡溶解备用；称取一定量的探针分子hydro-ir-676，加少许二氯甲烷溶解，振摇至近澄清，将其与上述纳米粒子混合并超声，旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得胶体状悬液，离心三次去游离的探针分子后按比例加适量pl-peg-rgd和pl-peg去离子水溶液，震荡过夜，从而将步骤1）中制备得到的纳米粒子构建成纳米探针；

3）将步骤2）中所制备的纳米探针用pbs溶液溶解后放入1ml一次性培养皿中，盖好上盖后，在盖上做图形标记，将培养皿放在样品台上；

4）计算机通过控制盒使近红外光激光器发出激光，通过准直器和扩束镜调整激光光斑面积、以使激光光斑覆盖整个培养皿，调整采集镜头的位置，使培养皿在ccd上成像最清晰且处于中间位置；

5）近红外激光经上转换纳米粒子转换后，发出两种波长的可见光，短波长的可见光用于激发光敏效应，从而产生单线态氧，长波长的可见光用于激发检测探针的荧光；激光启动后，被照射纳米探针吸收的激光，经由上转换纳米粒子激发产生氧自由基分子检测分子和光敏剂分子，光敏剂分子在短波长的可见光照射下发生光动力效应从而产生单线态氧和氧自由基分子，氧自由基分子检测分子和氧自由基分子在长波长的可见光照射下发出荧光信号，荧光信号被同侧的采集镜头接收，然后通过滤光片滤除干扰光后被ccd接收，之后信号被数据采集卡采集，数据采集卡再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像分析重建软件的计算机中；

6）计算机利用图像分析重建软件对数据采集卡所采集的荧光信号数据进行成像，根据荧光强度、荧光变化率对所成的像的对应区域做统计学分析，得到平均值，并根据单线态氧和氧自由基的已知比率对相对应的部分做比值，由此可以定量出单线态氧产量和产量信息，通过图像特征分析获得样品移动信息；

7）获得的产量信息和预设的阈值比较，比较结果输出到控制激光功率的控制盒以控制激光输出功率；获得的移动信息，输出到跟踪驱动系统，控制三维电动平台跟踪样品的位置。

本发明更进一步改进方案是，所述步骤1）中，上转换纳米粒子经3-氨丙基三乙氧基硅烷处理后带氨基基团，电镜等检测控制平均粒径为50nm，光谱仪检测上转换光谱和发光量子效率。

本发明更进一步改进方案是，所述步骤2）中，整个操作过程避光操作。

本发明更进一步改进方案是，所述步骤5）中，光敏剂分子和氧自由基检测分子共定于纳米粒子表面，光敏反应产生的主产物：单线态氧用于治疗，副产物：氧自由基检测分子被直接捕获检测，以荧光形式报告产量信息。

本发明更进一步改进方案是，所述步骤6）中，计算机利用图像分析重建软件对数据采集卡所采集的荧光信号数据进行成像所采用的数据处理方法为最大值投影算法。

光动力过程中在光敏剂主要产生单线态氧的同时（ⅱ型反应），会通过电子转移产生一定比例的氧自由基（ⅰ型反应），如下:

3s*+rh→sh*+r*sh*+³o2→1s+o2•

3s*+rh→s*‐+rh*+s*‐+³o2→1s+o2•

（s光敏剂，³o2基态氧，o2•超氧阴离子，*激发态。）

因此，通过测量副产物氧自由基的量再根据其与单线态氧产量的比率关系反推，即可获得主要产物单线态氧的产出，该方法我们称之为替代比率法。替代比率法是一种非直接的检测方法，是一种影响小，又不失精确度的新的检测思路。另外，为避免检测和被检测分子二者定位差异的干扰，在光动力治疗过程中，活性氧（包括单线态氧和氧自由基）产生后，在其扩散和淬灭之前，立即由邻近的探针分子完成在位检测，实现活性氧产物的直接耦合检测，检测结果更加准确，实时。

在激光的激发下，氧自由基检测探针被氧化发出荧光，产物越多荧光越强，荧光信号经ccd检测后输至采集卡和电脑。

荧光变化率、强度检测可依据下式实现：

荧光变化率:

（1）

荧光强度:

（2）

其中t为时间，k为常数，c为与初始荧光有关的常数，c为探针浓度，iex为激发光强度，v为探测体积。荧光变化率为时间t1到t2间隔的平均近似，和单线态氧的产率相关。其中，与荧光强度相关的检测体积以及激发光强度均通过参数控制视为不变项。

本发明的有益效果在于：

第一、本发明的用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置及其检测方法，全新的纳米药物高效输运和肿瘤治疗及监测体系，为高精度、高效治疗肿瘤提供了一种可行性方案。

第二、本发明的用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置及其检测方法，提出了替代比率法检测单线态氧的新思路，通过选择性检测与单线态氧同步产生的氧自由基，利用其和单线态氧在产出上的比率关系，反推单线态氧的产率产量，从而巧妙地避免了光动力反应中单线态氧直接检测的诸多难题，实现了在不影响单线态氧产生的基础上，高灵敏地监测光动力剂量，进行精准治疗。

第三、本发明的用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置及其检测方法，提出了与光动力反应同步的耦合反馈式单线态氧精确检测的新途径，首次直接将单线态氧的产生和检测整合在同一个纳米探针上实现了一体化、直接耦合检测，直接反馈剂量信息。

第四、本发明的用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置及其检测方法，本发明利用上转换纳米材料的优异的光学特性，同步实现了基于近红外光的光敏剂激发和检测探针的荧光激发，产生的红色荧光也有利于携带的剂量信息高效穿透组织，该方法可提供治疗剂量的精确监测和高效控制。

附图说明：

图1为本发明检测装置结构的示意图。

图2为本发明中纳米探针及其构建纳米粒子构建示意图。

图3为实施例1中样品检测反应之后1min和10min的荧光图像。

具体实施方式：

如图1可知，本发明包括计算机1、数据采集卡2、控制盒3、近红外光激光器4、光纤5、准直器6、扩束镜7、ccd8、滤光系统、采集镜头10、跟踪驱动系统11和三维电动平台12，所述计算机1与数据采集卡2电连接，所述数据采集卡2通过控制盒3与近红外光激光器4电连接，所述近红外激光器4通过光纤5与扩束镜7光信号连接，所述光纤5上设有准直器6，所述数据采集卡通过ccd8与采集镜头10光信号连接，并且ccd8位于采集镜头10的成像交点处，所述ccd通过滤光系统与采集镜头10光信号连接，所述数据采集卡2通过跟踪驱动系统11与三维电动平台12电连接，所述扩束镜7和采集镜头10分别设于三维电动平台12上，还包括设于三维电动平台12一侧的样品台13，并且所述样品台13位于扩束镜7和采集镜头10的正下方。

所述计算机1为带有采集控制软件和图像分析重建软件以及电机控制软件的计算机。

所述的采集控制软件和图像分析重建软件均为matlab软件；所述的电机控制软件为labview软件。

所述三维电动平台12包括前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台，所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机分别驱动。

所述三维电动平台12的前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台的各自移动最小步距均为10μm。

所述跟踪驱动系统11的最大跟踪工作范围为5cm。

所述三维电动平台12由装有电机控制软件的计算机1控制实现伺服跟踪；每采集完一次光荧光信号，图像分析重建软件分析图像得出样品位置变动信息，并控制三维电动平台12进行位置校正，图像分析重建软件利用比值计算出单线态氧数据后，将结果和设定的阈值相比较，比较结果转变为控制激光强度和照射时间的信号，输出至激光控制盒控制激光。

所述近红外光激光器4发出的激光为连续激光，功率在0~20w的范围内，波长在700nm~1000nm的范围内。

所述扩束镜7的透光波长在650～1050nm的范围内。

所述滤光系统为693nm带通的滤光片9。

如图2可知，利用如上所述的用于光动力反应活性氧的替代比率式耦合检测装置进行检测的方法，包括以下步骤：

1）使用溶剂热法合成纳米粒子：将定量的稀土氧化物充分溶解后，置于烧瓶内除水除氧，在氩气保护下温控加热，并通过多次结晶技术形成核壳结构的近红外激发的上转换纳米粒子；

2）将双羧基聚乙二醇peg和不饱和磷脂分子用edc和nhs活化后，共价连接形成pl-peg-cooh，层析提纯待用；将光敏剂rosebengal和pl-peg-cooh的羧基分别用dec和nhs活化，再按照5:1的摩尔比例混合，然后和步骤1）中制备得到的纳米粒子混合孵育反应，离心去上清，三遍后用二氯甲烷溶解备用；靶向分子使用c(rgdyk)，pl-peg-cooh经dec和nhs活化后和rgd共价连接，层析提纯，将pl-peg-rgd加去离子水震荡溶解备用；称取一定量的探针分子hydro-ir-676，加少许二氯甲烷溶解，振摇至近澄清，将其与上述纳米粒子混合并超声，旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得胶体状悬液，离心三次去游离的探针分子后按比例加适量pl-peg-rgd和pl-peg去离子水溶液，震荡过夜，从而将步骤1）中制备得到的纳米粒子构建成纳米探针；

3）将步骤2）中所制备的纳米探针用pbs溶液溶解后放入1ml一次性培养皿中，盖好上盖后，在盖上做图形标记，将培养皿放在样品台上；

4）计算机1通过控制盒2使近红外光激光器4发出激光，通过准直器6和扩束镜7调整激光光斑面积、以使激光光斑覆盖整个培养皿，调整采集镜头10的位置，使培养皿在ccd8上成像最清晰且处于中间位置；

5）近红外激光经上转换纳米粒子转换后，发出两种波长的可见光，短波长的可见光用于激发光敏效应，从而产生单线态氧，长波长的可见光用于激发检测探针的荧光；激光启动后，被照射纳米探针吸收的激光，经由上转换纳米粒子激发产生氧自由基分子检测分子和光敏剂分子，光敏剂分子在短波长的可见光照射下发生光动力效应从而产生单线态氧和氧自由基分子，氧自由基分子检测分子和氧自由基分子在长波长的可见光照射下发出荧光信号，荧光信号被同侧的采集镜头10接收，然后通过滤光片9滤除干扰光后被ccd8接收，之后信号被数据采集卡2采集，数据采集卡2再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像分析重建软件的计算机1中；

6）计算机1利用图像分析重建软件对数据采集卡2所采集的荧光信号数据进行成像，根据荧光强度、荧光变化率对所成的像的对应区域做统计学分析，得到平均值，并根据单线态氧和氧自由基的已知比率对相对应的部分做比值，由此可以定量出单线态氧产量和产量信息，通过图像特征分析获得样品移动信息；

7）获得的产量信息和预设的阈值比较，比较结果输出到控制激光功率的控制盒3以控制激光输出功率；获得的移动信息，输出到跟踪驱动系统11，控制三维电动平台12跟踪样品的位置。

所述步骤1）中，上转换纳米粒子经3-氨丙基三乙氧基硅烷处理后带氨基基团，电镜等检测控制平均粒径为50nm，光谱仪检测上转换光谱和发光量子效率。

所述步骤2）中，整个操作过程避光操作。

所述步骤5）中，光敏剂分子和氧自由基检测分子共定于纳米粒子表面，光敏反应产生的主产物：单线态氧用于治疗，副产物：氧自由基检测分子被直接捕获检测，以荧光形式报告产量信息。

所述步骤6）中，计算机1利用图像分析重建软件对数据采集卡2所采集的荧光信号数据进行成像所采用的数据处理方法为最大值投影算法。

实施例1

本发明包括计算机1、数据采集卡2、控制盒3、近红外光激光器4、光纤5、准直器6、扩束镜7、ccd8、滤光系统、采集镜头10、跟踪驱动系统11和三维电动平台12，所述计算机1与数据采集卡2电连接，所述数据采集卡2通过控制盒3与近红外光激光器4电连接，所述近红外激光器4通过光纤5与扩束镜7光信号连接，所述光纤5上设有准直器6，所述数据采集卡通过ccd8与采集镜头10光信号连接，并且ccd8位于采集镜头10的成像交点处，所述ccd通过滤光系统与采集镜头10光信号连接，所述数据采集卡2通过跟踪驱动系统11与三维电动平台12电连接，所述扩束镜7、ccd8和滤光系统和采集镜头10分别设于三维电动平台12上，还包括设于三维电动平台12一侧的样品台13，并且所述样品台13位于扩束镜7和采集镜头10的正下方。

所述计算机1为带有采集控制软件和图像分析重建软件以及电机控制软件的计算机。

所述的采集控制软件和图像分析重建软件均为matlab软件；所述的电机控制软件为labview软件。

所述的数据采集卡2的型号为ni公司生产的pci2400。

所述的光纤5为激光功率光纤，数值孔径为0.22、光纤接头为sma905，光纤芯径为200μm。

所述的纳米探针为50nm的负载有光敏剂和氧自由基检测剂的上转换纳米粒子。

所述的ccd8为可见光ccd。

所述三维电动平台12包括前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台，所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机分别驱动。

所述三维电动平台12的前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台的各自移动最小步距均为10μm。

所述跟踪驱动系统11为三维光电跟踪系统，最大跟踪工作范围为5cm，最小分辨率为横向为1mm，纵向为2mm。

所述三维电动平台12由装有电机控制软件的计算机1控制实现伺服跟踪；每采集完一次光荧光信号，图像分析重建软件分析图像得出样品位置变动信息，并控制三维电动平台12进行位置校正，图像分析重建软件利用比值计算出单线态氧数据后，将结果和设定的阈值相比较，比较结果转变为控制激光强度和照射时间的信号，输出至激光控制盒控制激光。

所述近红外光激光器4发出的激光为连续激光，功率在0~20w的范围内，波长在700nm~1000nm的范围内。

所述扩束镜7的焦距为4.6mm，透光波长在650～1050nm的范围内。

所述滤光系统为693nm带通的滤光片9。

合成上转换纳米粒子

使用溶剂热法合成纳米粒子。将定量的稀土氧化物充分溶解后，置于烧瓶内除水除氧，在氩气保护下温控加热，最后通过多次结晶技术形成核壳结构的980nm近红外激发的上转换纳米粒子。纳米粒子(nayf4:yb,er@nayf4:yb)特征为：980nm光激发，可见光发射；经3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes）处理后带氨基基团。电镜等检测控制平均粒径在50nm，光谱仪检测上转换光谱和发光量子效率。

光敏纳米探针构建：

将双羧基聚乙二醇peg（2000）和不饱和磷脂（1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，c52h80no8p）分子用edc和nhs活化后，共价连接形成pl-peg-cooh,层析提纯待用。将光敏剂rosebengal和pl-peg-cooh的羧基分别用dec和nhs活化，再按照5:1的摩尔比例混合，然后和纳米粒子混合孵育反应，离心去上清，三遍后用二氯甲烷溶解备用。靶向分子使用c(rgdyk)，pl-peg-cooh经dec和nhs活化后和rgd共价连接，层析提纯，将pl-peg-rgd加去离子水震荡溶解备用。称取一定量的探针分子hydro-ir-676，加少许二氯甲烷溶解，振摇至近澄清，将其与上述纳米粒子混合并超声，旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得胶体状悬液，离心三次去游离的探针分子后按比例加适量pl-peg-rgd和pl-peg去离子水溶液，震荡过夜。操作过程中注意避光。所得到的检测探针为hydro-ir-676氧自由基荧光探针；所述的样品为活体生物组织，测量目标为光动力反应的剂量。

然后将所制备的hydro-ir-676氧自由基荧光探针用pbs溶液溶解后放入1ml一次性培养皿中，盖好上盖后，在盖上做图形标记，将培养皿放在样品台上；计算机1通过控制盒2使近红外光激光器4发出980nm的激光，通过准直器6和扩束镜7调整激光光斑面积、以使激光光斑覆盖整个培养皿，调整采集镜头10的位置，使培养皿在ccd8上成像最清晰且处于中间位置；接着上转换纳米粒子，能够被980nm或800nm近红外激光激发发出545nm和654nm波长的可见光，短波长的可见光用于激发光敏效应，从而产生单线态氧，长波长的可见光用于激发检测探针的荧光；激光启动后，被照射纳米探针吸收的激光，经由上转换纳米粒子激发产生氧自由基分子检测分子和光敏剂分子，光敏剂分子在短波长的可见光照射下发生光动力效应从而产生单线态氧和氧自由基分子，氧自由基分子检测分子和氧自由基分子在长波长的可见光照射下发出荧光信号，荧光信号被同侧的采集镜头10接收，然后通过滤光片9滤除干扰光后被ccd8接收，之后信号被数据采集卡2采集，数据采集卡2再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像分析重建软件的计算机1中；之后，计算机1利用图像分析重建软件对数据采集卡2所采集的荧光信号数据进行成像，根据荧光强度、荧光变化率对所成的像的对应区域做统计学分析，得到平均值，并根据单线态氧和氧自由基的已知比率对相对应的部分做比值，由此可以定量出单线态氧产量和产量信息，通过图像特征分析获得样品移动信息；再将获得的产量信息和预设的阈值比较，比较结果输出到控制激光功率的控制盒3以控制激光输出功率；获得的移动信息，输出到跟踪驱动系统11，控制三维电动平台12跟踪样品的位置。

如图3可知，反应10min后的荧光亮度明显强于反应1min后的荧光强度。因此论证了可以通过本发明检测出氧自由基分子产量的不同，从而可以得出单线态氧的对应产量的变化。实际应用的时候，可以进行多次不同量的定量实验，从而标定不同荧光光亮度代表的氧自由基分子的产量值，及各自对应单线态氧的产量，然后在实际检测过程中通过被检测样品的荧光强度与各标定的荧光强度进行比对，从而得出实际检测的样品中的单线态氧的产量，进而可以得出其治疗效果，为高精度、高效治疗肿瘤提供了一种可行性方案。