一种星状环糊精的荧光传感器快速检测微生物的制作方法

一种基于星状季铵盐化环糊精与荧光蛋白形成复合体阵列检测和微生物膜并响应微生物膜对抗生素的抗菌机制。

背景技术：

微生物生物膜是由微生物群体及其包被的细胞外多聚物和基质网组成，它们彼此黏附或者黏附到组织或物体的表面。最近的研究发现高达60%手术后导致的疾病都是手术器材微生物感染导致。微生物生物膜与微生物的耐药性形成、基因的转移以及引起机体的持续性感染等都密切相关。当前常用的对微生物膜进行检测的方法包括基于培养方法、血液分析、显微镜观察、组织切片观察、探针成像、免疫诊断分析和分子检测。培养分析方法能够准确阐明临床相关疾病确实是微生物膜感染导致，这种方法存在的不足之处是需要时间长，一般3-5天才能获得分析结果（rogers,g.b.,carroll,m.p.,bruce,k.d.,2009.journalofmedicalmicrobiology58(pt11),1401-1418.）。血液分析通常是分析血液中验证因子，但是这种方法没有特异性（mathur,t.,singhal,s.,khan,s.,upadhyay,d.j.,fatma,t.,rattan,a.,2006.indianjournalofmedicalmicrobiology24(1),25-29）。最近相关成像技术也被用于微生物活体诊断，比如核磁共振成像、超声波、内窥镜、计算机断层扫描等（temple,c.l.,ross,d.c.,bennett,j.d.,garvin,g.j.,king,g.j.,faber,k.j.,2005.thejournalofhandsurgery30(3),534-542.）,但是这些方法的成本非常高。酶链免疫反应可以快速诊断微生物膜，但是其抗体稳定性不好，很容易失活（hall-stoodley,l.,stoodley,p.,kathju,s.,høiby,n.,moser,c.,williamcosterton,j.,moter,a.,bjarnsholt,t.,2012.femsimmunology&medicalmicrobiology65(2),127-145.）。

基于纳米材料阵列响应来快速诊断微生物得到了响应的关注。比如利用纳米金与带负电荧光聚合物可以选择性检测微生物（phillips,r.l.,miranda,o.r.,you,c.-c.,rotello,v.m.,bunz,u.h.f.,2008.angewandtechemieinternationaledition47(14),2590-2594.）。我们也前期设计了磁性颗粒与带负电荧光聚合物来选择性检测微生物（wan,y.,sun,y.,qi,p.,wang,p.,zhang,d.,2014.biosensorsandbioelectronics55,289-293）。本方案则采用基于星状环糊精与荧光蛋白的阵列响应来检测微生物膜，并使其来筛选微生物的抗生素的抗菌机制。

技术实现要素：

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种星状环糊精的荧光传感器快速检测微生物，其特征包括季铵盐化的环糊精和荧光蛋白。

如权利1中所示季铵盐化的环糊精，包括：苯基官能团的季铵盐化环糊精，正己烷官能团的季铵盐化环糊精，二茂铁基官能团的季铵盐化环糊精，辛烷基官能团的季铵盐化环糊精，和甲基官能团的季铵盐化环糊精。

如权利2所示的环糊精，包括：-环糊精，-环糊精和-环糊精。

如权利1所示的荧光蛋白，包括：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白。

如权利1所示的抗生素抗菌性能评估，抗生素包括：青霉素类，头孢菌素类，碳青酶烯类，氨基糖苷类，四环素类，大环内酯类，糖肽类，磺胺类，喹诺酮类。

如权利5所示的青霉素类，包括：青霉素、青霉素v、阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林钠、氯唑西林、普鲁卡因青霉素、苄星青霉素、哌拉西林、美洛西林、替卡西林、阿洛西林钠、美西林、羧苄西林、磺苄西林、呋布西林钠、萘夫西林钠、双氯西林、匹氨西林、阿帕西林、阿扑西林、匹美西林、甲氧西林、仑氨西林、福米西林、氟氯西林。

如权利5所示的头孢菌素类，包括：头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克肟、头孢泊肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢磺啶、头孢唑喃、头孢唑肟、头孢咪唑、头孢他美酯、头孢特伦酯、头孢布坦、头孢地尼、头孢匹胺。

如权利5所示的碳青酶烯类，包括：硫霉素、亚胺培南/西司他丁钠、美罗培南、帕尼培南、厄他培南。

如权利5所示的氨基糖苷类，包括：链霉素、卡那霉素、阿米卡星、核糖霉素、妥布霉素、庆大霉素、西索米星、奈替米星、小诺米星、异帕米星、阿司米星、依替米星、大观霉素、地贝卡星、巴龙霉素、新霉素。

如权利5所示的四环素类，包括：四环素、土霉素、多西环素、米诺环素、金霉素、胍甲环素、地美环素、美他环素。

附图说明

图1星状季铵盐化环糊精与荧光蛋白形成复合体阵列检测微生物膜示意图。

图2星状季铵盐化环糊精与荧光蛋白形成复合体阵列检测八种不同微生物。

图3星状季铵盐化环糊精与荧光蛋白形成复合体阵列检测抗生素机制（利用爱德华弧菌生物膜作为来源）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

纳米传感器构建：浓度分别为（100nm）的绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白与星状季铵盐的环糊精进行滴定反应，直到三种荧光强度减少到最低值。既可以获得星状季铵盐化环糊精与荧光蛋白形成复合体。

实施例2：

大肠杆菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定大肠杆菌的种类。

实施例3：

沙门杆菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定沙门杆菌的种类。

实施例4：

金黄色葡萄球菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定金黄色葡萄球菌的种类。

实施例5：

铜绿假单胞菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定铜绿假单胞菌的种类。

实施例6：

爱德华弧菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定爱德华弧菌的种类。

实施例7：

链球菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定链球菌的种类。

实施例8：

大肠杆菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。再加入微生物膜半死亡浓度的青霉素，培育24小时，微孔板清洗三次。加入往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定抗生素的种类。

实施例9：

大肠杆菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。再加入微生物膜半死亡浓度的头孢菌素，培育24小时，微孔板清洗三次。加入往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定抗生素的种类。

实施例10：

大肠杆菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。再加入微生物膜半死亡浓度的四环素，培育24小时，微孔板清洗三次。加入往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定抗生素的种类。

实施例11：

金黄色葡萄球菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。再加入微生物膜半死亡浓度的万古霉素，培育24小时，微孔板清洗三次。加入往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定抗生素的种类。

实施例12：

大肠杆菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。再加入微生物膜半死亡浓度的多粘菌素b，培育24小时，微孔板清洗三次。加入往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定抗生素的种类。

实施例13：

金黄色葡萄球菌在lb培养基中37度培养12小时，再用离心机清洗三次。在600nm处测量悬浮的微生物浓度，加入培养基进行培养。培养中加入0.1%葡萄糖、1mm硫酸镁和0.15m硫酸铵及34mm柠檬酸，并调整到ph=7，加入微孔板。培养板在室温下培养3天，其中第二天去除悬浮的菌液，加入新鲜的培养基。等到第三次去除菌液并用pbs冲洗三次。再加入微生物膜半死亡浓度的替考拉宁，培育24小时，微孔板清洗三次。加入往每孔中加入200μl的纳米传感器复合体，培育15分钟，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析既可以确定抗生素的种类。