酶电极和使用了该酶电极的生物传感器的制作方法
本发明涉及在电极表面固定有酶的酶电极、和使用了该酶电极的用于计测葡萄糖的电化学生物传感器。
背景技术：
在生物传感器中使用的酶电极具有从电极提取出通过酶反应生成的电子的结构，一般而言，包括电极、和利用交联剂或粘结剂在电极的表面固定有酶和导电性颗粒的检测层。在专利文献1中记载了一种酶电极，其包括电极和检测层，该检测层具有酶、导电性颗粒、以及与该酶和该导电性颗粒中的至少一者形成酰胺键或酯键的高分子。
另一方面，为了高效地进行酶与集电体(电极)之间的电子转移，在非专利文献1中公开了使用形成自组装单分子膜(sam：selfassembledmonolayer)的分子的方法，具体而言，例示了藉由形成sam的分子将hrp(horseraddishperoxydase，辣根过氧化物酶)等酶固定于集电体表面的方法。但是，就藉由sam形成分子通过吸附等来固定酶的方法而言，迄今为止在作为葡萄糖测定用生物传感器中使用最多的酶之一的葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase)方面尚未报道过成功案例。作为其理由，考虑如下：一般的葡萄糖脱氢酶的催化部位位于酶中心部，即使固定于电极附近，也难以对集电体产生电子传递，特别是在利用随机的吸附等将酶固定时，无法控制集电体与酶的距离；等等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2014-6154号公报
非专利文献
非专利文献1：j.braz.chem.soc.vol.14,no.2,230-243,2003
技术实现要素：
发明所要解决的课题
在专利文献1中记载的方法中，作为粘结剂，使用了含有噁唑啉基的高分子聚合物，但酶与集电体(电极)的距离未得到控制，各个酶具有偏差，因此存在实际得到的响应值比由固定酶量所期待的响应值小的课题。
因此，本发明的课题在于提供一种用于测定葡萄糖浓度的酶电极，该酶电极的酶与集电体的距离得到控制，能够以高灵敏度且定量地测定葡萄糖浓度。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明提供一种酶电极，其特征在于，
包括：
包含集电体的电极；
结合于该集电体表面的形成单分子膜的分子；和
与该分子结合的包含细胞色素c亚基的葡萄糖脱氢酶，
通过上述葡萄糖脱氢酶的氧化还原反应，在葡萄糖脱氢酶与集电体间进行电子转移。
上述单分子膜是分子排列成一层而形成的膜，包含细胞色素c亚基的葡萄糖脱氢酶是至少由催化亚基和作为电子传递亚基的包含细胞色素的亚基构成的低聚物酶，上述催化亚基是具有催化底物反应的功能的亚基，上述电子传递亚基是具有将电子传递到电子受体的功能的亚基。上述酶电极为“直接电子传递型的酶电极”，通过酶反应生成的电子在没有电子传递介质这样的氧化还原物质参与的情况下直接被传递至电极，由此在酶与电极间进行电子转移。
另外，本发明提供一种生物传感器，其具备上述酶电极。
另外，本发明提供一种测定装置，其由下述部分构成：
上述生物传感器；
控制部，控制向生物传感器的电压施加；
检测部，检测通过向生物传感器的电压施加而得到的、基于来自底物的电子向电极的移动而产生的电荷转移控速电流；
运算部，由上述电流值计算出底物的浓度；和
输出部，输出上述计算出的底物的浓度。
发明的效果
根据本发明的一个方式，藉由长度得到控制的形成单分子膜的分子，利用该分子的反应性基团与酶的特定的氨基酸残基的共价键，能够将酶与集电体固定。因此，在接近酶的活性中心的部分，被固定的酶的量相对增加。由此，与利用随机的吸附所进行的酶固定相比，可提供酶与集电体的距离得到进一步控制的酶电极。因此，酶与集电体间的电子转移效率得到改善，能够提高酶电极的响应电流值，能够以高灵敏度且定量地测定葡萄糖浓度。上述效果在催化部位位于酶中心部这样的包含细胞色素c亚基的葡萄糖脱氢酶的情况下特别显著。
附图说明
图1是示意性地示出一个实施方式的酶电极的结构的图。
图2是示出本发明的测定装置的一个方式的示意图。
图3是示出使用了本发明的测定装置的测定程序的一个方式的流程图。
图4是示出使用了利用dsh作为单分子膜形成分子将酶固定的本发明的一个方式的酶电极(电极材料：金)时的葡萄糖浓度与响应电流的关系的曲线图。
图5是示出使用了利用dsh作为单分子膜形成分子将酶固定的本发明的一个方式的酶电极(电极材料：金)或无dsh而直接吸附了酶的的酶电极(电极材料：金)时(施加电压+400mv)的葡萄糖浓度与响应电流的关系的曲线图。需要说明的是，裸电极是使酶吸附在未进行食人鱼溶液处理的电极上而得到的电极的测定结果。
图6是示出使用了利用dsh、dso或dsu作为单分子膜形成分子将酶固定的本发明的一个方式的酶电极(电极材料：金)时的葡萄糖浓度与响应电流的关系的曲线图。
图7是示出使用了利用dsh作为单分子膜形成分子将酶固定的本发明的一个方式的酶电极(电极材料：金)时的含有对乙酰氨基酚(a)或抗坏血酸(b)的试样中的施加电压与响应电流的关系的曲线图。
图8是示出使用了利用dsh作为单分子膜形成分子将酶固定的本发明的一个方式的酶电极(电极材料：金)或无dsh而直接吸附了酶的酶电极(电极材料：金)时的(施加电压+100mv)葡萄糖浓度与响应电流的关系的图。
图9是示出使用了利用dsh作为单分子膜形成分子将酶固定的本发明的一个方式的酶电极(电极材料：金)时的(施加电压+0.1v)、对乙酰氨基酚存在下或不存在下的葡萄糖浓度与响应电流的关系的图。需要说明的是，裸电极是使酶吸附在未进行食人鱼溶液处理的电极上而得到的电极的测定结果。
图10是示出使用了利用dsh作为单分子膜形成分子将酶固定的本发明的一个方式的酶电极(电极材料：金)时的(施加电压+0.1v)、抗坏血酸存在下或不存在下的葡萄糖浓度与响应电流的关系的图。需要说明的是，裸电极是使酶吸附在未进行食人鱼溶液处理的电极上而得到的电极的测定结果。
图11是示出使用了利用dsh、dso或dsu作为单分子膜形成分子将酶固定的本发明的一个方式的酶电极(电极材料：金)时的含有对乙酰氨基酚(a)或抗坏血酸(b)的试样中的施加电压与响应电流的关系的曲线图。
具体实施方式
下面，参照附图对作为本发明的一个实施方式的酶电极进行说明。以下列举的实施方式分别为例示，本发明并不限定于以下的实施方式的构成。
(酶电极的构成)
图1是示意性地示出本发明的实施方式的酶电极的图。图1中，酶电极a包括绝缘性基板4、电极(集电体)1、和藉由单分子膜形成分子2固定于电极1的表面(图1中为上表面)的酶(包含细胞色素c亚基的葡萄糖脱氢酶)3。其中，绝缘性基板4不是必需的。
(电极)
电极1使用作为集电体的金(au)、铂(pt)、银(ag)和钯(pd)之类的金属材料、或者以石墨、碳纳米管、石墨烯、介孔碳等碳为代表的碳材料而形成。电极1例如形成于图1所示的绝缘性基板4上。绝缘性基板4由聚醚酰亚胺(pei)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚乙烯(pe)之类的热塑性树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂之类的各种树脂(塑料)、玻璃、陶瓷、纸之类的绝缘性材料形成。电极1和绝缘性基板4的尺寸、厚度可以适当设定。
(测定电流)
使用本发明的酶电极所测定的不是依赖于物质扩散的电流(扩散控速电流)，而是基于来自测定对象物质(底物)的电子向电极的移动而产生的电荷转移控速电流。这是通过酶与测定对象物质的反应、在电子从该酶向电极移动时产生的电流。
为了测定基于来自测定对象物质的电子向电极的移动而产生的电荷转移控速电流，优选使工作电极为“直接电子转移型的酶电极”。此处，“直接电子转移型的酶电极”是指下述类型的酶电极：在试剂层中通过酶反应生成的电子在没有电子传递介质这样的氧化还原物质参与的情况下直接被传递至电极，由此进行酶与电极间的电子转移。
如图1所示，酶3的分子藉由单分子膜形成分子2被固定于电极1上，因此通过酶反应而生成的电子能够直接移动至电极1。即，在本发明的实施方式的酶电极a中，通过直接电子转移在酶3与电极1之间进行电子转移。
(单分子膜形成分子)
单分子膜形成分子是能够与上述集电体结合、并且能够结合酶分子的化合物，是通过以一定方向多数地结合于集电体表面而能够形成单分子膜的化合物。优选具有：与集电体具有亲和性的第一官能团；间隔物部位；和能够与酶分子所具有的官能团反应的第二官能团。更优选具有下述结构：在间隔物部位的第一端结合有与集电体具有亲和性的第一官能团，在间隔物部位的第二端结合有能够与酶分子所具有的官能团反应的第二官能团。
与集电体具有亲和性的第一官能团根据集电体的种类适当选择。
单分子膜形成分子与集电体表面的结合方式可以举出共价键、配位键、离子键等化学性结合、或基于范德华力等的物理性结合，优选共价键或配位键。作为上述能够与集电体结合的第一官能团，在集电体为金属的情况下，可以举出硫醇基或二硫醇基。另一方面，在集电体为碳的情况下，可以举出卟啉。
作为能够与酶分子所具有的官能团反应的第二官能团，根据酶分子所具有的官能团的种类适当选择。例如，在与酶分子所具有的氨基(包括末端氨基和侧链氨基)反应的情况下，可以举出琥珀酰亚胺基，该情况下，单分子膜形成分子的第二端为琥珀酰亚胺基与氨基的反应残基。另一方面，在与酶分子所具有的羧基(包括末端羧基和侧链羧基)反应的情况下，可以举出噁唑啉基，该情况下，单分子膜形成分子的第二端为噁唑啉基与羧基的反应残基。因此，通过酶与第二官能团的反应，能够利用共价键将酶固定于单分子膜形成分子。
关于间隔物的长度，为了使酶电极为“直接电子转移型的酶电极”，优选为能够将酶分子与电极(集电体)表面的距离保持为一定以内的距离的长度。需要说明的是，在生理学反应体系中发生直接电子转移的极限距离据称为
例如，作为具有硫醇基或二硫醇基的单分子膜形成分子，可以例示具有下述结构的化合物。它们是形成sam的化合物。
需要说明的是，l为间隔物，x为能够与酶分子所具有的官能团反应的官能团。
sh-l-x···(1)
x-l-s-s-l-x···(2)
作为这样的化合物，可以例示以下的dsh等。
另外，也可以使用表1中记载的dso(二硫代双(辛酸琥珀酰亚胺酯))、dsu(二硫代双(十一酸琥珀酰亚胺酯))。
在这样的具有二硫醇的单分子膜形成分子的情况下，每1分子能够结合2分子的酶分子。
例如，作为具有卟啉的单分子膜形成分子，可以例示具有下述结构的化合物。
需要说明的是，po为卟啉，l为间隔物，x为能够与酶分子所具有的官能团反应的官能团。
po-l-x···(3)
(酶)
作为酶3，使用包含细胞色素c亚基的葡萄糖脱氢酶(gdh)。包含细胞色素c亚基的gdh优选应用至少由催化亚基和作为电子传递亚基的包含细胞色素的亚基构成的低聚物酶。上述催化亚基是具有催化底物反应的功能的亚基，上述电子传递亚基是具有将电子传递到电子受体的功能的亚基。
gdh的催化亚基和催化结构域可以包含吡咯喹啉醌(pqq)、黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)中的至少一种。例如，作为包含pqq的gdh，可以举出pqq葡萄糖脱氢酶(pqqgdh)，作为包含fad的gdh，可以举出具有包含fad的α亚基的细胞色素葡萄糖脱氢酶。pqq葡萄糖脱氢酶(pqqgdh)例如可以使用根癌农杆菌(agrobacteriumtumefasience)来源的葡萄糖-3-脱氢酶(g3dhfromagrobacteriumtumefasience)、或pqqgdh与细胞色素的融合蛋白。pqqgdh与细胞色素的融合蛋白例如公开于国际公开wo2005/030807号公报中。
作为包含fad的gdh，可以举出洋葱伯克氏菌(burkholderiacepacia)来源的fad依赖性葡萄糖脱氢酶或其突变体。作为洋葱伯克氏菌来源的fad依赖性葡萄糖脱氢酶的突变体，可以举出472位和475位的氨基酸残基被置换的突变体(wo2005/103248)；326位、365位和472位的氨基酸残基被置换的突变体(日本特开2012-090563)；365位和326、472、475以及529位等被置换的突变体(wo2006/137283)等。
需要说明的是，包含酶的检测层的表面可以被醋酸纤维素之类的外层膜所被覆。作为外层膜的原料，除此以外还可以举出聚氨酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯、聚醚醚酮等。
(酶电极的制作方法)
上述酶电极a例如如下制作。即，在绝缘性基板4的单面上形成作为电极1发挥功能的金属层。例如，在规定厚度(例如100μm左右)的膜状的绝缘性基板4的单面，通过物理蒸镀(pvd、例如溅射)或化学蒸镀(cvd)将金属材料成膜，由此形成具有所期望的厚度(例如30nm左右)的金属层。也可以形成由碳材料形成的电极层来代替金属层。
接着，使单分子膜形成分子2结合于电极1上。然后，使单分子膜形成分子的反应性官能团与酶3的氨基或羧基反应，从而能够藉由单分子膜形成分子将酶3固定于电极1上。
通过使用本发明的酶电极，能够基于电荷转移控速电流来测定试样中所含有的测定对象物质(葡萄糖)的浓度。试样只要是含有测定对象物质的试样就没有特别限制，优选生物体试样，可以举出血液、尿等。
(生物传感器)
本发明的酶电极可以用于作为葡萄糖传感器的生物传感器。生物传感器在包括本发明的酶电极的同时还包括作为反电极的电极。作为反电极，只要是通常能够用作生物传感器的反电极的电极即可，例如，可以使用通过丝网印刷而成膜的碳电极、通过物理蒸镀(pvd、例如溅射)或化学蒸镀(cvd)而成膜的金属电极、通过丝网印刷而成膜的银/氯化银电极。另外，也可以使用将银/氯化银电极、通过丝网印刷而成膜的碳电极、通过物理蒸镀(pvd、例如溅射)或化学蒸镀(cvd)而成膜的金属电极作为参比电极的3电极系统。
(装置)
接着，利用附图对本发明的测定装置进行说明。此处，对葡萄糖测定装置的一个方式进行了例示，但本发明的测定装置不限定于以下的方式。
图2示出了容纳在测定装置b内的主要电子部件的构成例。控制计算机18、恒电位仪19、电力供给装置11设置在容纳于壳体内的基板20上。
控制计算机18在硬件上包含cpu(中央运算处理装置)之类的处理器、存储器(ram(randomaccessmemory，随机存取存储器)、rom(readonlymemory，只读存储器))之类的记录介质和通信单元，处理器将存储在记录介质(例如rom)中的程序加载至ram并运行，由此，作为具备输出部10、控制部12、运算部13和检测部14的装置发挥功能。需要说明的是，控制计算机18也可以包含半导体存储器(eeprom，闪存)或硬盘之类的辅助存储装置。
控制部12对电压施加的时机、施加电压值等进行控制。
电力供给装置11具有电池16，向控制部计算机18、恒电位仪19供给工作用的电力。需要说明的是，电力供给装置11也可以设置在壳体的外部。
恒电位仪19是使工作电极的电位相对于参比电极保持恒定的装置，由控制部12进行控制，使用端子cr、w在葡萄糖传感器17的反电极和工作电极之间施加规定的电压，对在端子w中得到的工作电极的响应电流进行测定，将响应电流的测定结果送到检测部14。
运算部13由检测出的电流值进行测定对象物质的浓度的运算，并进行存储。输出部10与显示部单元15之间进行数据通信，将由运算部13得到的测定对象物质的浓度的运算结果发送到显示部单元15。显示部单元15例如可以将由测定装置b接收到的葡萄糖浓度的运算结果以规定格式显示在显示屏幕上。
图3是示出利用控制计算机18进行的葡萄糖浓度测定处理的示例的流程图。控制计算机18的cpu(控制部12)受理葡萄糖浓度测定开始指示时，控制部12控制恒电位仪19，对工作电极施加规定的电压(例如，对银/氯化银电极，施加+100～500mv、+100～400mv或+100～200mv)，开始对来自工作电极的响应电流进行测定(步骤s01)。需要说明的是，也可以将检测到传感器向测定装置上的安装作为浓度测定开始指示。
接着，恒电位仪19测定通过电压施加而得到的响应电流、即基于来自试样内的测定对象物质(葡萄糖)的电子向电极的移动而产生的电荷转移控速电流、例如电压施加后1～20秒后的稳态电流，并送到检测部14(步骤s02)。
运算部13基于电流值进行运算处理，计算出葡萄糖浓度(步骤s03)。例如，控制计算机3的运算部13预先保存有与配置于电极上的葡萄糖脱氢酶对应的葡萄糖浓度的计算式或葡萄糖浓度的校准曲线数据，使用这些计算式或校准曲线计算出葡萄糖浓度。
输出部10通过其与显示部单元15之间形成的通信链路将葡萄糖浓度的计算结果发送到显示部单元15(步骤s04)。之后，控制部12对测定错误的有无进行检测(步骤s05)，若没有错误则结束测定，将葡萄糖浓度显示于显示部。若有错误，则在进行错误显示后，结束基于图3的流程的处理。另外，也可以将计算结果保存于运算部13，之后调出计算结果，显示于显示部而进行确认。需要说明的是，此处，在向显示部单元15发送计算结果(步骤s04)后，利用控制部12进行了测定错误检测(步骤s05)，但也可以更换这些步骤的顺序。
实施例
下面，对酶电极的实施例进行说明。但是，本发明不限定于下述实施例的方式。
实施例1
(酶电极的制作)
制作出藉由单分子膜形成分子在金表面固定有包含细胞色素c亚基的gdh的酶电极。作为单分子膜形成分子，使用了以下的dsh。
具体而言，将金丝(前端3mm)于室温下在食人鱼溶液(200μl)中浸渍一晩，之后用丙酮清洗，浸渍于dsh的丙酮溶液(浓度1μm、10μm或90μm)中，在25℃温育8小时，使dsh的硫醇基结合于金表面。接着，用丙酮清洗，浸渍到含有酶(洋葱伯克氏菌来源的fadgdh(浓度0.028mg/ml))的hepes(100μl)中，在4℃温育2小时，藉由dsh的官能团使酶结合，得到酶电极。
(葡萄糖浓度的测定)
使用上述酶电极(以dsh浓度1μm、10μm、90μm分别制备的酶电极、各2批)，利用计时电流法，进行对于0mm(背景)、1mm、3mm、5mm、10mm、15mm或20mm的葡萄糖水溶液的响应电流值的测定。葡萄糖测定使用反电极(pt丝)、参比电极(银/氯化银)，使对工作电极的施加电压为+0.4v(vs.银/氯化银)，在37℃进行测定。
(测定结果的评价)
结果示于图4。根据图4所示的试验结果，在单分子膜形成分子(dsh)的浓度为1μm时，s/b比低，重现性也不充分，而在使浓度为10μm时，得到了适合于葡萄糖浓度测定的重现性和s/b比。
实施例2
(酶电极的制作)
为了确认单分子膜形成分子的有无导致的直接电子转移效率的差异，对在无单分子膜形成分子的情况下制作的电极和在有单分子膜形成分子的情况下制作的电极的响应进行了比较。具体而言，对于无单分子膜形成分子的电极，将金丝(前端3mm)于室温下在食人鱼溶液(200μl)中浸渍一晩，之后用丙酮清洗，浸渍于含有酶(洋葱伯克氏菌来源的fadgdh(浓度0.028mg/ml))的hepes(100μl)中，在4℃温育2小时，使酶吸附，得到酶电极。对于有单分子膜形成分子的电极，在上述工序的食人鱼溶液处理后用丙酮清洗，之后浸渍到dsh的丙酮溶液(浓度10μm)中，在25℃温育24小时，使dsh的硫醇基结合于金表面，除此以外利用相同的工序制作出电极。
(葡萄糖浓度的测定)
使用上述酶电极(按照有dsh、无dsh分别制备的酶电极、各2批)，利用计时电流法，进行对于0mm(背景)、1mm、3mm、5mm、10mm、15mm或20mm的葡萄糖水溶液的响应电流值的测定。葡萄糖测定使用反电极(pt丝)、参比电极(银/氯化银)，使对工作电极的施加电压为+0.4v(vs.银/氯化银)，在37℃进行测定。
(测定结果的评价)
结果示于图5。根据图5所示的试验结果，在藉由单分子膜形成分子(dsh)将酶固定的情况下，与不使用dsh的情况相比，得到了7.5倍高的葡萄糖浓度测定电流值。
实施例3
(酶电极的制作)
为了确认单分子膜的链长导致的直接电子转移效率的差异，制作出藉由各单分子膜形成分子在金表面固定有包含细胞色素c亚基的gdh的酶电极。作为单分子膜形成分子，使用了以下的dsh、dso(二硫代双(辛酸琥珀酰亚胺酯))、dsu(二硫代双(十一酸琥珀酰亚胺酯))。
【表1】
具体而言，将金丝(前端3mm)于室温下在食人鱼溶液(200μl)中浸渍一晩，之后用丙酮清洗，浸渍于各单分子膜形成分子的丙酮溶液(浓度10μm)中，在25℃温育24小时，使dsh的硫醇基结合于金表面。接着，用丙酮清洗，浸渍于含有酶(洋葱伯克氏菌来源的fadgdh(浓度0.028mg/ml))的hepes(100μl)中，在4℃温育2小时，使酶吸附，得到酶电极。
(葡萄糖浓度的测定)
使用上述酶电极(用dsh、dso、dsu分别制备的酶电极、各3批)，利用计时电流法，进行了对于0mm(背景)、1mm、3mm、5mm、10mm、15mm或20mm的葡萄糖水溶液的响应电流值的测定。葡萄糖测定使用反电极(pt丝)、参比电极(银/氯化银)，使对工作电极的施加电压为+0.4v(vs.银/氯化银)，在37℃进行测定。将电流达到稳态时的电流值作为测定值进行采样。
(测定结果的评价)
结果示于图6。根据图6所示的试验结果，随着单分子膜形成分子的链长变短，得到高的葡萄糖浓度测定电流值。
实施例4
(抗坏血酸和抗坏血酸的影响的分析)
对于藉由单分子膜形成分子固定有酶的电极是否受到抗坏血酸或对乙酰氨基酚的影响进行了研究。
具体而言，使用上述实施例2中制作的酶电极(dsh、各3批)，通过线性扫描伏安法进行了对于1.1mm、0.55mm或0mm对乙酰氨基酚水溶液或者100μm、50μm或0μm抗坏血酸的响应电流值的测定。葡萄糖测定使用对电极(pt丝)、参比电极(银/氯化银)，使对工作电极的施加电压为-0.2～+0.8v(vs.银/氯化银)。结果示于图7。其结果，在对乙酰氨基酚的情况下，从超过400mv附近起有电流流通，在抗坏血酸的情况下，从超过200mv附近起有电流流通，认为在测定葡萄糖时抗坏血酸或对乙酰氨基酚的混入成为问题。
由上述结果认为，在测定有可能混入抗坏血酸或对乙酰氨基酚这样的夹杂物的试样的葡萄糖浓度时，优选低电压。
因此，使对工作电极的施加电压为+100mv(vs.银/氯化银)，进行了与实施例2同样的实验(计时电流法)(各3批)。其结果，如图8所示，即使在将施加电位降低至+100mv的情况下，在藉由单分子膜形成分子固定有酶的电极(使用dsh)中也能够检测出电流值，其响应电流值与直接吸附了酶的电极(无sam)相比为高10倍以上的值。
接着，确认了实际以+100mv进行测定时抗坏血酸或对乙酰氨基酚是否有影响。具体而言，使用上述实施例2中制作的酶电极(dsh、各3批)，利用含有100μm抗坏血酸或1.1mm对乙酰氨基酚的葡萄糖溶液进行了与图8同样的实验(计时电流法)。
其结果，如图9、10所示，使用藉由单分子膜形成分子固定有酶的电极，在施加+100mv的电位时，存在抗坏血酸或对乙酰氨基酚时与不存在这些物质时的电流值几乎没有变化，可知不易受到抗坏血酸或对乙酰氨基酚的影响。这种情况在+150mv的施加电位时也相同。
进而，使用表1中记载的dsh、dso、dsu，通过线性扫描伏安法(施加电压-0.2～+0.8v(vs.银/氯化银))研究了抗坏血酸或对乙酰氨基酚的影响与连接物长度的关系(各3批或2批)。其结果，如图11所示，可知：即使在施加相同的电压时，连接物长度越长，抗坏血酸或对乙酰氨基酚的影响也越少。这暗示了通过延长单分子膜形成分子的连接物的长度，能够阻断夹杂物对电极表面的影响。
符号的说明
a···酶电极
1···电极
2···单分子膜形成分子
3···酶
4···绝缘性基板
b···测定装置
10···输出部
11···电力供给装置
12···控制部
13···运算部
14···检测部
15···显示部单元
16···电池
17···葡萄糖传感器
18···控制计算机
19···恒电位仪
20···基板
cr、w···端子
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