一种新型无酶葡萄糖传感器的制作方法

本发明涉及一种电化学传感器，从使用上讲，是在生物医学领域使用的一种新型无酶葡萄糖传感器。属于材料学与电化学领域。

背景技术：

糖尿病是一种世界范围的公共健康问题。电化学传感器因为其对糖尿病的诊断方面有独特的地方，所以，电化学传感器方法已经成为检测糖尿病葡萄糖的一个研究热点。依照制备传感器是否需要加酶或不需要加酶的标准，电化学葡萄糖传感器可以大致分为有酶葡萄糖生物传感器和无酶葡萄糖传感器两种类型。目前构建的无酶葡萄糖传感器，除了间接测定过氧化氢方式外，绝大部分都是通过直接测量的方式去检测葡萄糖在电极表面的氧化的电流，所以，电极表面生物敏感材料的电催化活性优异程度是影响无酶葡萄糖生物传感器灵敏度和选择性好与不好的主要原因。无酶传感器是否拥有高的灵敏度和优异的选择性在很大程度上取决与纳米材料的种类及晶体结构，所以对材料的选择就显得十分重要了，很多材料如铂，金，合金，包括铂，铅，金，钯和铑等，都被应用于无酶葡萄糖传感器的研究当中，但是制成的电极大多有灵敏度低和表面沉积的问题。

近些年来，通过使用纳米金属颗粒对无酶葡萄糖传感器的改进，有了新的趋势。金（au）纳米颗粒，铜（cu）纳米颗粒，铂（pt）纳米颗粒（ptnps，铂纳米颗粒），铂铅（pt/pb）合金纳米颗粒等都用来制备过无酶葡萄糖传感器，该类传感器和其它材料制备的传感器相比较展示出了更加优越的电催化性能。但相比有酶葡萄糖生物传感器的检测葡萄糖性能的催化过氧化氢的单一选择性和灵敏度，还有待提高。

磁性材料近年来由于其药物传播潜力，生物标志物和医学成像而受到越来越多的关注。因为有关研究，报道了磁性纳米粒子具有类似于普通过氧化物酶的固有酶样活性，导致许多基于电化学方法的磁性纳米粒子对过氧化氢的催化研究，开始备受关注和青睐，以实现虽然无酶但达到有酶的功效，来提高无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的灵敏度。然而，磁性纳米粒子因为大的比表面积和磁偶极子之间的相互作用等原因非常容易聚集到一起。此外，基于磁性纳米粒子的传感器通常具有性能差的缺点，如灵敏度低，线性范围比较窄等。因此，在无酶葡萄糖生物传感器的研究方面，还需要通过合理的设计和实验条件的探索研究，来克服这些缺陷。

综上原因，在电化学无酶葡萄糖传感器方面还需要不断改进，以获得一种更加专一的、选择性更好的，灵敏度更高的新型无酶葡萄糖传感器。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明的技术方案为：一种新型无酶葡萄糖传感器，主要由电极修饰材料和修饰电极两部分组成。其特征在于：修饰材料包括还原性石墨烯（rgo）和磁性氧化铁（fe2o3）与壳聚糖（cs）组成的石墨烯氧化铁（rgo-fe2o3）纳米复合材料，和铂纳米颗粒（ptnps）。所述石墨烯氧化铁rgo-fe2o3纳米复合材料中的石墨烯rgo、磁性氧化铁fe2o3、壳聚糖cs三者的含量比值，是按三者所含的质量，取值比例为：rgo∶fe2o3∶cs=rgo∶fe2o3∶cs=10~30∶6~18∶20~75。例如：三者的含量取值比例能够为：rgo∶fe2o3∶cs=10∶6∶20；或者，三者的含量取值比例能够为：rgo∶fe2o3∶cs=10∶18∶75；或者，三者的含量取值比例能够为：rgo∶fe2o3∶cs=30∶6∶75。修饰电极是直径3mm~6mm的玻碳电极gce，或银电极、或金电极，或铂电极，或一次性的印刷石墨电极；修饰电极的端头平面，被上述还原性石墨烯rgo和磁性氧化铁fe2o3与壳聚糖cs组成的石墨烯氧化铁rgo-fe2o3纳米复合材料的薄层覆盖修饰。铂纳米颗粒ptnps均匀分散沉积在修饰电极端头平面的石墨烯氧化铁rgo-fe2o3纳米复合材料的薄层表面上。

本发明的第一个发明点是用纳米氧化铁替代传统的四氧化三铁。纳米氧化铁，有两种类型，α型晶胞结构，不具有磁性。γ型晶胞结构，具有顺磁性，我们采用的是γ型晶胞结构的纳米氧化铁。其顺磁性在制备复合材料过程中不易于因为本身磁性的原因而团聚，只需克服比表面积大的因素就行。比较传统用的四氧化三铁，它的磁性跟磁铁一样，无论磁场在不在都有磁性，不容易分散，另外，检测过程中抗干扰低。虽然，将四氧化三铁做成纳米级，也具有顺磁性，但是相比制备纳米氧化铁的工艺和条件较为复杂和苛刻。加入顺磁性纳米氧化铁的目的是利用的是纳米氧化铁类酶的性质，即具有类似于普通过氧化物酶的固有酶样活性，也就是其催化性能，实验过程中催化效果良好。使用顺磁性纳米氧化铁，最重要的是，在实验中发现它可以降低催化过电位，这一点四氧化三铁还未见相关报道。这也是本发明的关键点。

其次，本发明重点关注碳材料在传感器中的应用。其中，石墨烯rgo具有高比表面积，优异的导热性，不同寻常的电催化活性和高电荷迁移率等优点现已成为制造传感器最常用材料。考虑到石墨烯材料的这些优点，创造性地将纳米氧化铁fe2o3用在在石墨烯rgo上，带来有利的磁性能，增加的电催化活性和电子转移能力，以及防止重聚集。

再次，本发明重点关注修饰电极材料的多组分的协同效应。铂纳米颗粒ptnps具有良好稳定性和高电催化效率，已经广泛用于制备生物传感器的电极材料，特别地，由于材料之间的协同效应，分散在基底材料上的铂纳米颗粒ptnps通常会具有比单组分纳米粒子更好的催化活性。鉴于上述问题，rgo，fe2o3和ptnps的整合将通过每种组合物的协同效应来克服现有的限制。因此，本发明设计的利用石墨烯、纳米氧化铁、铂纳米颗粒这三种纳米材料，实验优化出最优比例技术参数，用于构建一种新型无酶葡萄糖传感器。实验实施效果良好。

上述技术方案中，所述还原性石墨烯rgo所用的是配制成体积浓度为1mg/ml-6mg/ml的还原性石墨烯rgo溶液；所述磁性氧化铁fe2o3所用的是稀释配制成含顺磁性fe2o3浓度为4.1mg/ml~8.2mg/ml的纳米氧化铁fe2o3溶液；所述壳聚糖所用的是配制成体积浓度为5mg/ml~30mg/ml的壳聚糖醋酸溶液。需要说明的是，三者的浓度取值要符合权利要求1所述的三者的所含质量的取值比例rgo∶fe2o3∶cs=10~30∶6~18∶20~75，即浓度取值范围，要符合上述比例条件。所述铂纳米颗粒ptnps是用氯铂酸（k2ptcl6·6h2o）与氯化钾（kcl）电沉积方法合成的，两者摩尔浓度比值为k2ptcl6·6h2o∶kcl=1~3∶10。实验优化出最优比例技术参数，也是本发明的创新之一。

上述技术方案中，所述壳聚糖是水不溶性，脱乙酰度≥86%的分析纯壳聚糖；所述纳米氧化铁fe2o3是用交流磁场方法制备的、γ型晶胞结构的、液态纳米氧化铁fe2o3溶液。所述铂纳米颗粒ptnps的均匀分散沉积的量，是在电位窗口为-0.4v到+0.4v，扫描速度为50mv/s参数下，扫描160s-640s，大概在5分钟到10分钟之间沉积下来的量。本实验对材料的要求，是试验优化得出的，具有创新性。

与现有的无酶葡萄糖传感器相比，本发明有下列有益效果：（1）创新性地通过超声混合的方式将纳米氧化铁fe2o3溶液、石墨烯及壳聚糖溶液进行混合，进而制得rgo-fe2o3纳米复合材料。而非fe3o4，降低了降低催化过电位。（2）在此基础上，通过物理吸附石墨烯-氧化铁复合纳米材料以及电沉积铂纳米颗粒ptnps到电极的方法，制备传感器的修饰电极方法简单，制作方便简单，使用成本低廉，可批量大规模生产使用。（3）传感器构造简单、实验条件要求低、制备价格便宜，另外它还具备良好的灵敏度，检测范围广，高稳定性，选择性优异抗干扰能力强的特性。

附图说明

图1为本发明修饰电极表面320s电沉积的铂纳米颗粒ptnps扫描电镜照片，放大15k倍。

图2为本发明修饰电极表面640s电沉积的铂纳米颗粒ptnps扫描电镜照片，放大20k倍。

图3为本发明测试实验，葡萄糖的浓度与检测电流之间的线性校准曲线图。

图4为本发明测试实验，不同过氧化氢的浓度与检测电流之间的i-t响应曲线图。

图5为本发明测试实验，过氧化氢的浓度与检测电流之间的线性校准曲线图。

图6为本发明测试实验，低浓度过氧化氢浓度与检测电流的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步对本发明加以说明。

实施例一

参照图1至图3，一种新型无酶葡萄糖传感器用于葡萄糖的实验测定。

将本发明插入装有8ml除氧0.02m，ph7.4的磷酸缓冲盐（pbs）溶液中，连续注入给定的不同浓度的葡萄糖得到相应的电流响应。实验显示发明的新型无酶葡萄糖传感器对葡萄糖浓度的改变电流响应快速，3秒内还原电流就能够达到稳态电流的95%。图3是葡萄糖的浓度与检测电流之间的线性校准曲线图，是在葡萄糖浓度0.0075μm至0.235mm范围内安培电流与葡萄糖浓度的线性校准曲线图。参见图3表明，本发明对葡萄糖的测定的线性范围7.5μm~4.5mm，并拟合得到其线性方程为i(μa)=0.466x+0.097，线性相关系数r²=0.999。灵敏度和检测限是作为电化学传感器的两个重要参数，通过计算可以得到本发明的无酶葡萄糖传感器的灵敏度为7mam^-1cm^-2，检测限为7.5μm。结果显示本发明的一种无酶葡萄糖传感器具有良好的性能。

实施例二

参照图1~图2、图4~图6和表1。一种新型无酶葡萄糖传感器用于过氧化氢的实验测定。

将本发明插入0.02m，ph7.4的pbs溶液中，在0.1v的施加电位下，连续加入不同浓度的过氧化氢，得到i-t电流响应曲线，参见图4。由图4中可以看到：当将不同浓度的过氧化氢加入到pbs溶液，本发明的无酶葡萄糖传感器立即响应分析物，具有良好、稳定和急剧增加的电流响应，响应时间约为1s。这清楚地表明本发明电极和过氧化氢之间的快速电子转移。参见图5，从本发明的过氧化氢的浓度与检测电流之间的线性校准曲线图中，能够发现在7.5µm到10.765×10^-3m的浓度范围内，检测过氧化氢时具有两个线性范围：0.0075×10^-3m～4.265×10^-3m（线性相关系数r²=0.983）和4.89×10^-3m～10.765×10^-3m（线性相关系数r²=0.980）。也就是说，本发明的检测范围宽，并且具有两个不同浓度区域的检测范围。参见图6，实验得到本发明的低浓度过氧化氢浓度与检测电流的标准曲线图。从该图中能够发现：本发明在0.375µm到9.75µm范围内，均具有较高的灵敏度，线性相关系数r²=0.997。经计算过氧化氢的检测限能够低至0.375μm，灵敏度为10.834μa/mm。说明，本发明检测葡萄糖性能的催化过氧化氢的单一选择性和灵敏度都很高，满足测定葡萄糖的性能要求。

通过扫描电镜sem图像，参见图1、图2显示，本发明的纳米复合材料均匀地分布在了本发明的修饰电极表面上了；同时，结合电化学测试结果表明，本发明的无酶葡萄糖传感器对过氧化氢具有优良的催化性能，能够完全满足测定葡萄糖的电化学催化动力学要求。

再从表1的比较可以看出，本发明的玻碳电极gce除了这一项指标低于pt/rgo/gce材料的玻碳电极外，其余的传感器的线性范围宽度，检出最低限值，响应时间、灵敏度指标，均优于其它材料的电极传感器。原因分析总结如下：首先，将fe2o3磁性纳米颗粒纳入石墨烯溶液中可以降低过电位和提高电子转移能力，并防止fe2o3纳米粒子的严重聚集。其次，rgo-fe2o3-pt纳米复合材料具有大量的电活性位点，增加了过氧化氢分子吸附或反应的面积，因此本发明的无酶葡萄糖传感器的线性范围宽，检出限低，响应快。这些结果表明本发明具有良好的催化还原能力，是电化学过氧化氢检测和葡萄糖检测的理想选择。进一步表明了rgo-fe2o3-pt是葡萄糖检测的优良纳米复合材料，用它修饰的电极是很好的无酶葡萄糖传感器。

表1.几种不同材料组分修饰的电极传感器性能比较表。