专利名称：氧化铜-石墨烯纳米复合物修饰电极的制备方法及修饰电极在测定葡萄糖中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用氧化铜-石墨烯纳米复合物修饰玻碳电极的制备以及将其作为葡萄糖电化学传感器应用于临床上血糖的快速测定，属电化学分析检测技术领域。
背景技术：
碳材料是一种应用广泛的神奇材料，其中既包括世界上最硬的金刚石，也含有最软的石墨。近二十年来，碳纳米材料的研究一直是科技创新的前沿。2004年，英国科学家发现了由碳原子以Sp2杂化连接的单原子层构成的新型二维原子晶体一石墨烯，堪称目前最理想的二维纳米材料。石墨烯是由一层密集的晶体点阵上的碳原子组成，其厚度仅为0. 35 nm，是世界上最薄的二维材料。石墨烯表现出许多优异的性质机械强度高，可达130 Gpa, 是钢的100多倍；载流子迁移率达15000 cm2 V 1 s S是目前已知的具有最高迁移率的锑化铟材料的两倍；热导率可达5000 W m 1K S是金刚石的3倍；此外，它还具有室温量子霍尔效应及室温铁磁性等特殊性质。作为电极材料，石墨烯具有比表面积大，导电性好，稳定性高等良好的电化学性能。它能负载大量的纳米粒子、生物分子或芳香环分子，易于进一步修饰改性。在本方法中利用电沉积方法制备了氧化铜-石墨烯纳米复合材料，制备了高灵敏度的葡萄糖电化学传感器。血糖是指血液中的葡萄糖，人体中血糖浓度通常维持在4飞毫摩尔。葡萄糖的浓度水平可以作为代谢调节(通过胰岛素和胰高血糖素来调节)的信号。血糖浓度失调会导致多种疾病，最常见是糖尿病。因此，临床上快速，准确的测定血糖含量，对糖尿病的检查和治疗控制都非常重要。临床上，血糖的测定有葡萄糖氧化酶法，邻甲苯胺法，福林一吴氏法等。在葡萄糖传感器的研究上，电化学方法由于其分析速度快、成本低、灵敏度高等优点受到普遍关注。 葡萄糖电化学传感器根据有无酶的使用可将其分为有酶和非酶两种。由于酶活性受周围环境影响较大，近年来，非酶葡萄糖传感器的研究备受关注。随着纳米材料制备技术的发展， 各种纳米多孔结构、纳米管阵列、纳米颗粒等都被用于非酶葡萄糖电化学传感器的研制。例如，铜、镍及其氧化物等金属纳米粒子本身对糖具有催化氧化的性能，能够提高传感器在葡萄糖检测中的选择性和稳定性，因而被广泛用于制备非酶葡萄糖电化学传感器。石墨烯作为是一类新型碳材料，在葡萄糖电化学生物传感器制备中的应用研究也开始受到人们的重视。到目前为止，还没有将二者的复合物作为敏感材料制备葡萄糖传感器。
发明内容
本发明的目的是提供氧化铜-石墨烯纳米材料修饰玻碳电极的制备方法及其作为葡萄糖电化学传感器在检测过程中的使用方法。本发明作为一种氧化铜-石墨烯纳米材料修饰玻碳电极的制备方法，其特征在于具有以下的过程和步骤
a.玻碳电极的预处理首先将玻璃态碳电极即玻碳电极分别用1.0，0.3，0. 05 ym Al2O3抛光粉对所述玻碳电极依次进行打磨抛光，抛光至镜面，然后依次用超纯水、稀硝酸溶液、无水乙醇及超纯水超声清洗干净，晾干待用。b.氧化铜-石墨烯纳米复合材料修饰电极的制备首先，利用改进的Hummers方法通过石墨的氧化、剥离、化学还原等步骤制备石墨烯。具体步骤如下在冰水浴中装配好反应瓶，加入适量的浓硫酸，搅拌下加入一定量的石墨粉和适量的硝酸钠的固体混合物，再分次加入适量的高锰酸钾，控制反应温度不超过20 °C，搅拌反应一段时间，然后升温到35 °C，继续搅拌30 min，再缓慢加入一定量的去离子水，搅拌20 min后，加入适量双氧水还原残留的氧化剂，使溶液变为亮黄色。趁热过滤，并用质量比为5%的HCl溶液和超纯水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止。最后将滤饼置于60 °(的真空干燥箱中充分干燥，得到氧化石墨；
称取一定量的氧化石墨分散到200 mL的水中，常温下超声剥离40 min，得到棕色均一的悬浮液，在5000 rpm下离心5 min后，弃去未剥离的残渣，向该分散液中加入适量的水合胼，得到的混合液搅拌5 min。然后水浴加热到100 °C，在搅拌下保温M小时。过滤并洗涤三次后，将滤饼在60 0C的真空干燥箱中干燥过夜后，得到黑色的疏水性的粉末即石墨烯， 常温下保存；
将上述步骤得到的石墨烯分散到体积比为0. 1%的萘酚水溶液中超声得到一定浓度的石墨烯分散液，用微量移液枪准确移取10 PL石墨烯的萘酚分散液，滴涂在处理好的玻碳电极表面，室温下干燥，得到石墨烯修饰电极。将石墨烯修饰玻碳电极作为工作电极，与饱和甘汞电极、钼片电极组成三电极系统，在含有0.01 M CuCl2WO. 1 M KCl溶液中，恒电位-0.4 V下电沉积一定时间，用超纯水冲洗干净后，最后氮气流吹干，得到铜-石墨烯纳米复合物修饰电极。将铜-石墨烯纳米复合物修饰电极浸入到0.1 M NaOH中，利用循环伏安法在-0.50 V到+0.30 V的电位窗下，设置扫速100 mV s_ S反复扫描至稳定，在这一步操作中，电沉积在石墨烯表面的铜即被氧化成氧化铜纳米方晶，形成氧化铜-石墨烯纳米复合物，最后，该电极用超纯水冲洗3次，得到氧化铜-石墨烯纳米复合物修饰电极。为了作为比较，同时制备了氧化铜修饰电极，石墨烯修饰电极和萘酚修饰电极。其中，氧化铜修饰电极的制备方法与氧化铜-石墨烯修饰电极方法类似，只是不同在氧化铜是直接沉积在玻碳电极上；石墨烯修饰电极在本段开头已叙述过；萘酚修饰电极是将10 μ 的体积比为 0. 1%的萘酚直接滴涂在玻碳电极上，晾干制得。电沉积步骤中，所有涉及到的溶液均在N2 保护下使用。一种作为葡萄糖电化学传感器在检测葡萄糖过程中的用途及使用方法，其用途是所述修饰电极可直接用于葡萄糖的电化学测定。其使用方法及测定方法如下将所述的氧化铜-石墨烯纳米材料修饰玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、钼片电极作为辅助电极，组成三电极系统；测定葡萄糖时将三电极系统置于10 mL的0.1 M的 NaOH溶液中；然后在工作电极上施加一定的阳极电位，记录下电流-时间曲线，当背景电流达到稳态后，在搅拌下用微量进样器依次向0. 1 M的NaOH溶液中加入一定浓度的葡萄糖标准溶液；在葡萄糖浓度为2 μΜ 4 mM范围内，得到电流与葡萄糖浓度的线性关系曲线，其线性相关系数r = 0.998，利用标准曲线法对葡萄糖进行分析检测。在考察对葡萄糖测定有干扰的物质(例如，抗坏血酸，尿酸，多巴胺，半乳糖，乳糖，甘露糖，柠檬酸三钠，磷酸钾，氯化钠等物质)时发现，在生理浓度的比例下，电极对干扰物的响应不会干扰葡萄糖的测定。一种作为葡萄糖电化学传感器在检测葡萄糖过程中的应用实例在优化的条件下，取一定量的人血清加入到0. 1 M的10 mL的NaOH溶液中，记录电流响应值。利用上述电流-时间曲线的测定方法测定四个不同的人血清样品，每个测定三次，得出的人体血清中葡萄糖的含量。该结果与医院中CA-958H快速半自动生化分析仪得出的结果基本一致， 说明该检测方法在临床上可以快速准确的实现血糖的测定。本发明的优点和特点如下所述
本发明利用了电沉积方法制备的氧化铜-石墨烯纳米复合材料修饰电极，在无酶的条件下实现了对葡萄糖氧化的电催化作用，不仅避免了酶易失活不稳定的缺点，而且大大提高了分析检测葡萄糖浓度的灵敏度。所用电极材料涉及到碳材料和廉价金属，成本低，有一定的实用价值。本发明中的修饰电极是一种新型的电化学传感器，用于实际样品测定，具有快速、 灵敏、准确等特点。本发明的测试方法具有良好的重现性、稳定性和抗干扰性。本发明中的新型修饰玻碳电极的制备方法具有简单快速、易操作等优点。
图1为本发明中在含有葡萄糖溶液(2 mM)的0. 1 M氢氧化钠溶液中在裸玻碳电极 (a,GCE),氧化铜修饰玻碳电极(b，CuO-GCE)、石墨烯修饰玻碳电极(c，G-GCE)及氧化铜-石墨烯修饰玻碳电极(d，CuO-G-GCE)上的循环伏安图。图2为本发明中在搅拌下在0. 1 M的氢氧化钠溶液中依次加入葡萄糖溶液(0. 2 mM)的氧化铜-石墨烯修饰玻碳电极的电流-时间曲线。其中，插图是葡萄糖的浓度与电流响应的线性关系图。图3为最佳条件下，加入生理浓度比例的葡萄糖和抗坏血酸，尿酸，多巴胺，半乳糖，甘露糖，乳糖(20: 1，见图3A)，柠檬酸三钠，磷酸钾，氯化钠(5: 1，见图:3B)等干扰物时电极产生的电流-时间曲线图。
具体实施例方式现将本发明的具体实施例叙述于后。 实施例本实施例中的修饰玻碳电极的制备方法和步骤如下
(1)玻碳电极的预处理首先将玻璃态碳电极即玻碳电极分别用1.0，0.3，0.05ym Al2O3抛光粉对所述玻碳电极依次进行打磨抛光，抛光至镜面，然后依次用超纯水、稀硝酸溶液、无水乙醇及超纯水超声清洗干净，晾干待用；
(2)氧化铜-石墨烯纳米复合材料修饰电极的制备首先，利用改进的Hummers方法通过石墨的氧化、剥离、化学还原等步骤制备石墨烯。具体步骤如下在冰水浴中装配好反应瓶，加入适量的浓硫酸，搅拌下加入一定量的石墨粉和适量的硝酸钠的固体混合物，再分次加入适量的高锰酸钾，控制反应温度不超过20 °C，搅拌反应一段时间，然后升温到35 0C, 继续搅拌30 min，再缓慢加入一定量的去离子水，搅拌20 min后，加入适量双氧水还原残留的氧化剂，使溶液变为亮黄色。趁热过滤，并用质量比为5%的HCl溶液和超纯水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止。最后将滤饼置于60 °C的真空干燥箱中充分干燥，得到氧
化石墨。称取一定量的氧化石墨分散到200 mL的水中，常温下超声剥离40 min，得到棕色均一的悬浮液，在5000 rpm下离心5 min后，弃去未剥离的残渣，向该分散液中加入适量的水合胼，得到的混合液搅拌5 min。然后水浴加热到100 °C，在搅拌下保温M小时。过滤并洗涤三次后，将滤饼在60 °C的真空干燥箱中干燥过夜后，得到黑色的疏水性的粉末即石墨烯，常温下保存。将上述步骤得到的石墨烯分散到体积比为0. 1%的萘酚水溶液中超声得到一定浓度的石墨烯分散液，用微量移液枪准确移取10 μ 石墨烯的萘酚分散液，滴涂在处理好的玻碳电极表面，室温下干燥，得到石墨烯修饰电极。将石墨烯修饰玻碳电极作为工作电极，与饱和甘汞电极、钼片电极组成三电极系统，在含有0.01 M CuCl2WO. 1 M KCl溶液中，恒电位-0.4 V下电沉积一定时间，用超纯水冲洗干净后，最后氮气流吹干，得到铜-石墨烯纳米复合物修饰电极。将铜-石墨烯纳米复合物修饰电极浸入到0.1 M NaOH中，利用循环伏安法在-0.50 V到+0.30 V的电位窗下，设置扫速100 mV s_ S反复扫描至稳定，在这一步操作中，电沉积在石墨烯表面的铜即被氧化成氧化铜纳米方晶，形成氧化铜-石墨烯纳米复合物，最后，该电极用超纯水冲洗3次，得到氧化铜-石墨烯纳米复合物修饰电极。为了作为比较，同时制备了氧化铜修饰电极，石墨烯修饰电极和萘酚修饰电极。其中，氧化铜修饰电极的制备方法与氧化铜-石墨烯修饰电极方法类似，只是不同在氧化铜是直接沉积在玻碳电极上；石墨烯修饰电极在本段开头已叙述过；萘酚修饰电极是将10 μ 的体积比为 0. 1%的萘酚直接滴涂在玻碳电极上，晾干制得。电沉积步骤中，所有涉及到的溶液均在N2 保护下使用。氧化铜-石墨烯修饰玻碳电极的用途及其使用方法
(1)该修饰玻碳电极的用途是直接用于葡萄糖的电化学测定；
(2)将所述的氧化铜-石墨烯纳米材料修饰玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、钼片电极作为辅助电极，组成三电极系统；测定葡萄糖时将三电极系统置于10 mL的0.1 M的NaOH溶液中；然后在工作电极上施加一定的阳极电位，记录下电流-时间曲线，当背景电流达到稳态后，在搅拌下用微量进样器依次向0. 1 M的NaOH溶液中加入一定浓度的葡萄糖标准溶液；在葡萄糖浓度为2 μΜ 4 mM范围内，得到电流与葡萄糖浓度的线性关系曲线，其线性相关系数r = 0.998，利用标准曲线法对葡萄糖进行分析检测。在考察对葡萄糖测定有干扰的物质(例如，抗坏血酸，尿酸，多巴胺，半乳糖，乳糖，甘露糖，柠檬酸三钠，磷酸钾，氯化钠等物质)时发现，在生理浓度的比例下，电极对干扰物的响应不会干扰葡萄糖的测定。作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的催化作用表征
从图1可以看出，在无葡萄糖的0. 1 M NaOH溶液中，四种电极都没有观察到明显的峰， 而将2 mM的葡萄糖加入到0.1 M的NaOH溶液中时，在裸玻碳电极上仍然没有出现葡萄糖的氧化峰，说明裸电极对葡萄糖无催化氧化作用，而石墨烯修饰的玻碳电极则出现了一个小峰，说明石墨烯对葡萄糖的氧化有一定的催化作用。而在0.51 V处，氧化铜修饰电极和氧化铜-石墨烯纳米复合物修饰电极均出现了葡萄糖氧化峰，区别在氧化峰起始电位在氧化铜修饰电极上出现在0.30 V处，而氧化铜-石墨烯修饰电极出现在0.20 V，比前者电位低，这是因为氧化铜-石墨烯修饰电极对葡萄糖的催化能力更好，而且，氧化铜-石墨烯修饰电极对葡萄糖的电流响应信号是氧化铜修饰电极的1.5倍。石墨烯的使用，提高了电化学活性表面面积和加速了电子传递速度。电化学检测葡萄糖
在最佳测试条件下，氧化铜-石墨烯修饰玻碳电极对葡萄糖的时间-电流响应如图2 所示。由图2中的插图b可见，达到98%稳态电流的时间小于5 s,响应时间非常短，随着葡萄糖浓度的增加，传感器对葡萄糖的电流响应逐渐增大，在2 μΜ 4 mM范围内，电流与葡萄糖浓度成线性关系，线性方程为I μΑ) = 84. 29 C (μΜ) + 12. 68，线性相关系数为 0. 998，如图3所示。根据电极活性面积计算得到氧化铜-石墨烯纳米材料制备的传感器对葡萄糖的测定灵敏度高达1360 μΑ mM—1 cm — 2。本发明方法制备的电极，重现性和稳定性良好。对于同一个葡萄糖传感器，10次重复测定的标准偏差是1. 94%，对于三组葡萄糖传感器，三次测定的标准偏差为4. 36%。电极不用时在4冗存放一星期后，电流响仍保持为初始电流的85%。而且在生理浓度比例下，抗坏血酸，尿酸，多巴胺，半乳糖，甘露糖，乳糖，柠檬酸三钠，磷酸钾，氯化钠等物质几乎不干扰测定。其最低检测限为700 nM。
权利要求
1.氧化铜-石墨烯纳米复合物修饰电极的制备方法，其特征在于具有以下的步骤a.玻碳电极的预处理首先将玻璃态碳电极即玻碳电极分别用1.0，0.3，0.05 ym Al2O3抛光粉对所述玻碳电极依次进行打磨抛光，抛光至镜面，然后依次用超纯水、稀硝酸溶液、无水乙醇及超纯水超声清洗干净，晾干待用；b.氧化铜-石墨烯纳米复合材料修饰电极的制备首先在冰水浴中装配好反应瓶，力口入适量的浓硫酸，搅拌下加入一定量的石墨粉和适量的硝酸钠的固体混合物，再分次加入适量的高锰酸钾，控制反应温度不超过20 °C，搅拌反应一段时间，然后升温到35 °C，继续搅拌30 min，再缓慢加入一定量的去离子水，搅拌20 min后，加入适量双氧水还原残留的氧化剂，使溶液变为亮黄色；趁热过滤，并用质量比为5%的HCl溶液和超纯水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止；最后将滤饼置于60 0C的真空干燥箱中充分干燥，得到氧化石墨；称取一定量的氧化石墨分散到200 mL的水中，常温下超声剥离40 min，得到棕色均一的悬浮液，在5000 rpm下离心5 min后，弃去未剥离的残渣，向该分散液中加入适量的水合胼，得到的混合液搅拌5 min ；然后水浴加热到100 °C，在搅拌下保温M小时；过滤并洗涤三次后，将滤饼在60 0C的真空干燥箱中干燥过夜后，得到黑色的疏水性的粉末即石墨烯， 常温下保存；将上述步骤得到的石墨烯分散到体积比为0. 1%的萘酚水溶液中超声得到一定浓度的石墨烯分散液，用微量移液枪准确移取10 PL石墨烯的萘酚分散液，滴涂在处理好的玻碳电极表面，室温下干燥，得到石墨烯修饰电极；将石墨烯修饰玻碳电极作为工作电极，与饱和甘汞电极、钼片电极组成三电极系统，在含有0.01 M CuCl2WO. 1 M KCl溶液中，恒电位-0.4 V下电沉积一定时间，用超纯水冲洗干净后，最后氮气流吹干，得到铜-石墨烯纳米复合物修饰电极；将铜-石墨烯纳米复合物修饰电极浸入到0.1 M NaOH中，利用循环伏安法在-0.50 V到+0.30 V的电位窗下，设置扫速100 mV s _ S反复扫描至稳定，最后，该电极用超纯水冲洗3次，得到氧化铜-石墨烯纳米复合物修饰电极。
2.氧化铜-石墨烯纳米复合物修饰电极在检测葡萄糖中的应用，其特征在于将氧化铜-石墨烯纳米材料修饰玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、钼片电极作为辅助电极，组成三电极系统；测定葡萄糖时将三电极系统置于10 mL的0. 1 M的NaOH 溶液中；然后在工作电极上施加一定的阳极电位，记录下电流-时间曲线，当背景电流达到稳态后，在搅拌下用微量进样器依次向0. 1 M的NaOH溶液中加入一定浓度的葡萄糖标准溶液；在葡萄糖浓度为2 μΜ 4 mM范围内，得到电流与葡萄糖浓度的线性关系曲线，其线性相关系数r = 0.998，利用标准曲线法对葡萄糖进行分析检测。
全文摘要
本发明涉及一种利用氧化铜-石墨烯纳米材料修饰玻碳电极的制备以及将其作为葡萄糖电化学传感器应用于葡萄糖的快速测定，属电化学分析检测技术领域。本发明主要是用氧化铜-石墨烯纳米复合材料修饰玻碳电极制备葡萄糖传感器对葡萄糖的电化学催化氧化作用，通过电流-时间曲线法对葡萄糖进行灵敏的定量分析测定。本发明的要点是将石墨烯的萘酚悬浮液滴涂到处理好的玻碳电极表面，晾干后形成一层均匀的修饰层，利用操作简易的电沉积法制备了氧化铜-石墨烯纳米复合物的敏感层，实现对葡萄糖氧化的稳定催化。本发明制得的过葡萄糖传感器可用于临床上血清中血糖含量的检测分析，测定过程具有快速、灵敏、准确、稳定、干扰小等特点。
文档编号G01N27/30GK102520035SQ20111034508
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者丁亚平, 朱丽梅, 李丽, 李芳 , 王振新, 罗立强 申请人:上海大学