一种土壤农药污染生物快速诊断的方法与流程

本发明涉及土壤农药诊断技术领域，具体是涉及一种土壤农药污染生物快速诊断的方法。

背景技术：

土壤污染是世界性环境问题之一。污染土壤的清洁与安全利用是一项重要任务，土壤污染诊断是其中的一个重要环节。单纯依靠化学方法进行土壤污染诊断，因不能全面、科学地表征土壤的整体质量特征，需要其他方法对此做出补充。土壤污染生态毒理诊断研究顺应这一客观要求，由此得到迅速开展。

土壤自身具有独特的生态结构体系，土壤动物和土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，土壤又是植物生长的物质基础，因此，土壤污染需要由土壤生态系统中不同食物链结构中的敏感代表者来判定。它们(如，土壤微生物，暴露在土壤中的陆生植物，通过与土壤、母岩或直接暴露的化学品直接接触的无脊椎动物，暴露在土壤中的脊椎动物等)是土壤污染诊断的可靠指标。

高等植物是生态系统中的基本组成部分。利用其生长状况诊断土壤污染，是土壤诊断的重要方法之一。目前已建立的高等植物毒理试验方法有根伸长抑制试验、种子发芽试验和植物幼苗早期生长试验。chang等人对三种土壤进行了植物生态毒性试验研究，本发明人通过长期实验和探索，发现植物组织染色法可以为土壤农药污染诊断研究提供一定的依据。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一种土壤农药污染生物快速诊断的方法，为土壤农药污染诊断研究提供依据。

本发明的技术方案是：

一种土壤农药污染生物快速诊断的方法，通过植物组织染色法进行诊断。

进一步地，在上述方案中，所述植物为小麦。发明人进行了多种作物的毒性响应测试，结果表明小麦能够表现出较为显著的染色反应。

进一步地，在上述方案中，所述农药为绿麦隆。因为小麦对绿麦隆的污染是比较敏感的物种，所以用小麦作为指示农药绿麦隆土壤污染的指示生物能够取得更好的效果，使本发明的诊断方法更加灵敏、快速。

进一步地，在上述方案中，所述检测部位为小麦叶片，选择小麦叶片作为检测部位是因为小麦叶片面积大，染色结果明显，也利于观察。

更进一步地，所述小麦叶片为发芽后生长10-15天的小麦叶片，此时的小麦生长良好，叶片颜色还不至于太深，不影响染色后颜色的观察。

进一步地，所述的一种土壤农药污染生物快速诊断的方法具体为：将小麦叶片染色后，通过显微镜观察，若叶片染色颜色呈现出蓝色，则表明土壤中含有绿麦隆，若叶片染色颜色未呈现出蓝色，则表明土壤中不含绿麦隆。通过染色结果即可快速诊断出土壤中是否含有农药。

更进一步地，所述染色方法为：叶片茎部切口处浸入10mm柠檬酸钠(ph6.0)溶液(含6mmnbt)中，在25℃下光照8h，然后用沸腾的乙醇(96％)脱色10min。

进一步地，所述的一种土壤农药污染生物快速诊断的方法具体包括以下步骤：

s1：以5％naclo溶液浸泡小麦种子10min，蒸馏水彻底洗净；置于玻璃培养皿中，25℃暗处催芽8h后，选取发芽良好且长势一致的种子转移至1l塑料盆中，每盆中装待测试土壤1120g；

s2：盆栽于光照培养箱中培养，培养温度为25℃/20℃(日/夜)，光照强度为300μmolm^-2s^-1，并维持一定的湿度；于第11d的早晨8点采集小麦的叶部分；

s3：将叶片茎部切口处浸入10mm柠檬酸钠(ph6.0)溶液(含6mmnbt)中，在25℃下光照8h，然后用沸腾的乙醇(96％)脱色10min；染色后，于显微镜下拍照；

s4：根据染色结果进行判定，若叶片染色颜色呈现出蓝色，则表明土壤中含有绿麦隆，若叶片染色颜色未呈现出蓝色，则表明土壤中不含绿麦隆。

进一步地，还可以通过小麦叶片染色后颜色的深浅来判定土壤中绿麦隆的浓度，小麦叶片染色颜色加重表明绿麦隆浓度越大，毒性作用越强。通过该方法可作为评价污染物毒性的指标。

本发明的有益效果是：本发明通过反复长期实验进行了多种作物的毒性响应测试，结果表明小麦能够表现出较为显著的染色反应，证实小麦对绿麦隆的污染是比较敏感的物种，选用小麦作为指示农药绿麦隆土壤污染的指示生物，使本发明的诊断方法更加灵敏、快速，取得更好的诊断效果，为土壤农药污染诊断研究提供了可靠的依据。

附图说明

图1是绿麦隆诱导的小麦、油菜和苜蓿叶片中超氧自由基累积量影响结果，其中1-a为小麦，1-b为油麦菜，1-c为苜蓿。

图2是绿麦隆诱导的小麦叶片中超氧自由基累积量影响结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明：

一种土壤农药污染生物快速诊断的方法，具体包括以下步骤：

s1：以5％naclo溶液浸泡小麦种子10min，蒸馏水彻底洗净；置于玻璃培养皿中，25℃暗处催芽8h后，选取发芽良好且长势一致的种子转移至1l塑料盆中，每盆中装待测试土壤1120g；

s2：盆栽于光照培养箱中培养，培养温度为25℃/20℃(日/夜)，光照强度为300μmolm^-2s^-1，并维持一定的湿度；于第11d的早晨8点采集小麦的叶部分；

s3：将叶片茎部切口处浸入10mm柠檬酸钠(ph6.0)溶液(含6mmnbt)中，在25℃下光照8h，然后用沸腾的乙醇(96％)脱色10min；染色后，于显微镜下拍照；

s4：根据染色结果进行判定，若叶片染色颜色呈现出蓝色，则表明土壤中含有绿麦隆，若叶片染色颜色未呈现出蓝色，则表明土壤中不含绿麦隆。

实验验证：

1.不同植物对农药的响应作用试验：选取小麦、油菜和苜蓿三种作物对除草剂绿麦隆进行毒性响应测试。

1.1供试材料：

供试土壤均为0～20cm表土。采自南京紫金山，风干后除去碎石、草根、败叶，过3mm筛备用。土壤理化性质见表4-1。苜蓿(中苜1号)，小麦(宁麦9号)，油菜(杨油6号)购自江苏省农科院。

绿麦隆原药由江苏省农科院提供，纯度为98.3％，标样纯度为99.08％。其它化学试剂均为分析纯。其它生化试剂均为优级纯。水为超纯水(18.2mω)。

1.2仪器设备：

电子显微镜、微量移液枪、恒温水浴锅等。

1.3植物的培养和处理：

以5％naclo溶液浸泡待试种子10min，蒸馏水彻底洗净。置于玻璃培养皿中，25℃暗处催芽8h后，选取发芽良好且长势一致的种子转移至1l塑料盆中，每盆中装土1120g。在播种前，农药在土中按4个添加水平：0、0.5、1.0、4.0mgkg-1土添加。将土拌匀后转移至塑料盆中。每个处理重复三次。盆栽于光照培养箱中培养，培养温度为25℃/20℃(日/夜)，光照强度为300μmolm-2s-1，并维持一定的湿度。于第11d的早晨8点分别采集各处理的叶部分。

1.4植物组织染色法：

植株叶片中o2·-的测定参照frahry和schopfer[9]的氮蓝四唑(nbt)染色方法，将叶片茎部切口处浸入10mm柠檬酸钠(ph6.0)溶液(含6mmnbt)中，在25℃下光照8h，然后用沸腾的乙醇(96％)脱色10min。染色后，于显微镜下拍照。

1.5试验结果：

研究表明，大量的农药等有机污染物胁迫能诱导活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)的大量产生。ros容易导致细胞的膜脂过氧化，并最终使细胞死亡。而由草萘胺胁迫引起的o2·-和h2o2的累积量可用组织染色试验进行表征，o2·-可以与nbt反应生成蓝色的不溶物，因而可以用来对质膜过氧化进行组织染色及定位。

选取小麦、油菜和苜蓿三种作物对除草剂绿麦隆进行了毒性响应测试，结果显示在土壤中绿麦隆2mgkg^-1浓度作用下，小麦显现出较为显著的染色反应，染色结果见图1。因此在这三种品种中，小麦对绿麦隆的污染是比较敏感的物种，因此选择小麦作为指示农药绿麦隆土壤污染的指示生物。

2.小麦对不同浓度农药响应作用

研究对不同浓度绿麦隆对其的胁迫效应，结果表明，随着农药浓度的增大，叶片中o2·-和h2o2的累积水平也呈持续增大，染色现象也逐步加深，如图2所示。当土壤中绿麦隆的浓度为0.2mgkg^-1时，小麦植株染色均有显著响应。引起植株叶片染色颜色加重与绿麦隆浓度或毒性作用强度呈剂量相关关系。该方法可作为评价污染物毒性的指标。

结论：采用植物组织染色法指示了土壤中农药污染程度，经过筛选小麦可以作为指示农药绿麦隆土壤污染的一种指示生物。该方法灵敏，快速，可用于土壤污染的快速诊断。本方法可以推广应用于其它品种的农药。