一种用于有机磷农药裸眼可视化半定量检测的分析方法与流程

本发明属于有机磷农药的快速检测技术领域，具体地说是一种可以对有机磷农药进行半定量可视化检测的比色分析方法、速测卡及其应用。

背景技术：

因为具有广谱、高效和在自然环境中容易降解等特点，有机磷农药(ops)已成为我国使用量最大的农药品种之一。有机磷农药的使用可有效抑制病虫害，提高农作物产量。但是，长期使用有机磷农药所造成的其在饮用水、土壤、空气和食品中的残留问题也已经对环境和人类健康造成了巨大威胁。为了避免这一危害，很多国家已经出台了国家标准严格限制和规范有机磷农药的使用。在这一背景下，发展可实现有机磷农药残留量的快速检测方法就显得尤为重要。(文献1：k.s.brajesh,w.allan,femsmicrobiolrev.,2006,30,428；文献2：q.zhou,l.yang,g.c.wang,biosens.bioelectron.,2013,49,25；文献3：s.o.obare,d.chandrima,g.wen,sensors,2010,10,7018；文献4：x.j.meng,c.w.schultz,c.cui,sens.actuat.b,2015,215,577)。

在众多的分析方法中，比色法由于可以不依赖仪器，可直接根据有机磷农药所导致的颜色变化对农药进行识别，因此尤其适合于对有机磷农药的在线分析(文献5：s.h.qian,h.w.lin,anal.chem.,2015,87,5395；文献6：m.m.liang,k.l.fan,y.pan,anal.chem.,2013,85,308；文献7：p.weerathunge,r.ramanathan,r.shukla,anal.chem.,2014,86,11937)。比如，目前我国的国标法速测卡法就是基于这一原理发展而来的。速测卡法利用乙酰胆碱酯酶(ache)可催化靛酚乙酸酯(红色)水解为乙酸与靛酚(蓝色)这一性质，基于ache在有机磷农药抑制前后酶催化和水解活性的改变和速测卡相应的颜色变化对农药进行筛查。这种方法简单可行，可以用来简单判定是否有农药残留(文献8：农药残留量快速检测，中华人民共和国国家标准，2003年8月)。然而，一方面由于所用显色试剂靛酚的摩尔吸光系数不高，速测卡法的灵敏度并不是很高，仅能对ppm数量级的农药进行测定。另一方面，由于厨房的油烟、卫生间的空气清新剂等都可能左右速测卡的测试结果，因此该方法的准确率最多能达到80％，而且并不能精确得出农药含量的数值和比例。

为了提高比色法的灵敏度，近年来，金纳米材料被引入了农药的比色分析领域。与传统显色试剂不同，金纳米材料具有特异的依赖于形貌、尺寸和外部环境的表面等离子体共振性质(文献9：k.l.kelly,e.coronado,l.l.zhao,j.phys.chem.b,2003,107,668)。比如，游离的13nm的金纳米粒子呈酒红色，当外界环境引起金纳米粒子的团聚或生长时，金纳米粒子的颜色会变成蓝色或紫色(文献10：l.h.guo,y.xu,a.r.ferhan,g.n.chen,d.h.kim,j.am.chem.soc.,2013,135,12338；文献11：s.link,m.a.el-sayed,j.phys.chem.b,1999,103,4212.)；而当金纳米粒子被溶解时，会导致比色体系粉红色的消失(文献12：s.wu,d.d.li,j.m.wang,y.q.zhao,s.j.dong,x.y.wang,sens.actuat.b,2017,238,427)。因此，将金纳米材料的状态改变与有机磷农药建立起关联，就可以根据金纳米材料的颜色变化对有机磷农药的有无进行判断。此外，金纳米材料的吸光能力很强，其摩尔吸光系数可以达到传统显色试剂的10³～10⁴倍(文献13f.m.li,j.m.liu,x.x.wang,sens.actuat.b,2011,155,817)。因此，以金纳米材料作为显色试剂的比色分析方法通常具有非常高的灵敏度，在有机磷农药的浓度为ppb量级时即可观察到明显的颜色变化。由于具有这些独特的优势，以金纳米材料作为显色试剂的比色分析方法近年来受到了越来越广泛的关注，也得到了长足的发展。不过，在研究的早期，以金纳米材料作为比色试剂还只能对农药的有无进行判断。而若要确定有机磷农药的含量进行确定，还需要借助于光谱仪器(文献14：r.elghanian,j.j.storhoff,r.c.mucic,r.l.letsinger,c.a.mirkin,science,1997,277,1078；文献15：x.m.ma,z.t.chen,p.kannan,z.y.lin,b.qiu,l.h.guo,anal.chem.,2016,88,3227)。

近几年，除了颗粒状的纳米材料，棒状金纳米材料(aunrs)也开始在有机磷农药的比色分析中得到了应用(文献16：m.coronado-puchau,l.saa,m.grzelczak,v.pavlov,l.m.liz-marzán,nanotoday,2013,8,461；文献17：l.l.lu,y.s.xia,anal.chem.2015,87,8584)。不同于金纳米颗粒，金纳米棒具有依赖于长径比的表面等离子体共振性质，比如，当金纳米棒的长径比从大变小的过程中，金纳米棒的颜色会呈现出从棕红到灰、绿、蓝、紫、粉和无色等一系列的颜色变化。因此，如果将金纳米棒的颜色变化与有机磷农药的浓度建立起一对一的关联，便可以基于颜色改变实现对有机磷农药的定量分析。2015年，lu等人首次将金aunrs的颜色改变用于胆碱酯酶活性以及酶抑制剂有机磷农药的比色分析。在分析过程中，有机磷农药的浓度改变能引起金纳米棒“头碰头”连接程度的改变，即长径比的变化。因此，基于长径比改变所对应的颜色变化，这种方法首次实现了对酶活性及有机磷农药的半定量分析。然而，该方法对操作条件的要求很高，步骤繁琐耗时。2016年，pavlov课题组将过氧化氢催化的金纳米棒的溶解反应引入了对有机磷农药的半定量比色分析中，同样实现了对酶活性和酶抑制剂的半定量比色分析。然而，为了完成一个分析过程，需要使用两种生物酶，方法的成本较高。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、可对有机磷农药进行裸眼可视化半定量检测的分析方法、速测卡及其应用。

本所述方法对有机磷农药(ops)进行半定量分析的检测原理为：在不含有机磷农药的体系中，具有高反应活性的ache水解底物硫代乙酰胆碱(atch)生成硫代胆碱(tch)。tch具有还原性，进一步还原体系中存在的au³⁺-ctab复合物，使残留的au³⁺-ctab只能轻微刻蚀aunrs。该轻微刻蚀所导致的aunrs的长径比变化不足以产生可观测的颜色变化；然而，当体系中含有有机磷农药时，ache的活性被抑制，仅水解产生少量或不产生tch。此时，体系中大量存在的au³⁺-ctab从端部开始刻蚀aunrs，使其长径比显著降低，并产生可观测的从棕红到灰、绿、蓝、紫和粉等一系列的颜色变化。

本发明的技术方案：

一种用于有机磷农药裸眼可视化半定量检测的分析方法，步骤如下：

本分析方法所使用的试剂包括：(1)显色试剂：十六烷基三甲基溴化胺(ctab)稳定的aunrs或以该aunrs为基础的显色卡；(2)溶解试液：au³⁺和ctab的混合液；(3)有机磷农药识别试剂：ache和atch；

所述的显色卡由四层组成，从上到下依次为具有5mm裸露直径孔的塑料覆盖层、直径为5mm的aunrs膜反应区、棉花吸水层和塑料基底层；这四层通过两个夹具在边缘固定夹紧，使得每一层紧密接触；其中，aunrs膜的制备过程如下：将纤维素纸交替地浸泡在1～5mg/ml的pdda和同浓度的pss溶液中，交替三次，30min以上交替一次，使得纤维素纸上覆盖上负电荷。将带负电荷的纤维素纸置于砂芯漏斗上，真空抽滤2ml的洗涤过的带正电荷的aunrs溶液，室温自然干燥。

上述的比色分析方法可以用于有机磷农药的可视化检测，步骤如下：

(1)向ache溶液中加入有机磷农药(或含有有机磷农药的实际样品试液)，室温下温育5～20分钟，继续加入atch，形成混合体系，继续于37℃下反应20～40分钟；其中，混合体系中ache溶液浓度为9～15mu/ml，有机磷农药的浓度0.1～2.5ppm，atch的浓度为100～130μm；

(2)在所述的混合体系中依次加入金原子数比值为1:2的au³⁺和aunrs溶液，充分混合均匀后，37℃～45℃温度条件下，反应15分钟，aunrs被au³⁺-ctab复合物完全刻蚀，其中，au³⁺的浓度为160～180μm；

用uv-vis吸收光谱记录所得aunrs的吸收，同时肉眼观察aunrs的颜色变化，棕红色-灰色-绿色-蓝色-紫色-粉色-无色；用于有机磷农药的可视化半定量检测。

当有机磷农药的浓度低于0.2ppm时，aunrs呈红棕色；当有机磷农药的浓度处于0.2～0.8ppm时，aunrs呈灰色；当有机磷农药的浓度处于0.8～1.1ppm时，aunrs呈绿色；当有机磷农药的浓度处于1.1～1.3ppm时，aunrs呈蓝绿色；当有机磷农药的浓度处于1.3～1.5ppm时，aunrs呈蓝色；当有机磷农药的浓度处于1.5～2.0ppm时，aunrs呈紫色；当有机磷农药的浓度处于2.0以上时，aunrs呈粉色。因此，通过颜色的改变，该方法可以用于有机磷农药的半定量分析。

上述的显色卡用于有机磷农药可视化检测的检测步骤如下：

(1)向ache溶液中加入有机磷农药(或含有有机磷农药的实际样品试液)，室温下温育5～20分钟，继续加入atch，形成混合体系，继续于37℃下反应20～40分钟；其中，混合体系中ache溶液浓度为9～15mu/ml，有机磷农药的浓度1～11ppm，atch的浓度为100～130μm；

(2)向所述的混合体系中依次加入金原子数比值为1:2的au³⁺-ctab和aunrs，以消耗水解产物tch，其中，au³⁺的浓度为160～180μm；。然后，将混合溶液全部滴到显色卡上，在室温下反应5分钟以内，得到颜色变化的aunrs试纸与未反应的试纸比较来识别有机磷农药的浓度。当有机磷农药的浓度低于5ppm时，显色卡呈墨绿色；当对硫磷的浓度处于5～7ppm时，显色卡呈粉色；当对硫磷的浓度高于10ppm时，显色卡退为无色。

比色分析方法中的主要组分可用于有机磷农药测定的相关试剂及器件的开发中。

本发明以aunrs作为显色试剂。aunrs具有各向异性的表面等离子体共振性质，在其长径比从4.0降低到1.0的过程中，aunrs会呈现出从棕到灰、绿、蓝、紫和粉等一系列可观测的颜色变化。因此，将aunrs在au³⁺溶液中的溶解反应与ache的农药抑制及水解反应建立起关联，利用aunrs在溶解过程中的颜色变化，便可实现对有机磷农药含量的半定量可视化分析。

本发明的有益效果：

1.显色试剂具有多色属性，每个颜色会对应一个有机磷农药的浓度，适用于对一定范围内的有机磷农药的半定量可视化分析。

2.显色试剂稳定性好，不受体系盐度的影响。

3.灵敏度高，肉眼可观测的最低检测下限为0.4ppm数量级。

4.选择性较好，不受溶液中共存的金属离子等的干扰。

5.具有较好的适用性，适用于所有ache抑制剂的检测。

6.基于溶解反应，简单方便，成本低，适用于现场分析。

附图说明

图1是aunrs显色试剂的紫外可见吸收光谱(a)和透射电镜照片(b)。

图2是aunrs在不同浓度的au³⁺溶液中反应10分钟之后的紫外可见吸收光谱(a)和纵向吸收峰强度与横向吸收峰强度的比值与au³⁺浓度的关系(b)。a～h曲线所对应的au³⁺的浓度按分别为：0,17,34,50,67,84,100,134和168μm。

图3是aunrs在不同浓度的au³⁺溶液中反应10分钟之后的透射电镜照片。au³⁺的浓度分别为(a)0，(b)42，(c)59，(d)84，(e)92，(f)118μm。

图4是aunrs农药检测体系在不同反应历程下的紫外-可见吸收光谱。(a)aunrs+ctab，(b)aunrs+ctab+au³⁺，(c)ache+atcl+au³⁺+aunps+ctab，(d)ache+au³⁺+aunrs+ctab，(e)atcl+au³⁺+aunrs+ctab，(f)ache+atcl+au³⁺+aunps+ctab+0.53ppm对硫磷，(f)ache+atcl+au³⁺+aunps+ctab+1.05ppm对硫磷。

图5是aunrs农药检测体系在测定不同浓度的氧化乐果后aunrs的紫外可见吸收光谱图。氧化乐果浓度从右往左分别为：0，0.01，0.21，0.42，0.63，0.84，1.05，1.26，1.47，2.10ppm。

图6是aunrs农药检测体系在测定不同浓度的对硫磷后aunrs的紫外可见吸收光谱图。对硫磷浓度从右往左分别为：0,0.01,0.26,0.53,0.79,1.05,1.32,1.58,1.84和2.37ppm。

图7是aunrs农药检测体系在测定不同浓度的杀螟松后aunrs的紫外可见吸收光谱图。杀螟松浓度从左到右依次为：0,0.1,0.37,0.63,0.89,1.16,1.42,1.68,1.95和2.63ppm。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

下面结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。本实施例仅用于对本发明进行说明，基于相同原理和类似原料的方法也属本发明的范围。

实施例1

比色试剂aunrs的合成和速测卡的制备：

(1)aunrs的合成操作可分成两步：金种的合成和金纳米棒的生长。

(a)金种的合成：将250μl浓度为0.01m的haucl4·3h2o与9.75ml浓度为0.1m的ctab混合，加入600μl新配制的nabh4溶液(0.01m)，混合均匀使充分反应后，将所得溶液置于30℃下反应30分钟，得到稳定的金种。

(b)aunrs的生长：先将0.9212gctab和0.11g5-溴水杨酸完全溶于49ml水中，向上述混合液中依次加入agno3(240μl/0.02m)、haucl4(500μl/0.05m)和aa(130μl/0.1m)三种溶液，剧烈搅拌使溶液完全混合，得到金种生长溶液。将80μl的金种溶液注入到该生长溶液中，搅拌混合均匀后，在30℃下静置12小时，溶液呈棕红色，说明aunrs生成。将所得的aunrs离心洗涤三次后，重新分散在0.01m的ctab溶液中，得到比色分析中所用的金纳米棒显色试剂。该实验条件下，所得金纳米棒的纵向和横向的等离子体共振吸收峰分别位于768nm和514nm，对应长径比为3.5～4.0(图1)。

(2)aunrs比色卡的制备：将纤维素纸交替三次浸泡在浓度均为1～5mg/ml的pdda和pss溶液中，使纤维素纸表面覆盖满负电荷。将带负电荷的纤维素纸置于砂芯漏斗上，真空抽滤2ml的aunrs溶液，室温自然晾干，得到表面覆盖有aunrs的试纸。以蜡笔画出直径为5mm的区域作为反应区，下层铺展一层棉花吸收层，上下两面分别覆盖塑料片以方便固定。其中，上层塑料片需挖开一个直径为5mm的区域与金试纸的反应区对应。

实施例2

aunrs在au³⁺-ctab溶液中的可控刻蚀：

图2和图3分别为所制备的aunrs在被不同浓度的au³⁺刻蚀后的紫外可见吸收光谱、溶液颜色照片和透射电镜图片。如图2a所示，新合成的aunrs在768nm处具有纵向等离子体共振吸收峰，在514nm处具有横向等离子体共振吸收峰。随着au³⁺浓度的增加，纵向等离子体峰发生蓝移且峰值强度降低，而横向峰则略微红移。纵向吸收峰的峰强度与横向吸收峰的强度比值与au³⁺的浓度呈现较好的线性关系(图2b)，说明通过控制au³⁺的浓度可对aunrs进行可控的刻蚀。随着au³⁺浓度的增加，aunrs的长径比逐渐减小(图3)，溶液的颜色相应地也发生了从棕褐色到灰色，绿色，蓝色，紫色，红色和无色的变化。这种颜色的改变肉眼很容易区分，因此，通过aunrs所呈现出的不同颜色可实现对au³⁺进行半定量分析的目的。

实施例3

aunrs在有机磷农药裸眼可视化半定量检测中的应用：

如图4所示，新合成的aunrs分别在768nm和514nm处具有强的纵向和弱的横向等离子体吸收峰(曲线a)。将aunrs加入到含au³⁺-ctab的溶液中，aunrs的两个吸收峰消失(曲线b)，aunrs溶液的颜色也从棕褐色变为无色，说明aunrs完全溶解。当在此体系中加入ache和底物atch时，可观察到纵向吸收峰蓝移了约10nm(曲线c)。这是因为酶水解反应产生的还原产物tch消耗掉几乎所有的au³⁺，残留的少量au³⁺轻微刻蚀aunrs以致其纵向吸收峰蓝移至758nm，但此时溶液的颜色依然是棕褐色，未发生明显的颜色变化。值得一提的是，ache和底物atch的共同作用才可以导致au³⁺的消耗，并保证aunrs显色剂颜色的维持。因为若体系中仅有atch(曲线d)或ache(曲线e)的情况下，au³⁺都不会被消耗。由此可见，在没有有机磷农药存在时，体系中的aunrs的颜色依然维持在棕褐色。然而，当ache预先被0.53ppm的有机磷农药抑制后再加入到aunrs的比色体系时，aunrs的纵向吸收峰蓝移到了723nm(曲线f)，同时峰值强度降低，aunrs溶液的颜色也从棕褐色变成了灰色。进一步将对硫磷的浓度增加到1.05ppm，aunrs溶液纵向吸收峰的位置继续蓝移到了688nm(曲线g)，aunrs溶液的颜色从灰色变为绿色。这充分说明，通过金纳米棒的颜色变化可以实现对有机磷农药的半定量分析。颜色变化的原因是由于对硫磷抑制ache的活性后会导致酶解产物tch的减少和大量au³⁺的残余，从而导致aunrs的刻蚀反应加剧，长径比的降低和颜色的改变。

在最佳条件下，如图5～7所示，该方法对毒性不同的有机磷农药对硫磷、氧化乐果和杀螟松均表现出了良好的响应。肉眼可观测到的对对硫磷、氧化乐果和杀螟松三种农药的最低检测限分别为0.42，0.53和0.63ppm。均低于我国对这三种农药的限定使用值。

此外，本方法在对实际样品洗白菜水中对硫磷含量的测定过程中也表现出了较好的准确度。向白菜叶上喷洒农药对硫磷后，分别用30ml蒸馏水洗涤两次，每次洗涤时，均收集洗涤溶液。分别通过本实施例方法与lc-ms/ms方法的测量值相对比。如表1所示，当将第一次收集的洗涤液用于比色分析时，aunrs的颜色变为绿色。对照aunrs在不同浓度对硫磷标准液下产生的颜色变化，肉眼测得对硫磷浓度在0.79～1.05ppm之间。为了结果更准确，利用uv-vis建立内标法，测得对硫磷浓度为1.05ppm。该结果比通过lc-ms/ms方法获得的值略高，表明此比色法具有可接受的准确性。在第二次收集的洗涤溶液中，残留的对硫磷浓度不能改变aunrs溶液的颜色，仍利用本法uv-vis建立内标，测得对硫磷浓度0.069ppm。同样地，以lc-ms/ms方法检测，未发现对硫磷。因此可见，本章提出的半定量比色分析方法具有通过易分辨的颜色变化来指示实际样品洗白菜水中存在不同浓度的对硫磷的能力。

实施例4

aunrs显色卡在有机磷农药半定量可视化检测中的应用：

所制备金纳米比色卡也可用于有机磷农药的半定量分析。在速测卡使用之前，对金膜的反应区以蜡笔画出了边缘区域，同时对下层的棉花做了润湿的预处理。这两步操作对于比色检测起到了重要的作用。当没有蜡笔画出的测试区时，含有au³⁺-ctab复合物的溶液在垂直扩散的同时，也会水平扩散，使得反应区域无法限定，测试不可控。而当aunrs膜层和棉花吸收层没有预先润湿时，在夹子固定后，这两层之间的空气不能完全排尽，液体不能及时被吸收层吸收而滞留，导致整个膜层平面反应不均匀。经过以上处理后，金测试卡上的aunrs可以在4min内被au³⁺-ctab复合物完全溶解，速度比在水溶液中进行的更快。

在最佳条件下，将aunrs膜装置用于对硫磷的半定量可视化检测。对硫磷的浓度为0，1.6，2.6，5.0，7.1和10.9ppm时，aunrs膜的颜色从绿色逐渐变为红色，无色。虽然此结果的分辨率和灵敏度都比在溶液中要差的分辨率和灵敏度都比较差，但仍然可以观察到由绿色到红色的明显的颜色变化，此时获得对硫磷浓度的检测限为5.0ppm，说明该器件具有一定的实际应用潜力。

表1是本法在对白菜叶上喷洒的对硫磷的分析结果与lc-ms/ms结果的对比数据