专利名称：黄芪多糖在制备防治有机磷农药所致血管内皮损伤的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄芪多糖的应用，具体地说，涉及黄芪多糖在制备防治有机磷农药所致血管内皮损伤的药物中的应用。
背景技术：
我国是农业大国，也是全球广泛使用有机磷农药和有机磷污染比较严重的国家之一，有机磷(OPs)农药(如对氧磷、三唑磷、辛硫磷、丙溴磷等)依然在我国农村地区大量使用。虽然大多数农民已经注意预防急性有机磷中毒，但是并未对长期低剂量接触有机磷农药对机体产生的损伤引起足够重视。目前，国外已经有研究指出，长期在温室里喷洒有机磷农药的花工或用有机磷农药浸泡羊毛的牧民，其体内对氧磷酶-1(PON1)的活性和浓度明显降低(Mackness B，Durrington P，et al.Paraoxonase and susceptibility to organophosphoruspoisoning in farmers dipping sheep.Pharmacogenetics，2003.)；另外还有研究指出，长期接触有机磷农药的人有血压增高、脂代谢紊乱、血管张力降低和心、脑血管的动脉粥样硬化早期临床表现等症状(FokinaKV，Bezuglyi VP.Role of chlora and organophosphate pesticidecompleses in the etiology of cerebral atherosclerosis.Vrach Delo，1978.)。
我们研究发现，有机磷农药能明显损伤血管内皮细胞的功能，血管内皮功能的损伤是多种血管性疾病形成的起始因素，能诱发多种血管性疾病(如大动脉炎、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变等)。因此，探讨慢性有机磷农药对机体的损伤机制并寻找有效的干预药物，对于保护我国农民的身体健康至关重要。
黄芪(Radix Astragali Seu Hedysari，RASH)是我国传统中药材，据《本草纲目》中记载，黄芪具有“益气补虚之功效”。现代药理学研究表明，黄芪有增强机体免疫功能，抗氧化、预防动脉粥样硬化，延缓衰老等作用。
发明内容
本发明的目的在于提供黄芪多糖在制备防治有机磷农药对机体慢性损伤的药物方面的新用途。
具体地说，本发明涉及黄芪多糖在制备防治有机磷农药所致血管内皮损伤的药物中的应用。
此外，还涉及黄芪多糖在制备预防和治疗因有机磷农药所致血管内皮损伤诱发的疾病的药物中的应用。
其中，所述疾病为血管性疾病，如大动脉炎、动脉粥样硬化、高血压或糖尿病血管病变等。
本发明所述有机磷农药为对氧磷、三唑磷、辛硫磷或丙溴磷等常用有机磷农药。
本发明所述药物是指以黄芪多糖为主要活性成分，与可药用载体制成的医疗上可接受的制剂，如片剂、丸剂或胶囊剂等。
本发明所述药物，其服用量以黄芪多糖计成人，40～50mg/次，3次/日；儿童，0.2～0.3mg/kg·次，3次/日，即可达到防治有机磷农药所致血管内皮损伤的效果，特别地，孕妇等特殊人群服用时需遵医嘱。
本发明所述黄芪多糖是中药黄芪的主要成分，其具有免疫调节活性，能起到抗氧化、抗肿瘤、抗细菌、抗病毒等作用，并且目前尚未发现其特殊毒性；黄芪多糖可以通过市售得到，也可以通过水提取法、碱水提取法、微波提取法或酶提取法进行提取，提取方法简单。
本发明人以对氧磷(PARA)为代表，研究了有机磷农药对机体的慢性损伤机制，发现有机磷农药诱导内皮细胞的损伤机制与机体的“氧化应激”反应有关，而“氧化应激”可以促进血管性疾病(如大动脉炎、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变等)的发生发展；并且还通过生化指标的检测，证明了PARA在损伤血管内皮功能的同时也抑制了超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加了脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)的水平，近一步证明了PARA损伤内皮细胞的作用与触发“氧化应激”和引起脂质过氧化反应有关。
本发明通过体外实验模型观察了对氧磷(PARA)对血管内皮细胞的损伤作用以及黄芪多糖抗PARA损伤作用。经研究发现，黄芪多糖的保护作用与抗氧化剂SOD作用相近，能保护PARA所损伤的血管内皮依赖性舒张反应(EDRR)、阻滞PARA所致的内皮细胞单层通透性(ECMP)的升高、阻滞血管内皮细胞凋亡及形态学的改变等，且有很好的剂量依赖性。
本发明的有益效果在于 1、本发明提供了低剂量有机磷农药对机体产生慢性损伤的直接依据，并以此寻找有效的干预药物； 2、本发明提供了黄芪多糖的新用途，其对有机磷农药所致血管内皮损伤具有很好的抑制和保护作用。黄芪多糖能抑制有机磷农药(如对氧磷)所致的血管内皮依赖性舒张反应降低，有较好的剂量依赖性；还能保护血管内皮细胞的活性、阻滞有机磷农药(如对氧磷)所致血管内皮细胞通透性的升高和形态学的改变、减少细胞凋亡；并且能保护内皮细胞释放一氧化氮的功能和超氧化物歧化酶的活性、减少脂质过氧化代谢产物丙二醛的含量； 3、本发明对长期接触有机磷农药的人员具有深远的意义，能起到保护其身体健康、提高生活质量、延长寿命等作用。
图1为本发明中各试验组内皮细胞给药30min后的细胞形态，其中，A为正常对照组；B为黄芪多糖对照组；C为PARA对照组；D为黄芪多糖低剂量保护组；E为黄芪多糖中剂量保护组；F为黄芪多糖高剂量保护组；G为SOD保护组。
图2为本发明中各试验组内皮细胞给药12h后的细胞凋亡形态，其中，A为正常对照组；B为黄芪多糖对照组；C为PARA对照组；D为黄芪多糖低剂量保护组；E为黄芪多糖中剂量保护组；F为黄芪多糖高剂量保护组；G为SOD保护组。
具体实施例方式 以下通过试验例来进一步阐述本发明的黄芪多糖的新用途及其有益效果，但不用来限制本发明的范围。
试验例1内皮依赖性舒张功能检测 1、试验材料 1.1药品与试剂黄芪多糖(长沙力康生物有限公司)，对氧磷(PARA，美国Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD，南京建成生物公司)。
1.2仪器RM6240B/C生物信号采集处理系统(成都仪器厂)；全自动定量绘图酶标仪(美国Bio-Rad公司)。
1.3供试材料及处理方法雄性Sprague Dawley大鼠(河南省实验动物中心)，体重180-220g。
将大鼠称重后腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)进行麻醉，切断双侧颈总动脉放血处死，开胸后快速取出胸主动脉置于4℃的K-H缓冲液(成分为118.3mmol/L NaCl、4.7mmol/L KCl、1.2mmol/LMgSO4·7H2O、1.2mmol/L KH2PO4、2.5mmol/L CaCl2、24.0mmol/LNaHCO3、0.03mmol/L EDTA；pH＝7.4)中，并通以95％O2+5％CO2(均为体积百分数)混合气体；分离并去除血管周围的脂肪及结缔组织，剪成3～4mm长的血管环，将血管环移至含有K-H缓冲液的浴槽内(恒温37℃，通以95％O2+5％CO2混合气体)，环的一端用不锈钢钩固定于浴槽内，另一端连生物信号采集处理系统，将血管的收缩与舒张反应通过RM6240B/C生物信号采集处理系统进行记录。
1.4统计方法所有数据以均数±标准差(
)表示。组间差异比较用ANOVA及Newman-Student多重比较；t检验分析，由SPSS11.5统计软件完成，双侧P＜0.05认为差异有显著性。
1.5试验分组及给药将上述血管环分为7组，每组6个血管环(分别来自6只大鼠)，分别为正常对照组(A)、黄芪多糖对照组(B)、PARA对照组(C)、黄芪多糖低剂量保护组(D)、黄芪多糖中剂量保护组(E)、黄芪多糖高剂量保护组(F)、SOD保护组(G)。其中，正常对照组(A)不给药，黄芪多糖对照组(B)给予10mg/mL黄芪多糖，PARA对照组(C)给予3.63μmol/L PARA，黄芪多糖低剂量保护组(D)给予黄芪多糖(0.1mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，黄芪多糖中剂量保护组(E)给予黄芪多糖(1mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，黄芪多糖高剂量保护组(F)给予黄芪多糖(10mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，SOD保护组(G)给予SOD(200U/L)+PARA(3.63μmol/L)。
2、方法与结果 将上述各组药物加入浴槽，使血管环与药物共孵30min，记录ACh引起的最大舒张百分率(Emax)及半数有效量(EC50)，将其作为测定血管环正常收缩反应和乙酰胆碱(ACh)引起的血管内皮依赖性舒张反应(EDRR)的检测指标。结果如表1所示。
表1黄芪多糖对大鼠胸主动脉血管环Emax和EC50的影响(
)
注与A组比较**P＜0.01，*P＜0.05；与C组比较△△P＜0.01，△P＜0.05 从表1可以看出大鼠离体胸主动脉血管环(EVAPVR)与PARA共孵30min后(即PARA对照组)，ACh引起的Emax显著性降低、EC50显著性升高；各黄芪多糖保护组剂量依赖性地抑制PARA引起的EDRR降低，以黄芪多糖高剂量保护组(黄芪多糖浓度为10mg/mL)作用最显著，黄芪多糖高剂量保护组的Emax值和EC50与PARA对照组比较，存在显著性差异(P＜0.05)。
试验例2体外细胞试验 1、试验材料 1.1药品与试剂实施例1提取的黄芪多糖，对氧磷(PARA，美国Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD，南京建成生物公司)，混合醋酸纤维滤膜(直径25mm、孔径0.8μm，中国上海工业研究院)，SOD试剂盒、MDA试剂盒、NO试剂盒(以上三种试剂盒均购自南京建成生物公司)，0.25％胰蛋白酶、新生小牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素(以上五种试剂均购自天津灏阳生物制品有限公司)，Hank's缓冲溶液、Wright-Giemsa混合染液、Hoechest33258荧光染色剂(以上三种试剂均购自长沙力康生物公司)。
1.2仪器针头式滤器，规格外径25mm、内径20mm(中国上海工业研究院)。
1.3供试材料及处理方法HVUECV-304人脐静脉内皮细胞株(HUVEC，长沙力康生物有限公司)。
内皮细胞培养HVUECV-304人脐静脉内皮细胞株用0.25％胰蛋白酶进行消化，然后用含有15％新生小牛血清的DMEM培养基(青霉素，100U/ml；链霉素，100U/ml；pH＝7.4)制成细胞悬液，接种于培养瓶内，置于5％(体积)CO2培养箱(37℃)中培养，每2天更换培养液一次。当内皮细胞生长至致密融合后，进行传代培养。取生长良好的第3代内皮细胞用消化液消化，弃消化液，加入培养液吹打制成细胞悬液，对悬液做细胞计数，准备接种。
滤膜制备将混合醋酸纤维微孔滤膜浸入0.5％(重量)醋酸溶液(温度为50℃)中20min后，用25℃蒸馏水冲洗两遍，然后浸入0.5g/L明胶溶液(温度为50℃)中60min，烘干后经高压蒸汽消毒，备用。
内皮细胞接种将上述制备好的滤膜置于直径30mm的六孔细胞培养板中，用2％(重量)明胶贴于孔内底面，室温下干燥3～4h；然后将计数的第3代内皮细胞接种于滤膜上(接种密度约为2×105/cm2)，继续生长8～10天，待滤膜上形成致密的内皮细胞单层后，即可用来检测内皮细胞单层通透性。
1.4统计方法所有数据以均数±标准差(
)表示。组间差异比较用ANOVA及Newman-Student多重比较；t检验分析，由SPSS11.5统计软件完成，双侧P＜0.05认为差异有显著性。
1.5试验分组及给药将载有致密的内皮细胞单层的滤膜分为7组，每组8个滤膜，分别为正常对照组(A)、黄芪多糖对照组(B)、PARA对照组(C)、黄芪多糖低剂量保护组(D)、黄芪多糖中剂量保护组(E)、黄芪多糖高剂量保护组(F)、SOD保护组(G)；在滤膜上按如下计量加入各组试验药物，然后共同孵育一定时间后按下述方法进行测定 正常对照组(A)不给药，黄芪多糖对照组(B)给予10mg/mL黄芪多糖，PARA对照组(C)给予3.63μmol/L PARA，黄芪多糖低剂量保护组(D)给予黄芪多糖(0.1mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，黄芪多糖中剂量保护组(E)给予黄芪多糖(1mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，黄芪多糖高剂量保护组(F)给予黄芪多糖(10mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，SOD保护组(G)给予SOD(200U/L)+PARA(3.63μmol/L)。
2、方法与结果 2.1内皮细胞单层通透性(ECMP)的测定 将给药30min后的滤膜用Hank's缓冲溶液(HBSS)冲洗2次，置于针头式滤器内(有效滤过面积S＝3.14cm2)。针头式滤器上孔接长颈储液瓶(上腔)，下孔接量筒(下腔)。上腔中加入5g/L白蛋白液(液面距离滤膜高度维持在25cm)，蛋白液通过液体流动产生的牵引作用透过滤膜进入下腔，平衡5min后，收集5-10min滤出液，测量滤出液容积，计算滤出液生成速度(Jv)、内皮单层滤过系数(Kf)和渗透压反射系数(σ)。
Jv值、Kf值和σ值是反映ECMP的指标。Jv表示单位时间内从单位面积内皮细胞单层上滤出的液体量，可间接反映内皮细胞单层通透性，Jv值越大，通透性越高；Kf是内皮细胞单层通透性的参数，直接反映内皮细胞单层通透性，Kf值越大，通透性越高；σ值指渗透压反射系数，反映的是内皮单层对大分子物质的通透性，σ值越小，通透性越高。结果如表2所示。
表2黄芪多糖对PARA所致人脐静脉内皮细胞的ECMP增加的保护作用(
)
注与A组比较**P＜0.01，*P＜0.05；与C组比较△△P＜0.01，△P＜0.05 从表2可以看出，PARA对照组的ECMP显著性升高，各黄芪多糖保护组剂量依赖性地抑制PARA引起的ECMP升高，以黄芪多糖高剂量保护组(黄芪多糖浓度为10mg/mL)作用最显著，黄芪多糖高剂量保护组的Jv、Kf、σ值与PARA对照组比较，存在显著性差异(P＜0.05)。
2.2细胞培养液中超氧化物岐化酶(SOD)、脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)及NO含量的测定 取不同处理组给药30min后的细胞培养液(含有15％新生小牛血清的DMEM培养基及各组药物)100μL，按试剂盒说明分别检测SOD活性、MDA及NO的含量。结果如表3所示。
表3黄芪多糖对细胞培养液中生化指标的影响(
)
注与A组比较**P＜0.01，*P＜0.05；与C组比较△△P＜0.01，△P＜0.05 从表3可以看出，PARA导致了细胞培养液中MDA含量显著性升高，SOD活性和NO含量显著降低，且与正常对照组比，差异均有统计学意义(P＜0.05)；各黄芪多糖保护组剂量依赖性地抑制PARA的损伤作用，以黄芪多糖高剂量保护组(黄芪多糖浓度为10mg/mL)作用最显著，黄芪多糖高剂量保护组的MDA、SOD、NO值与PARA对照组比较，存在显著性差异(P＜0.05)。
2.3内皮细胞形态学的观察(黄芪多糖对内皮细胞形态的影响) 取给药30min后的滤膜上的内皮细胞单层，用HBSS洗2次，然后用2％甲醛和1％戊二醛(均为重量百分数)混合液固定10min，然后经Wright-Giemsa常温下染色5min后用蒸馏水冲洗二遍，置于载玻片上用倒置显微镜观察。结果如图1所示。
结果表明，PARA导致了内皮细胞呈萎缩状改变，胞核深染，细胞间隙变宽；各黄芪多糖保护组明显抑制了PARA对内皮细胞形态学的改变，以黄芪多糖高剂量保护组(黄芪多糖浓度为10mg/mL)作用最显著。
2.4黄芪多糖对内皮细胞形态的影响 将5×105个内皮细胞与各组药物共孵12h后，弃去培养液，收集细胞，用消化液(0.25％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸按照1∶1的体积比配制)进行消化，得到细胞悬液；滴加细胞悬液于载玻片上，制成单细胞层；然后在4℃的温度下，用甲醇与冰醋酸的体积比3∶1的混合液固定5min；最后用5mg/L的Hoechest33258闭光染色5min，在紫外光激发下，用荧光显微镜观察。因为Hoechest33258只与DNA结合，故RNA及胞浆均不着色，从而便于观察以细胞核改变为主的凋亡细胞，结果如图2所示。
结果表明，PARA明显导致了内皮细胞凋亡，凋亡细胞核体积缩小，大小不一，染色不均匀，呈颗粒、块状浓染；各黄芪多糖保护组明显抑制PARA导致的内皮细胞凋亡，胞大多数呈大小较一致的圆形，染色呈均匀蓝色，为正常细胞核形态，以黄芪多糖高剂量保护组(黄芪多糖浓度为10mg/mL)作用最显著。
从以上各试验例可以看出，黄芪多糖能抑制有机磷农药(如对氧磷)所致的血管内皮依赖性舒张反应降低，有较好的剂量依赖性；还能保护血管内皮细胞的活性、阻滞有机磷农药(如对氧磷)所致血管内皮细胞通透性的升高和形态学的改变、减少细胞凋亡。黄芪多糖对有机磷农药所致血管内皮损伤具有很好的抑制和保护作用，用于制备防治有机磷农药所致血管内皮损伤的药物；还可以用于制备预防和治疗由有机磷农药所致血管内皮损伤诱发的疾病的药物。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案以及试验例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，所属领域的普通技术人员可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.黄芪多糖在制备防治有机磷农药所致血管内皮损伤的药物中的应用。
2.黄芪多糖在制备预防和治疗因有机磷农药所致血管内皮损伤诱发的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病为血管性疾病。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述血管性疾病为大动脉炎、动脉粥样硬化、高血压或糖尿病血管病变。
全文摘要
本发明提供了黄芪多糖在制备防治有机磷农药所致血管内皮损伤的药物中的应用，还提供了黄芪多糖在制备预防和治疗因有机磷农药所致血管内皮损伤诱发的疾病的药物中的应用。本发明经药理试验验证，黄芪多糖能抑制有机磷农药所致的血管内皮依赖性舒张反应降低，有较好的剂量依赖性；还能保护血管内皮细胞的活性、阻滞有机磷农药所致血管内皮细胞通透性的升高和形态学的改变、减少细胞凋亡；并且能保护内皮细胞释放一氧化氮的功能和超氧化物歧化酶的活性、减少脂质过氧化代谢产物丙二醛的含量。
文档编号A61K31/715GK101810635SQ20101014867
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者李鹏, 尹雅玲, 郭兰青, 张小毅, 海广泛, 荆云, 潘国聘, 王倩倩, 孙彭利 申请人:新乡医学院