一种饮料中玫瑰红B的快速检测方法与流程

本发明涉及一种快速检测方法，具体涉及一种基于自制银丝基底的饮料中玫瑰红b的表面增强拉曼光谱检测方法。

背景技术：

为降低成本、赋予食品诱人的外观、稳定色泽，某些生产商在食品生产过程中违法使用非食用工业色素，它们主要是以苯、甲苯、萘等芳烃类化工产品为原料，经过磺化、硝化、卤化、偶氮化一系列有机反应化合而成，大多具有一定的毒性。为此，卫生部于2008年印发了“食品中可能违法添加的非食用物质名单(第一批)”通知，列出了6种严禁添加的非食用色素，其中，应用最普遍的红色非食用色素为玫瑰红b。

玫瑰红b，又名四乙基罗丹明和碱性玫瑰精，是一种具有鲜桃红色的人工合成的碱性荧光染料；由间羟基二乙基苯胺与邻苯二甲酐缩合制得，通常应用的是它的氯化物。因其具有高毒、高残留和致癌、致畸、致突变等特点，1993年起欧美、日本等国家和地区就已明令禁止玫瑰红b用于食品加工过程中。

目前，食品中玫瑰红b的测定方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、分光光度法等。但是，以上检测方法前处理操作较为复杂、耗时，仪器成本昂贵，且所用溶剂、流动相具有较大的毒性和腐蚀性等缺点，难于普及推广。因此，探索快速、简便、高效的食品色素检测方法，建立有效的安全监控体系，具有非常紧迫的现实意义。

拉曼光谱和红外光谱一样同属于分子振动光谱，可以反映分子的特征结构。但是拉曼散射效应是个非常弱的过程，要对表面吸附物种进行拉曼光谱研究几乎都要利用某种增强效应。自从表面増强拉曼效应被人们发现之后，金属纳米颗粒就作为一类sers基底被广泛的研究，悬浮液中的金属纳米颗粒是sers基底的最重要的材料之一，然而溶液中的纳米颗粒聚集会带来重复性差的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种饮料中玫瑰红b的快速检测方法。该方法中饮料样品经微孔滤膜过滤后，无需固相萃取等净化前处理，直接采用自制的表面具有多孔纳米银结构的表面增强拉曼基底对目标物玫瑰红b进行萃取和原位表面增强拉曼检测。该方法操作简单、快速高效、重现性好、准确率高。

本发明所采用的技术方案为：一种饮料中玫瑰红b的快速检测方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)样品制备：含二氧化碳的样品需超声除去二氧化碳，含果肉的样品需摇匀，微孔滤膜过滤，得到待测液，备用；

(2)表面增强拉曼基底的制备：将银丝依次浸入有机溶剂、超纯水、酸溶液中进行表面处理；以经表面处理的银丝为工作电极，采用电化学池在-0.2v～0.2v电位范围内进行电化学反应使银丝表面生成均一多孔纳米银，即得到具有均一多孔纳米银结构的表面增强拉曼银丝基底；

(3)测试：将表面增强拉曼银丝基底浸入待测液中静置萃取，然后置于载体上进行表面增强拉曼光谱测试；

(4)定性：经表面增强拉曼光谱测试，再与玫瑰红b的标准拉曼光谱数据对比，当616，732，1007，1073，1196，1277，1357，1503，1647cm^-1处存在玫瑰红b的明显特征拉曼峰时，则样品中含有玫瑰红b；

(5)定量：以1277cm^-1处的特征拉曼峰作为定量峰，根据玫瑰红b的拉曼光谱信号的响应强度与含量的线性比例关系得到标准曲线方程，从而对样品中的玫瑰红b进行快速定量检测。

本发明步骤(2)的银丝直径为0.3-1mm，长度为1-8cm。

本发明步骤(2)的有机溶剂为丙酮、正己烷或乙醇中的一种或几种，优选先浸入丙酮中，再浸入乙醇中进行表面处理。

本发明步骤(2)的酸溶液为0.1m硝酸或盐酸。

本发明步骤(2)的电化学池为三电极，银丝为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钛桶电极为辅助电极。优选自制的三电极电化学池。

本发明包含有上述三电极电化学池的电化学制备装置，包括铁架台、电化学池和与电化学池相连的电化学工作站，电化学池包括参比电极、辅助电极、工作电极、玻璃容器；其特征是，还包括用于固定电极的固定支架；在所述的铁架台上设置有用于控制工作电极在电化学池里的深度的升降机构；

升降机构包括齿轮、微型电机、控制器、升降杆、设置在升降杆上的高度传感器、夹持架、操作屏；在升降杆上均匀设置有凹槽；所述的控制器的控制端与微型电机相连，微型电机的转轴与齿轮相连，齿轮的齿牙与升降杆的凹槽相啮合；夹持架与升降杆相固定；操作屏固定在铁架台上，高度传感器和操作屏分别与控制器相连；

所述的辅助电极为钛制成的筒壁状电极，筒壁状电极与电化学池的玻璃容器的内壁紧密结合；在筒壁状电极的顶部边缘延伸出一把手(钛制)，所述的把手与电化学工作站电连接。

进一步地，所述的控制器包括stc11f60xe单片机。

进一步地，在工作电极的顶部夹有一导电夹，导电夹通过铜丝与电化学工作站相连。

进一步地，所述的固定支架和夹持架采用绝缘材料。

优选的，步骤(2)表面增强拉曼基底的制备：将直径为0.3-1.0mm的银丝裁剪成1-8cm，依次浸入丙酮、乙醇、超纯水、0.1m硝酸中进行表面处理，最后超纯水清洗、干燥备用；采用上述的三电极电化学池，银丝为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钛桶电极为辅助电极，0.1m盐酸为电解液，在-0.2v～0.2v电位范围内以5-100mv/s的速度进行10-20次电化学反应，制备具有均一多孔纳米银结构的表面增强拉曼银丝基底，制备好的银丝清洗、干燥备用。

步骤(3)的萃取时间为1-10分钟，优选为8分钟。

载体为玻璃片或钛片。

所述的仪器参数条件如下：拉曼光谱仪发射激光波长为785nm，固定激光功率为100-200mw，扫描范围2000～300cm^-1，积分时间为2-10s，每个点扫描5次取平均值。

所述步骤(4)中玫瑰红b的标准拉曼光谱为：理论计算辅助标准样品拉曼测试多手段获取得到玫瑰红b的标准拉曼光谱。

本发明采用电化学粗糙法，将银丝电极放置在电解质溶液中并施加一定的电化学信号，使银丝电极表面发生氧化还原反应，进而让银丝电极表面生成多孔纳米银，通过纳米颗粒均匀分布在银丝上，克服了溶液中的纳米颗粒聚集会带来重复性差的问题。同时本发明的辅助电极为钛制筒壁状结构，与玻璃容器内壁紧密贴合，且带一把手与电化学工作站电连接，可保证金属电极表面的横向、径向均匀腐蚀，克服了传统的辅助电极难以保证表面增强拉曼金属基底轴向和径向反应的均匀性。本发明通过升降机构自动控制工作电极进入液体的深度，确保实验的准确性，减小误差。本发明工作电极通过一导电夹与电化学工作站连接，能适应多种状态的工作电极，且代替了传统电化学反应中工作电极的液面以上部分，大大提高了粗糙金属电极的产出率。

本发明的有益效果：

(1)本发明饮料样品经微孔滤膜过滤后，无需固相萃取等净化、浓缩前处理，样品前处理简单、耗材成本低廉；

(2)本发明采用自制的三电极电化学池，可以制得横向、径向均匀的多孔纳米银结构的表面增强拉曼银丝基底；由于多孔纳米银是在银丝表面生成的，轴向、径向均匀可以保证检测结果的重复性，克服了现有不使用载体时悬浮液中的纳米颗粒聚集带来的重复性差的问题；采用自制的均一、多孔纳米银结构的表面增强拉曼银丝基底可对目标物玫瑰红b进行选择性萃取和原位表面增强拉曼检测；

(3)理论计算辅助标准样品拉曼测试多手段获取玫瑰红b的标准拉曼光谱数据，以对实际样品中目标物进行准确的定性、定量检测。

本发明方法简单、快速、准确，表面增强拉曼基底成本低，便于携带、存放，可用于现场快速监测。

附图说明

图1为循环伏安曲线，其中(a)i-e曲线，(b)e-t曲线，(c)q-t曲线及(d)i-t曲线，扫描速度为25mv/s，扫描圈数为15次；

图2为不同扫描速度制备的多孔银纳米结构sem图(插图为粒径统计直方图)，其中(a)5mv/s，(b)10mv/s，(c)25mv/s，(d)50mv/s，(e)75mv/s，(f)100mv/s，扫描范围-0.2～0.2v，循环数15次；

图3为银丝基底的xrd图和eds图，其中(a)为银丝基底的xrd图，(b)多孔银丝的eds选区形貌图，(c)选区内元素eds光电子能谱图；

图4为玫瑰红b的分子结构优化图；

图5为玫瑰红b的理论计算拉曼光谱(a)和固体标准品实验拉曼光谱(b)的比较；

图6为银丝基底萃取1.0×10^-6m玫瑰红b在萃取时间8分钟的sers光谱图；

图7为银丝基底萃取1.0×10^-6m玫瑰红b在萃取时间0.5-12min的吸附曲线；

图8为不同浓度(自上往下浓度分别为：1×10^-5m、5×10^-6m、2.5×10^-6m、1×10^-6m、5×10^-7m、2.5×10^-7m、5×10^-8m、2.5×10^-8m、5×10^-9m)玫瑰红b标准溶液的sers图谱；

图9为sers1277cm^-1特征峰处监测玫瑰红b的吸附曲线(5×10^-9-1×10^-5m)；

图10为sers1277cm^-1特征峰的校准曲线(5×10^-8-2.5×10^-6m)；

图11为阳性番茄混合果蔬汁饮料样品中玫瑰红b的sers图谱；

图12为阳性可乐样品中玫瑰红b的sers图谱。

图13为电化学制备装置结构示意图；

图中：1、铁架台，11、玻璃容器，12、固定支架，2、参比电极，3、辅助电极，31、把手，4、工作电极，41、导电夹，411、铜丝，51、齿轮，52、升降杆，53、夹持架，54、操作屏，6、电化学工作站。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。

如图13所示，电化学制备装置，包括铁架台1、电化学池和与电化学池相连的电化学工作站6，电化学池包括参比电极2、辅助电极3、工作电极4、玻璃容器11、用于固定电极的固定支架12；在所述的铁架台1上设置有用于控制工作电极在电化学池里的深度的升降机构。

其中升降机构包括齿轮51、微型电机、控制器、升降杆52、设置在升降杆上的高度传感器、夹持架53、操作屏54；在升降杆52上均匀设置有凹槽；控制器的控制端与微型电机相连，微型电机的转轴与齿轮51相连，齿轮的齿牙与升降杆的凹槽相啮合；夹持架53与升降杆52相固定，操作屏54设置在铁架台上，高度传感器和操作屏分别与控制器相连。手动控制工作电极进入液体的深度时，在固定的同时，工作电极浸入液体的长度总会过高或过低，使实验数据不准确；通过升降机构自动控制工作电极进入液体的深度，确保实验的准确性，减小误差。

固定支架和夹持架采用绝缘材料。控制器包括stc11f60xe单片机。

辅助电极3为钛制成的筒壁状电极，筒壁状电极与电化学池的玻璃容器的内壁紧密结合；在筒壁状电极的顶部边缘延伸出一把手31，把手31与电化学工作站6电连接。辅助电极与玻璃容器内壁紧密贴合，且带一把手与电化学工作站连接，可保证金属电极表面的均匀腐蚀，确保了表面增强拉曼金属基底轴向和径向反应的均匀性，克服传统的辅助电极难以保证表面增强拉曼金属基底轴向和径向反应的均匀性的问题。

在工作电极4的顶部夹有一导电夹41，导电夹41通过铜丝411与电化学工作站6相连；实际操作中可将导电夹加持在高出液面2-3mm处。本发明采用导电夹可以适应多种工作电极，如纸片状电极；工作电极通过一导电夹与电化学工作站连接，代替了传统电化学反应中工作电极的液面以上部分，大大提高了粗糙金属电极的产出率。

工作过程为：将需要进行反应的工作电极4用导电夹41夹住，用夹持架53夹住铜丝411，通过操作屏54输入工作电极需要进入液体的深度；控制器控制微型电机的转动，微型电机控制齿轮51转动，齿轮51控制升降杆52的升降，从而控制工作电极浸入液体的深度。高度传感器检测升降杆52的升降高度，当升降高度与设置的高度相等时，控制器控制微型电机停止转动。

1仪器与试剂

拉曼光谱仪：oceanopticsqe65pro拉曼光谱仪；感量为0.1mg的分析天平(瑞士梅特勒公司)；milli-q纯水器(美国millipore公司)；jeoljsm-6700f冷场扫描电子显微镜；x射线能量色散谱(英国oxfordinstruments)；brukerd8x射线粉末衍射仪(德国布鲁克)。

高纯银丝(直径0.3-1.0mm，99.99％，)来源于北京有色金属与稀土利用研究所；甲醇：色谱纯(merk公司)；乙醇：色谱纯(merk公司)；丙酮：色谱纯(merk公司)；正己烷：色谱纯(merk公司)；盐酸、硝酸：分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；玫瑰红b标准品：97.0％，德国sigma。番茄混合果蔬汁饮料(配料表：水、番茄酱、浓缩苹果汁、番茄浆、浓缩橙汁)。

2仪器条件

激光拉曼光谱仪测定条件：激光波长785nm，激光最大强度200mw，扫描范围2000～300cm^-1，积分时间5s，积分2次。每个样品至少扫描5次，以得到准确的拉曼光谱图。

多孔银纳米结构的电子显微镜形貌测定：5.0kv的加速电压。

3样品制备

称取20.0-40.0g样品，含果肉的样品需摇匀，微孔滤膜过滤，待测。

4表面增强基底的制备

直径为0.3-1.0mm的银丝裁剪成1-8cm，依次浸入丙酮、乙醇、超纯水、0.1m硝酸中4-8分钟进行表面处理，最后超纯水清洗、干燥备用。电化学实验采用自制的三电极电化学池，银丝为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，大面积钛桶电极为辅助电极，0.1m盐酸为电解液、在-0.2v～0.2v电位范围内以5-100mv/s的速度进行10-20次电化学反应，制备具有均一多孔纳米银结构的表面增强拉曼银丝基底，制备好的银丝清洗、干燥备用。

5基底表征

多孔银纳米结构的形貌采用冷场扫描电子显微镜(sem，jeoljsm-6700f)以5.0kv的加速电压进行表征，银纳米结构物相及结晶状况分析采用x射线能量色散谱(eds，oxfordinstruments)和x射线粉末衍射仪(xrd，brukerd8)进行。表面形貌利用原子力显微镜(afm,multimode,veecoinstruments)表征并进行粒径分析。

6标准拉曼光谱数据库的建立

用gaussianw03程序对玫瑰红b进行逐步优化并对最优结构进行拉曼频率的理论计算，得出理论特征谱图；利用拉曼光谱仪对玫瑰红b固体标准品进行扫描，得到固体标品特征谱图。

7测试

将表面增强拉曼基底浸入待测液中静置萃取1-10分钟后，置于钛片上进行表面增强拉曼光谱测试。

7结果与讨论

7.1电化学制备多孔银层纳米结构

采用循环伏安法，以25mv/s扫描速度在-0.2～0.2v范围，循环扫描15圈的i-e曲线，e-t曲线，q-t曲线及i-t曲线分别如图1a、b、c、d所示。由图1a可以观察到，从-0.2到0.2v扫描过程中，在0.185v处出现银的阳极氧化峰，回扫过程中在-0.095处出现银离子的阴极还原峰。在这个连续扫描过程中，氧化和还原峰高逐渐增大，银丝表面发生了连续的溶解和析出。随着循环圈数的增加，工作电极的氧化还原电流及电荷量是逐渐增大(图1cq-t曲线和图1di-t曲线)，当循环圈数达到12圈以后，电流及电荷量变化趋于平稳，证明银丝表面的溶解析出和还原沉积过程达到平衡，电极表面积达到最大，粗糙化处理完成。

7.2多孔银层纳米结构的表征

扫描速度是影响极化过电位的重要参数，过电位绝对值的高低直接决定界面电化学过程中电子传递的快慢。因此，扫描速度的快慢直接影响多孔银纳米结构的尺寸和性质。在此，考察了不同扫描速度下对银纳米结构的形貌的影响，我们选取了扫描速度分别为5mv/s，10mv/s，25mv/s，50mv/s，75mv/s，100mv/s时，多孔银纳米结构的sem结果如图2所示，扫描电势范围为-0.2到0.2v，扫描圈数为15次的sem图。随着扫描速度的增大，多孔银结构中的银纳米颗粒的平均粒径逐渐减小，根据插图中的粒径统计直方图，最大平均粒径依次为254.2nm，192.0nm，127.8nm，109.5nm，107.1nm，101.2nm。这个现象的原因可以归结为，在相对较慢的扫描速度下(5mv/s)，电子传递速度较慢，可以保证纳米颗粒成长为大直径的颗粒，而随着扫速增大，电子传递速度加快，相同时间内成核中心的数量增大才能保证电子交换的速度与电位增加的速度匹配，所以导致颗粒尺寸较小。但是，高的电子传递速度，甚至超过了扩散传质的速度，因此银离子还原的速度小于其银原子氧化的速度，导致还原不充分，多孔银纳米结构层出现不均匀。从图2可以看出：在扫描速度为25mv/s时(图2c)，多孔银纳米结构粒度最好。

在图3a的xrd图谱中可以看到，衍射峰与ag(jcpdsno.04-0783)的峰相匹配，证明多孔纳米结构是有银单质的构成，同时，可以清晰的识别(111)，(200)，(220)，(311)晶面的衍射峰，证明了纳米结构具有很好的结晶性。eds分析结果进一步印证了，多孔纳米结构由ag元素组成。以上结果表面，采用电化学制备的多孔银纳米结构主要由银单质构成，粗糙化过程未造成多孔结构表面产生氧化银。

7.3理论拉曼光谱计算及振动模式的归属

对玫瑰红b分子用gaussian03程序进行逐步优化并对最优结构进行拉曼频率的理论计算，分子结构优化结果如图4所示，计算结果文件及分子构型通过gaussview5观察和分析，分子结构的理论拉曼光谱计算结果校正后与固体标准品实验拉曼光谱呈现高匹配度(图5，表1)。

表1玫瑰红b的理论拉曼光谱(dft)和固体标准品实验拉曼光谱(nrs)主要峰比对

7.4定性定量方法的建立以及实际样品检测

7.4.1定性检测

对玫瑰红b的定性检测可选择它的特征峰作为鉴定标准，616，732，1007，1073，1196，1277，1357，1503，1647cm^-1处峰强度较高(图6)，所以选定以上九个峰为定性峰。

7.4.2定量检测

7.4.2.1玫瑰红b的sers响应

纳米结构的差异会显著影响吸附分子的sers响应，因此，我们考察了玫瑰红b在不同扫速条件下制备的porousag上的sers响应。玫瑰红b在不同扫速制备的porousag基底上的增强效果不同，其趋势是随着扫描速度的增加，增强效果逐渐增强，当扫速为25mv/s时，增强效果达到最大值，然后随着扫速的继续增加而逐渐降低。本文采用25mv/s时得到的银丝基底进行方法学考察。

7.4.2.2萃取条件优化

本实验中采用静置直接萃取法，为了获得最佳萃取效果，对平衡时间进行了优化。为了选择最佳萃取时间，我们考察了1.0×10^-6m玫瑰红b的sers特征峰强度与萃取时间的动力学曲线。将porousag萃取丝浸入1.0×10^-6m的玫瑰红b萃取工作液中，间隔不同时间连续采集萃取丝上sers光谱，如图7所示，玫瑰红b萃取时间超过8min后，特征峰强度不再增加趋于平衡，选择最佳萃取时间为8min。

7.4.2.3检出限及线性

在最佳条件情况下，将porousag萃取丝浸入一系列浓度的玫瑰红b化合物进行萃取8min，达到平衡后得到图8的系列溶液sers光谱数据，由结果可见，当玫瑰红b溶液的浓度降至5×10^-9m时1007，1196，1277，1357，1647cm^-1等峰仍能看出有sers增强峰的存在，此浓度作为方法的检出限。取1277cm^-1处的一系列sers峰来做峰强度与玫瑰红b浓度的平衡吸附曲线(图9)和线性关系曲线(图10)。

7.4.3实际样品sers检测与hplc-ms/ms方法的比对

选取番茄混合果蔬汁饮料添加玫瑰红b、萘酚黄、酸性紫6b、喹啉黄制作代表性阳性样品，微孔滤膜过滤后进行上述原位萃取sers方法进行检测，结果如图11所示曲线，616，732，1007，1073，1196，1277，1357，1503，1647cm^-1处的sers峰与玫瑰红b粉末标准物质的拉曼峰基本是一致的，可以确认本发明的sers检测出番茄混合果蔬汁饮料中玫瑰红b的存在，其含量为63.3μg/l，添加的萘酚黄、酸性紫6b、喹啉黄未对目标物玫瑰红b产生干扰。为了验证上述方法的准确性，对上述样品进行固相萃取前处理后采用液相色谱-串联四级杆质谱法对其中玫瑰红b进行检测，比对结果见表2。

表2番茄混果合蔬汁饮料样品的检测结果

由对比结果可以看出，sers检测方法可以在保证准确性的前提下，节省检测时间、操作简便，相比液相色谱-串联质谱检测方法避免复杂费时的前处理及有机流动相的污染、节省检测成本，sers增强基底可低成本自制且便于携带、适用于批量样品的现场快速检测。

实施例1：

可乐样品中玫瑰红b的快速检测方法

1、待测样品：可乐(配料表：水、果葡糖浆、白砂糖、二氧化碳、焦糖色、磷酸、咖啡因、食用香精)。

2、样品制备：称取30.0g样品添加玫瑰红b、偶氮玉红制作代表性阳性样品，因含二氧化碳需超声除去二氧化碳，微孔滤膜过滤，待测。

3、表面增强基底的制备

直径为0.7mm的银丝裁剪成5cm，依次浸入丙酮、乙醇、超纯水、0.1m硝酸中进行表面处理，最后超纯水清洗、干燥备用。电化学实验采用自制的三电极电化学池，银丝为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，大面积钛桶电极为辅助电极，0.1m盐酸为电解液、在-0.2v～0.2v电位范围内以25mv/s的速度进行15次电化学反应，制备具有均一多孔纳米银结构的表面增强拉曼银丝基底，制备好的银丝清洗、干燥备用。

4、测试：将制备好的表面增强拉曼银丝基底浸入待测液中静置萃取10分钟，然后置于载体上进行表面增强拉曼光谱测试；激光拉曼光谱仪测定条件：激光波长785nm，激光最大强度200mw，扫描范围2000～300cm^-1，积分时间5s，积分2次。每个样品至少扫描5次，以得到准确的拉曼光谱图。

5、结果：结果如图12所示曲线，616，732，1007，1073，1196，1277，1357，1503，1647cm^-1处的sers峰与玫瑰红b粉末标准物质的拉曼峰基本是一致的，可以确认本发明的sers检测出可乐样品中玫瑰红b的存在，其含量为332.6μg/l，添加的偶氮玉红未对目标物玫瑰红b产生干扰。为了验证上述方法的准确性，对上述样品进行固相萃取前处理后采用液相色谱-串联四级杆质谱法采用液相色谱-串联质谱法对其中玫瑰红b进行检测，比对结果见表3。

表3可乐样品的检测结果