一种OPN、GDF15、NSE、TRAP5和OPG联合诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及诊断试剂盒
技术领域：
，具体地说，是一种通过检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg含量来联合诊断早期肝癌的试剂盒，为肝癌的早期诊断提供新方法和试剂盒。
背景技术：
：肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌是世界第六大最常见癌症，每年新发病人782500例，死亡745500例，也是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤。其发病率存在明显地理性差异，绝大多数的肝癌病例发生在发展中国家，但北美和欧洲的发病率也在不断上升。肝细胞癌的高度异质性导致难以单独采用化疗清除癌细胞，同时手术切除和肝移植也仅限于早期诊断的肝癌。由于大多数肝癌患者诊断时已是中晚期，并且术后频频复发转移，导致肝癌患者的预后较差。肝癌的发病率高、死亡率高、并且缺乏有效的治疗手段，因此肝癌的早期诊断对肝癌病人治疗效果及生存质量有极为重大的意义。肝癌的早期诊断成了增加治疗可行性的关键要素。目前临床上肝癌诊断的方式多样，主要分为影像学检查和生化检测，例如：超声、ct、pet-ct、核磁共振检查以及甲胎蛋白检测等。临床影像学检查是早期肝癌的常用检查方法，可明确肿瘤的大小、形态与部位，诊断准确率高，但对人体有射线辐射伤害，不宜在短时间内做重复性检查，费用较高，而且检查容易受到检查者经验、手法和细致程度等主观因素的影响。血清肿瘤标志物的检测是肿瘤诊断的常用方法之一，具有简便无创、测定结果定量客观、可重复测定以便动态监测、费用低廉等优点。甲胎蛋白(afp)是诊断肝癌的首选血清肿瘤标志物，已被广泛应用于高危人群的普查、诊断、预后效果评价等方面，但由于高分化和低分化的肝癌细胞均不合成afp，其敏感性和特异度远远不能满足临床诊断的要求，因此，需要进行肝癌早期血清肿瘤标志物的深入探讨。骨桥蛋白(osteopontin，opn)是一种分泌型糖蛋白，在机体发育或某些病理过程中可由多种细胞合成和分泌，在骨矿化、骨的吸收与形成、细胞趋化、黏附和迁移、免疫调节、信号传导、抑制细胞凋亡等过程中发挥重要作用。近年来研究表明，opn与多种肿瘤细胞生长、增殖、浸润、转移和预后密切相关，是一种新型肿瘤标志物，可作为抗癌治疗的候选靶点。生长分化因子-15(growthdifferentiationfactor-15，gdf15)属于转化生长因子β家族，也被称为巨噬细胞抑制细胞因子1(mic-1)。gdf15是最初在巨噬细胞中发现的蛋白分子量为25kda的蛋白质，但后面研究发现在上皮组织和血浆中也会存在。近年来，gdf15已经成为心血管疾病，糖尿病，肾功能衰竭和几种恶性肿瘤的生物标志物。gdf15水平升高与疾病严重程度和预后不良相关。神经元特异烯醇化酶(neuron-specificenolase，nse)是一种糖酵解烯醇化酶的细胞特异性同工酶，主要存在于神经组织和神经分泌性组织中，分子量80kd。近年来，nse被报道能够满足肿瘤细胞代谢需求促进其增殖，并参与肌动蛋白重塑促进肿瘤细胞迁移和侵袭，可作为小细胞肺癌、脑肿瘤等的血清肿瘤标志物。trap5也称为5型酸性磷酸酶，该酶是一种结构高度保守的含铁糖蛋白，trap5主要存在于巨噬细胞、破骨细胞、gaucher细胞、红细胞、血小板、脾脏毛状细胞以及单核吞噬细胞中,但在肺泡巨噬细胞和破骨细胞中含量最丰富。在正常人血清中,trap5以两种不同的糖基化形式存在,即trap–5α和trap-5β。各种恶性肿瘤转移至骨引起溶骨性损伤,则血清中的trap-5β明显升高，故测定血中的trap-5β可作为癌症骨转移早期诊断的筛选试验。骨保护素(osteoprotegerin，opg)是一种分泌性蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族，又被称为破骨细胞发生抑制因子。其可抑制肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，trail)与死亡受体4，5(deathreceptor4，dr4；deathreceptor5，dr5)的结合，使肿瘤细胞抗凋亡。可作为前列腺癌、乳腺癌等骨转移的诊断标志物。所以，如果能有一种检测试剂盒，可以提高早期肝癌的检出率和准确率，对于肝癌的临床治疗有着重大的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供opn、gdf15、nse、trap5和opg在制备诊断早期肝癌的试剂或试剂盒中的应用。本发明的另一目的是提供一种通过检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg含量来联合诊断早期肝癌的试剂或试剂盒，及其相应的检测方法。本发明的第一方面，提供一组能够诊断早期肝癌的标志物，包括骨桥蛋白(osteopontin，opn)、生长分化因子-15(growthdifferentiationfactor-15，gdf15)、神经元特异烯醇化酶(neuron-specificenolase，nse)、5型酸性磷酸酶(trap5)和骨保护素(osteoprotegerin，opg)。本发明的第二方面，提供opn、gdf15、nse、trap5和opg在制备诊断早期肝癌的检测试剂或试剂盒中的应用。所述的检测试剂或试剂盒通过检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg的含量诊断早期肝癌。所述的检测试剂为检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg的含量的试剂的组合。所述的检测试剂盒包含检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg的含量的试剂。本发明的第三方面，提供一种诊断早期肝癌的opn、gdf15、nse、trap5和opg联合检测试剂盒。所述的试剂盒通过检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg含量来联合诊断早期肝癌。所述的试剂盒包含检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg的含量的试剂。所述的试剂盒是以液相蛋白芯片方法检测生物样品血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg表达的试剂盒。在本发明的一个优选实施例中，本发明的试剂盒，具体组成如下：(a)opn、gdf15、nse、trap5和opg检测抗体bead；(b)实验标准品及质量控制品1和质量控制品2；(c)血清或血浆基质，assaybuffer，washbuffer，bead稀释液；(d)检测抗体，藻红蛋白链酶亲和素，实验对应的96孔板。本发明的第四方面，提供一种利用上述诊断早期肝癌的opn、gdf15、nse、trap5和opg联合检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(a)抽取待测者的外周血1ml到edta抗凝管，离心获取血浆，直接进行检测或冻存在-80℃备检；(b)将上述血浆利用luminexxmap技术进行实验检测，得到的浓度值用xponent软件进行分析，从而推断出待测者原始的血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg的浓度含量；(c)将血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg的浓度含量统计换算之后放入得出的公式计算，计算出待测者罹患肝癌的可能性；所述的公式为：logitp＝-5.672+2.54*opn_g+1.402*gdf15_g+2.279*nse_g+1.298*trap5_g+1.704*opg_g在上面公式中，当logitp大于0.5时，判断样本为早期肝癌，否则非早期肝癌。优选的，所述步骤(a)待测者外周血的处理：收取血浆样本时应使用edta抗凝管，抽取待测者血液后30分钟内1000xg离心10分钟收集血浆；收取血清样本时应在抽取待测者血液后静置至少30分钟，然后1000xg离心10分钟收集血清。收集的血浆冻融次数应少于3次。优选的，所述步骤(b)所使用的luminexxmap技术。根据luminexxmap技术标准化规范化的流程，整个实验过程必须严格按照流程进行。本发明优点在于：本发明涉及一种通过检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg含量来联合诊断肝癌的试剂盒，可以通过定量检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg的含量，能够用于肝癌的早期诊断，治疗过程中的疗效评估及其治疗后的转移复发监控，检测结果早于临床症状。试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，本试剂和检测技术成熟，与传统方法相比，周期短、特异性好。附图说明图1利用液相蛋白芯片技术检测血浆中trail含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图2利用液相蛋白芯片技术检测血浆中leptin含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图3利用液相蛋白芯片技术检测血浆中hgf含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图4利用液相蛋白芯片技术检测血浆中opn含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图5利用液相蛋白芯片技术检测血浆中opg含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图6利用液相蛋白芯片技术检测血浆中gdf15含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图7利用液相蛋白芯片技术检测血浆中nse含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图8利用液相蛋白芯片技术检测血浆中trap5含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图9利用液相蛋白芯片技术检测血浆中ykl40含量来诊断早期肝癌的roc曲线。图10利用液相蛋白芯片技术检测血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg含量来联合诊断早期肝癌的roc曲线。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例11、检测试剂盒的制备按如下组成制备检测试剂盒，该试剂盒适于以液相蛋白芯片方法检测生物样品血浆中opn、gdf15、nse、trap5和opg表达：(a)opn、gdf15、nse、trap5和opg检测抗体bead(b)实验标准品及质量控制品1和质量控制品2(c)血清或血浆基质，assaybuffer，washbuffer，bead稀释液(d)检测抗体，藻红蛋白链酶亲和素，实验对应的96孔板(e)实验方法的说明书2、opn/gdf15/nse/trap5/opg表达量与早期肝癌的关系采用液相蛋白芯片的方法，用默克密理博公司的两个检测试剂盒，分别为humancirculatingcancerbiomarkerpanel1(cat.no.hccbp1mag-58k)和humancancer/metastasisbiomarkerpanel1(cat.no.hcmbmag-22k)，两个试剂盒共挑选了20个检测指标，为mif、trail、leptin、sfas_ligand、hgf、sfas、tnf_a、scf、cyfra21_1、opn、he4、tgf_a、gdf15、dkk1、nse、trap5、opg、ykl40、tweak、afp，对2014至2016年收集的正常人、乙肝肝炎患者、肝硬化患者、早期肝癌患者共508例血浆样本(来自上海长海医院和东方肝胆外科医院)进行了以上20个指标的检测，试剂盒检测过程是在flexmap3d(luminex公司)仪器上完成的，检测结果使用milliplexanalyst5.1软件(默克密理博公司)分析完成，20个蛋白分子指标使用分析软件的5p-log分析方法完成。实验将正常人、乙肝肝炎患者、肝硬化患者共280例血浆标本设为组1，将早期肝癌患者共228例血浆标本设为组2，除去afp后剩余19个指标统计分析步骤如下：(a)第1轮筛选，各指标进行组间比较，采用wilcoxon秩和检验。组间比较的p值小于0.1的指标，可进入下一轮的分析。表1.检定统计资料miftrailleptinsfas_ligandhgfsfasmann-whitneyu统计资料31070.5259382579830869.52742729791.5wilcoxonw57176.5520445190456975.56676769131.5z-0.516-3.635-3.72-0.639-2.73-1.293p值0.606000.5230.0060.196表1(续)tnf_ascfcyfra21_1opnhe4tgf_amann-whitneyu统计资料3180831226298951066730058.529866wilcoxonw5791457332692355000769398.555972z-0.068-0.422-1.231-12.915-1.131-1.25p值0.9460.6730.21800.2580.211表1(续)指标：mif、sfas_ligand、sfas、tnf_a、scf、cyfra21_1、he4、tgf_a、dkk1、tweak落选。(b)上一轮分析中选中的指标绘制roc曲线，若auc曲线下面积大于0.6，则进入下一步分析。指标包括：trail、leptin、hgf、opn、gdf15、nse、trap5、opg、ykl40。(图1-9)表2.相关指标roc曲线面积、标准误及roc曲线下面积的95％ci的统计数据汇总指标：trail、leptin、hgf落选。(c)上一轮分析中选中的指标，根据约登指数确定cut-off值指标包括：opn、gdf15、nse、trap5、opg、ykl40。表3.相关指标cut-off值及灵敏度、特异度、正确率、阴性似然、阳性似然、约登指数的统计数据汇总(d)筛选出的6个变量，>cut-off值为阳性(取值＝1)，否则为阴性(取值＝0)，进行logistic回归模型分析：表4.相关指标进行logistic回归模型分析后所得估计值、标准误、walds统计量及p值的统计数据汇总指标估计值标准误walds统计量p值opn2.5150.32858.78<0.0001gdf151.3390.34415.191<0.0001nse2.2610.31850.615<0.0001trap51.3010.32516.047<0.0001opg1.6470.31926.589<0.0001ykl400.2120.3490.370.543常数-5.7210.539112.469<0.0001ykl40没有意义，从模型中剔除，再次进行logistic回归模型分析：表5.相关指标进行logistic回归模型分析后所得估计值、标准误、walds统计量及p值的统计数据汇总指标估计值标准误walds统计量p值opn2.540.32660.766<0.0001gdf151.4020.32818.288<0.0001nse2.2790.31751.675<0.0001trap51.2980.32416.043<0.0001opg1.7040.30631.087<0.0001常数-5.6720.531113.968<0.0001最后得出公式：logitp＝-5.672+2.54*opn_g+1.402*gdf15_g+2.279*nse_g+1.298*trap5_g+1.704*opg_g在上面公式中，当logitp大于0.5时，判断样本为早期肝癌，否则非早期肝癌。基于上述方程，验证非hcc与早hcc的判断：表6.根据统计分析所得公式验证实验样本中非hcc与早hcc的判断的数据汇总灵敏度＝80.3％特异度＝90.4％正确率＝85.8％我们所采用的基本检测方法是液相蛋白芯片，这一技术在现代基础医学中已被证实是高灵敏、高准确度的检测方法，是高度成熟的检测方法。我们采用的是这一技术中的标准曲线定量法，可以准确地对血浆中的蛋白小分子做精确定量。本发明提供了一种以高灵敏液相蛋白芯片为实验方法的肝癌检测试剂盒，可以通过检测病人血浆中蛋白小分子opn、gdf15、nse、trap5和opg含量，来对肝癌做早期诊断。其检测方法成熟简便、周期短、灵敏度高。经检测蛋白小分子opn、gdf15、nse、trap5和opg含量，其检测的准确度达到85.8％，高于现行的肝癌检测指标afp，因此可以有效地作为现行指标的替代或补充。以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。当前第1页12