一种艾塞那肽的超高效液相色谱分析方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及一种艾塞那肽的超高效液相色谱分析方法。

背景技术：

艾塞那肽(exenatide)是一种人胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物，可以治疗ii型糖尿病患者。它是2005年被美国食品药品监督管理局(fda)批准上市的第1个glp-1类似物，于2009年在中国获批上市，也是第1个在中国上市的glp-1类似物。

为了保证艾塞那肽后续的研发和生产质量，需要对原料药及其载药微球的质量进行控制。因此，研究获得一种艾塞那肽含量测定的检测方法，这对医药生产企业来说显得尤为迫切。

专利号为201310101282.x的发明专利中公开了一种艾塞那肽及其杂质超高效液相色谱检测方法，该方法在柱色谱法中，分别以缓冲液与有机溶剂按不同比例配制的流动相a和流动相b按不同比例混合作为流动相，梯度洗脱含艾塞那肽及各杂质的样品，其中流动相a为含有10-25体积％乙腈和甲醇的硫酸铵或硫酸钠溶液，流动相b为含有50-80体积％乙腈和甲醇的硫酸铵或硫酸钠溶液；其中流动相流速为0.4-0.6ml/min，样品浓度为1mg/ml，进样体积为5μl；且从该发明的实施例中看出，艾塞那肽的检出时间大于10mins。

专利号为201410205748.5的发明专利中公开了一种高效液相色谱法测定艾塞那肽及其杂质的方法，该方法通过高效液相色谱法测定艾塞那肽及其杂质，梯度洗脱；其中，色谱流动相水相采用1.2～1.8mmol/l的烷基磺酸钠溶液，并用磷酸调ph至4.0～4.8；采用的流动相a为乙腈-上述烷基磺酸钠溶液＝10：90，流动相b为乙腈-烷基磺酸钠溶液＝52：48；流动相流速为0.8～1.2ml/min，艾塞那肽样品的浓度为0.4～1.6mg/ml，进样体积为40μl。

申请号为200910247706.7的发明申请中公开了一种用液相色谱法分离测定艾塞那肽及其中杂肽的方法，该方法所用的色谱柱中，固定相为烷基键合硅胶，流动相为乙腈-磷酸盐溶液，其中，以磷酸盐溶液或含有适量乙腈的磷酸盐溶液为流动相a，磷酸盐溶液的浓度为0.01～0.1mol/l；以乙腈或含有适量磷酸盐溶液的乙腈为流动相b，采用乙腈进行梯度洗脱，且按体积比计流动相b占整个流动相的浓度梯度范围为10～90％；艾塞那肽样品的浓度为0.1～5mg/ml，流动相的流速为0.5～1.5ml/min，进样体积为2～100μl。

在上述现有技术中，均采用的是高效液相色谱分析；而超高效液相相比高效液相，进样浓度更低，可以降低价格昂贵的艾塞那肽的消耗量，降低成本；同时，出峰时间更快，流动相消耗更少。有鉴于此，有必要对现有技术中的艾塞那肽的含量分析方法予以改进，以解决上述问题。

技术实现要素：

本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，本发明目的在于提供一种稳定性好、重复性好、操作简单、理论塔板数高、准确快速，用于艾塞那肽的超高效液相色谱分析方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种艾塞那肽的超高效液相色谱分析方法，将含有艾塞那肽的样品溶液通入色谱柱中，采用反向液相色谱外标百分比法定量分析，所述液相色谱条件为：

色谱柱：uplc；

流动相：体积配比为80：20～20：80的流动相a与流动相b的混合溶液，所述流动相a为0.1m/l的四乙基高氯酸铵(teap)水溶液，用高氯酸调ph至2.05，所述流动相b为100％乙腈；

梯度洗脱；

检测波长：210～220nm；

流速：0.18～0.23ml/min；

柱温：40～60℃；

进样体积1～5μl。

所述艾塞那肽的样品溶液的进样浓度为0.004～0.2mg/ml。

所述样品溶液由艾塞那肽原料药与去离子水组成。

所述检测波长为215nm，流速为0.21ml/min，柱温50℃，进样体积1.4μl。

所述梯度洗脱的具体过程为，洗脱时间及流动相a体积比顺序为0～15min72％运行，15～15.1min从32％→20％，15.1～16.7min再从20％→30％，16.7～16.8min再从30％→72％，然后72％运行至18.4min。

本发明的有益效果是：与传统的hplc方法相比，本发明提供的艾塞那肽的超高效液相分析方法具有准确快速、理论塔板数高等特点，能够有效测出艾塞那肽含量(比较图1和图2可以发现)。进样浓度更低，可以降低价格昂贵的艾塞那肽的消耗量，降低成本；同时，出峰时间更快，流动相消耗更少。

附图说明

图1为实施例1中的艾塞那肽样品的超高效液相色谱分析结果谱图。

图2为对比例1中目前常用的艾塞那肽样品的高效液相色谱分析结果谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

艾塞那肽含量测定。

超高效液相色谱条件：

色谱柱：acquityuplc(beh,c18)，规格2.1mm×50mm，1.7μm。

流动相配比为：体积配比为20：80～80：20的流动相a与流动相b的混合溶液，梯度洗脱，所述流动相a为0.1m/l的四乙基高氯酸铵(teap)水溶液，用高氯酸调ph至2.05，所述流动相b为100％乙腈。所述梯度洗脱的具体过程为，洗脱时间及流动相a体积比顺序为0～15min72％运行，15～15.1min从32％→20％，15.1～16.7min再从20％→30％，16.7～16.8min再从30％→72％，然后72％运行至18.4min。

检测波长为215nm；流速为0.21ml/min；柱温50℃；进样体积1.4μl。

溶液配制：

流动相a的配制：称取四乙基高氯酸铵2.297g，用100ml超纯水溶解，再用高氯酸调节ph至2.05，然后过滤待用。

取艾塞那肽原料约10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加适量稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

根据图1可以看出，艾塞那肽，峰形良好，峰纯度良好。

实施例2

艾塞那肽含量测定的系统精密度试验

超高效液相色谱条件：

色谱柱：acquityuplc(beh,c18)，规格2.1mm×50mm，1.7μm。

流动相配比为：体积配比为20：80～80：20的流动相a与流动相b的混合溶液，梯度洗脱，所述流动相a为0.1m/l的四乙基高氯酸铵(teap)水溶液，用高氯酸调ph至2.05，所述流动相b为100％乙腈。所述梯度洗脱的具体过程为，洗脱时间及流动相a体积比顺序为0～15min72％运行，15～15.1min从32％→20％，15.1～16.7min再从20％→30％，16.7～16.8min再从30％→72％，然后72％运行至18.4min。

检测波长为215nm；流速为0.21ml/min；柱温50℃；进样体积1.4μl。

溶液配制：

精密称取10.000mg艾塞那肽原料药，置100ml容量瓶中，加超纯水至刻度，摇匀，制成浓度为0.10012mg/ml艾塞那肽溶液，作为供试品溶液。

表1：系统精密度试验结果

根据表1可以看出，重复进同一样品6次的峰面积rsd％为0.7％，符合药典中rsd％<2％的规定，说明系统精密度良好，试验可信度高。

实施例3

艾塞那肽含量测定的重复性试验

超高效液相色谱条件：

色谱柱：acquityuplc(beh,c18)，规格2.1mm×50mm，1.7μm。

流动相配比为：体积配比为20：80～80：20的流动相a与流动相b的混合溶液，梯度洗脱，所述流动相a为0.1m/l的四乙基高氯酸铵(teap)水溶液，用磷酸调ph至2.05，所述流动相b为100％乙腈。所述梯度洗脱的具体过程为，洗脱时间及流动相a体积比顺序为0～15min72％运行，15～15.1min从32％→20％，15.1～16.7min再从20％→30％，16.7～16.8min再从30％→72％，然后72％运行至18.4min。

检测波长为215nm；流速为0.21ml/min；柱温50℃；进样体积1.4μl。

溶液配制：

分别精密称取艾塞那肽原料药样品6份：(10.023mg，10.056mg，10.087mg，10.095mg，10.074mg，10.019mg)，并用超纯水稀释至刻度，摇匀，获得不同浓度的艾塞那肽溶液(0.10023mg/ml，0.10056mg/ml，0.10087mg/ml，0.10095mg/ml，0.10074mg/ml，0.10019mg/ml)，作为供试品溶液。

表2：重复性试验结果

根据表2可以看出，样品中艾塞那肽的平均含量为99.1％，计算rsd为0.2％，有很好的重现性。

对比例1

高效液相色谱条件：

色谱柱：ace，c18，300a，规格150*4.6mm，300a，3um。

流动相配比为：体积配比为20：80～80：20的流动相a与流动相b的混合溶液，梯度洗脱，所述流动相a为0.1m/l的四乙基高氯酸铵(teap)水溶液，用高氯酸调ph至2.05，所述流动相b为100％乙腈；

检测波长为215nm；流速为1ml/min；柱温50℃；进样体积20μl。

溶液配制：

流动相a的配制：称取四乙基高氯酸铵2.297g，用100ml超纯水溶解，再用高氯酸调节ph至2.05，然后过滤待用。

取艾塞那肽原料约10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加适量稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

比较图1和图2可以发现，本发明的方法比高效液相色谱出峰快；通过实验条件也可以发现，本发明的方法流速低，出峰时间段，因此可以节约流动相。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。