本发明涉及辅酶i检测领域，特别是一种高效液相色谱法测定辅酶i的方法。
背景技术：
：人体氧化还原反应中重要的辅酶，出现在细胞很多代谢反应中。作为生物催化反应必不可少的辅酶，参与上千种生理反应，如细胞三羧酸循环(tca)、脂肪β氧化等，在糖、脂肪、氨基酸等营养物质的代谢利用过程中具有重要意义。同时亦是辅酶i消耗酶(如nad+依赖型adp核糖基转移酶)的唯一底物。这类酶将辅酶i(nad+)作为底物分解成adp核糖和烟酰胺(nam)，在不同细胞中发挥不同生理功能，如参与dna修复、细胞氧化压力调节等生理功能。辅酶i现有的国家法定含量检测标准为紫外分光光度法。其缺陷在于，灵敏度较差，专属性不强，重现性不好且不够准确。技术实现要素：本发明旨在提供一种检测结果准确、检测速度快的高效液相色谱法测定辅酶i的方法。其具体方案为：一种高效液相色谱法测定辅酶i的方法，通过高效液相色谱法进行梯度洗脱测定辅酶i的浓度，检测波长为254nm；梯度洗脱分为4个阶段，第一阶段洗脱时间为20min；流动相为乙腈；第二阶段洗脱时间为10min，流动相为乙腈和0.2mol/l的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为9:1；第三阶段洗脱时间为15min，流动相为乙腈和0.2mol/l的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为35:65；第四阶段洗脱时间为0.1min，流动相为0.2mol/l的乙酸铵溶液。在上述的高效液相色谱法测定辅酶i的方法中，梯度洗脱过程中，流动相的流速为1ml/min。在上述的高效液相色谱法测定辅酶i的方法中，检测过程中，柱温为25℃。在上述的高效液相色谱法测定辅酶i的方法中，进样量为20μl。在上述的高效液相色谱法测定辅酶i的方法中，所述的方法具体为：步骤1：对照品溶液配制：取辅酶i对照品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得；步骤2：供试品溶液配制：取辅酶i样品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得；步骤3：测定：待系统稳定后，依次进样1针空白溶液、3针对照品溶液、2针供试品溶液，记录色谱图，并分析得到供试品浓度。本发明的有益效果在于：与现有的紫外分光光度法相比，高效液相色谱法测定辅酶i含量，结果更为准确，灵敏度高，重现性好，专属性更强。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。为了更加清楚的对本发明进行说明，列举如下实施例来说明本发明的优越性。实施例1高效液相色谱法测定辅酶i的方法包括以下步骤：1)对照品溶液配制：取辅酶i对照品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得。2)供试品溶液配制：取辅酶i样品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得。3)测定：待系统稳定后，依次进样1针空白溶液、3针对照品溶液、2针供试品溶液，记录色谱图。色谱条件：流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.2mol/l乙酸铵溶液检测波长：254nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：25℃梯度洗脱时间表如下表1：表1：梯度洗脱时间表时间(min)梯度0100％b+0％a2090％b+10％a3035％b+65％a45100％b+0％a45.1结束与现有的紫外分光光度法相比，高效液相色谱法测定辅酶i含量，结果更为准确，灵敏度高，重现性好，专属性更强。以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。技术特征：技术总结本发明属于涉及辅酶I检测领域，提出一种高效液相色谱法测定辅酶I的方法，具体为：通过高效液相色谱法进行梯度洗脱测定辅酶I的浓度，检测波长为254nm；梯度洗脱分为4个阶段，第一阶段洗脱时间为20min；流动相为乙腈；第二阶段洗脱时间为10min，流动相为乙腈和0.2mol/L的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为9:1；第三阶段洗脱时间为15min，流动相为乙腈和0.2mol/L的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为35:65；第四阶段洗脱时间为0.1min，流动相为0.2mol/L的乙酸铵溶液。该方法具有检测结果准确、检测速度快的优点。技术研发人员：金永红;郎巧洁;李映峤受保护的技术使用者：开封康诺药业有限公司技术研发日：2017.08.18技术公布日：2017.12.26