本发明涉及一种原料药中哌啶残留量的高灵敏度检测方法。
背景技术：
哌啶，又称六氢吡啶，是有机合成中广泛使用的一种二级胺和有机碱，比如作为羟醛缩合和michael加成中的催化试剂、用于调节亚砜-亚磺酸重排的亲硫试剂，以及烯胺或亚胺合成中的组成单元等，在科研、化工和医药领域均扮演重要的角色。其结构式为：
哌啶具有一定毒性，是第二类易制毒。2015版中国药典、usp38<467>residualsolvents及ichq3c均未对哌啶的残留限度做出明确规定，其限度的制定按照常理应参照其毒性数据(http://www.basechem.org/chemical/1657(化学品数据库))：哌啶：大鼠经口ld50：50mg/kg；吡啶：大鼠经口ld50：1580mg/kg(限度0.02％)，因此推断哌啶的限度为60ppm。
哌啶极性很大，无紫外吸收，目前常用气相色谱(fid、npd检测器)进行检测，但其灵敏度差，远达不到限度要求，为进一步控制原料药的安全，开发一种高灵敏度的测定哌啶残留的方法很有必要。
技术实现要素：
为了开发出高灵敏度的哌啶测定方法，发明人根据多年的实际经验，研发了一种适用于原料药中哌啶残留量测定的新方法。
专利cn103068802b的权利要求1式i的化合物或其药学上可接受的盐，是一类通过合成制备的全新小分子化学药物，其合成过程以及其类似物的合成过程均用到哌啶作为催化试剂，因此有必要对其原料药中哌啶残留量进行检测。3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺是其中的一种化合物。
专利cn103068802b的权利要求1式i的化合物：
或其药学上可接受的盐；
其中：
x1、x2和x3中的任意1个是n原子，且x1、x2和x3中剩余的2个独立地是cr13，r13选自h和c1-3烷基；
y是so2；
r1选自：och3、och2ch3、o-丙基和o-丁基；
r2选自：och3、och2ch3、oh、no2、nh2、nhc(＝o)c1-6烷基、nhc1-6烷基cooh、nhc1-6烷基c(＝o)nh2、nhc1-6烷基c(＝o)c1-6烷基、nhso2c1-6烷基、nhch2co2et和
每个r3或r7独立地是oc1-6烷基；
r4和r6都是h；
r5是h或oc1-6烷基。
本发明提供一种衍生化法测定原料药中哌啶残留的检测方法，包括以下步骤：(1)取原料药样品加入稀释剂稀释，加入2,4-二硝基氟苯，再加入缚酸剂进行衍生化反应，得到衍生物，其中哌啶衍生化的反应式为
(2)采用液相色谱法使用紫外检测器测定样品中所述衍生物的量，色谱条件为：固定相是c18色谱柱，流动相中的有机相为乙腈，乙腈与水相的体积比为60:40～70:30。
在本发明的一个实施方案中，衍生化反应中缚酸剂可以是nahco3或khco3
在本发明的一个实施方案中，所述缚酸剂的浓度为1-3mg/ml。
在本发明的一个实施方案中，对所述衍生物的检测波长为383-393nm，检测波长优选为388nm。
在本发明的一个实施方案中，2,4-二硝基氟苯的浓度为0.03-0.05mg/ml，优选为0.04mg/ml。
在本发明的一个实施方案中，稀释所用的稀释剂为选自二甲基亚砜、乙腈、甲醇或乙醇中的一种。
在本发明的一个实施方案中，衍生化反应温度为20-30℃。
在本发明的一个实施方案中，衍生化反应时间为1h以上。
在本发明的一个实施方案中，色谱柱柱温30～40℃，柱温最佳为30℃。
在本发明的一个实施方案中，液相色谱的流动相的流速为0.8-1.2ml/min。
在本发明的一个实施方案中，所述原料药为专利cn103068802b的权利要求1的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方案中，所述原料药是3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺，所述稀释剂为二甲基亚砜。
在本发明的一个实施方案中，所述3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺的样品浓度为10-20mg/ml，优选为10mg/ml。
在本发明的一个实施方案中，所述3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺的进样量为10-20μl，优选10μl。
本发明方法采用的衍生化试剂为2,4-二硝基氟苯，其毒性较低，且为常用化工中间体，易于购买；衍生化反应条件温和，室温下就能进行，且反应快速、完全；产生的衍生产物有紫外吸收，在388nm处有最大吸收，最大吸收波长在较高波段，不易被溶剂及相关杂质干扰，灵敏度明显提高，检测限可以达到0.30ng；衍生化反应溶液状态稳定性良好，有利于测定方法的开发。
发明人经过大量实验摸索发现，在本发明的衍生化反应可以在稀释剂中顺利进行，所述稀释剂可以是二甲基亚砜、乙腈、甲醇以及乙醇；尤其是对于专利cn103068802的化合物或衍生物，其在二甲基亚砜中溶解性好，可以在其中顺利进行衍生化反应。
本发明能够有效测定原料药中的哌啶残留，方法简单快捷，分析灵敏度高，结果准确可靠。
附图说明
图1.哌啶衍生物的ms质谱图
图2.哌啶衍生物的dad光谱图
图3.衍生化反应时间确定谱图
图4.液相色谱条件的确定条件1
图5.液相色谱条件的确定条件2
图6.衍生化反应中缚酸剂用量考察,谱图由上到下，顺序分别为空白溶液、1mg/mlnahco3、2mg/mlnahco3、3mg/mlnahco3)。
图7.不同稀释剂的考察
图8.衍生化测定线性图
具体实施方式
以下实施例用于进一步理解本发明，但不是对本发明的限制。
实施例1：哌啶衍生物的定性
仪器与条件：
agilent1290液相色谱仪，泵的型号为g4220a，紫外检测器型号g4212a，电喷雾离子化检测器的型号为g6460b及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，质谱参数为：fragment:135；cellaccelerator:7；positive。
流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
实验步骤：
哌啶对照品储备液的制备：取对照品(ar,批号：j01010，北京化工厂)适量，采用dmso溶解，制备最终浓度为0.1mg/ml的哌啶对照品储备液。
2,4-二硝基氟苯储备液的配制：取样品适量，采用dmso溶解，最终浓度为4mg/ml。
衍生化反应：取哌啶对照品储备液1ml，至100ml容量瓶中，精密加入2,4-二硝基氟苯储备液1ml，加dmso稀释至刻度，加入nahco3约0.2g，手动振摇1min，25度静置反应1h后，8000r/min高速离心10min，取上清液，作为定性溶液。按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录质谱信息和紫外信息，结果见图1和图2。
从图1可知，质谱碎片251.4、273.2分别与衍生物的分子离子峰[m+h]+、[m+na]+相吻合，推断该物质为目标产物。
图2为衍生物的紫外全波长吸收，由此图可知紫外吸收波长为383-393nm，最优波长为388nm。
实施例2衍生化反应时间考察
仪器与条件
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
试验步骤：
哌啶对照品储备液的制备：取对照品适量，采用dmso溶解，最终浓度为0.1mg/ml。
2,4-二硝基氟苯储备液的配制：取样品适量，采用dmso溶解，最终浓度为4mg/ml。
衍生化反应：取哌啶对照品1ml，至100ml容量瓶中，精密加入2,4-二硝基氟苯储备液1ml，加dmso稀释至刻度，加入nahco3约0.2g，手动振摇1min，25度静置反应1h、2h后，8000r/min高速离心10min，取上清液，进液相进行测定。
结果见附图3。
结论：该反应，反应1h、2h其峰面积几乎相同，说明该反应1h即可反应完全。
实施例3：液相色谱条件的确定：
按照表1不同液相色谱条件进行分析
表1：
系统样品制备条件如表2：
表2
结果见图4和图5。
试验结论：符合上述条件1和条件2的色谱条件，哌啶衍生物均可正常出峰，保留时间有所改变，但不影响正常测定，考虑到哌啶衍生物峰形最佳(如峰宽最小、分离度较大)，最佳流速为1ml/min、最佳柱温为30℃、最佳进样体积为10μl。
实施例4：哌啶衍生化测定灵敏度试验
仪器与条件
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
试验步骤：
哌啶对照品储备液的制备：取对照品适量，采用dmso溶解，最终浓度为1mg/ml。
1、定量限浓度样品的配制：取1mg/ml哌啶对照品储备液1ml至100ml的容量瓶中，dmso稀释定容至刻度，摇匀，再从该瓶分别取1ml溶液，精密量取，6份，至不同的100ml容量瓶中，dmso稀释定容至刻度，摇匀，分别加入2,4-exjfb(4.0mg/ml)溶液1ml，加入碳酸氢钠0.2g，振摇1min，25度静置反应1h，8000r/min高速离心10min，取上清液即得。
2、检测限浓度样品的配制：取1mg/ml哌啶对照品储备液1ml至100ml的容量瓶中，dmso稀释定容至刻度，摇匀，再从该瓶分别取0.3ml溶液，精密量取3份，至不同的100ml容量瓶中，dmso稀释定容至刻度，摇匀，分别加入2,4-exjfb(4.0mg/ml)溶液1ml，加入碳酸氢钠0.2g，振摇1min，25度静置反应1h，8000r/min高速离心10min，取上清液即得。测定结果如下表3和表4所示，该方法的定量限为1.0ng，检测限为0.3ng。
表3：
定量限
表4：
检测限
实施例5：衍生化反应中缚酸剂用量考察
仪器与条件
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
试验内容：
表5
试验结果见附图6。
结论：由图6可知，不同缚酸剂用量，该反应物峰面积变化不大，故该反应的缚酸剂的用量为1-3mg/ml之间即可。
实施例6：衍生化试剂的浓度考察
仪器与条件
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
试验步骤：
哌啶对照品储备液的制备：取对照品适量，采用dmso溶解，最终浓度为0.1mg/ml。
2,4-二硝基氟苯储备液的配制：取样品适量，采用dmso溶解，最终浓度为4mg/ml。
衍生化反应浓度的确定：取哌啶对照品，分别精密加入2,4-二硝基氟苯储备液适量，使得终浓度分别为下表所示，加dmso稀释至刻度，加入nahco3约0.2g，使得终浓度为2mg/ml，手动振摇1min，25度静置反应1h后，8000r/min高速离心10min，取上清液，进液相进行测定。数据如下：
表6
结论：如上表所示，2,4-二硝基氟苯浓度定为0.04mg/ml，可进行上述浓度哌啶的检测，且2,4-二硝基氟苯反应后剩余量也可从色谱图上观察到，有利于判断反应是否完全，根据反应后剩余2,4-二硝基氟苯的峰面积可推断其加入量为0.03-0.05mg/ml之间。
实施例7：不同稀释剂的考察
仪器与条件：
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
表7
试验内容：
结果见图7。
试验结果：该化学反应在以上稀释剂中均能完全反应，峰面积差异不大。对于专利cn103068802的化合物或衍生物来讲，其在dmso中的溶解度较大，故其优选dmso为稀释剂。
实施例8：哌啶衍生化测定专属性试验
仪器与条件：
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
试验步骤：
稀释剂：二甲基亚砜
哌啶空白：取哌啶样品适量，dmso溶解，终浓度0.001mg/ml。
2，4-二硝基氟苯测试液空白：取2,4-二硝基氟苯适量，dmso溶解，终浓度0.04mg/ml。
样品空白：取3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺样品适量，dmso溶解，终浓度10mg/ml。
衍生化反应液：取哌啶对照品1ml，至100ml容量瓶中，精密加入2,4-二硝基氟苯储备液1ml，加dmso稀释至刻度，加入nahco3约0.2g，进行衍生化反应。测定结果如下表所示，该方法专属性良好。数据见下表：
表8
哌啶残留量测定-专属性
实施例9：哌啶衍生化测定线性试验
仪器与条件
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
试验步骤：
取哌啶对照品储备液适量，配制成0.1～1.2μg/ml的浓度，衍生化后进行线性测定。衍生化反应条件：加入上述浓度对照品后，加入2,4-二硝基氟苯使得终浓度为0.04mg/ml，加入nahco3使得终浓度为2mg/ml，手动振摇1min，25度静置反应1h后，8000r/min高速离心10min，取上清液，进液相按上述色谱条件进行测定。
测定结果如图8所示，测定结果符合线性要求。
实施10：哌啶衍生化测定准确度试验
仪器与条件
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
试验步骤：
50％浓度水平的样品溶液：取3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺样品100mg，至10ml容量瓶中，加入哌啶溶液，使哌啶浓度相当于供试品浓度的0.003％。
100％浓度水平的样品溶液：取3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺样品100mg，至10ml容量瓶中，加入哌啶溶液，使哌啶浓度相当于供试品浓度的0.006％。
150％浓度水平的样品溶液：取3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺样品100mg，至10ml容量瓶中，加入哌啶溶液，使哌啶浓度相当于供试品浓度的0.009％。
对照品溶液的配制：取哌啶对照品储备液适量，dmso溶解，使得浓度为0.6μg/ml。
平行进行衍生化反应，进行测定。衍生化反应条件：加入样品或对照品后，加入2,4-二硝基氟苯使得终浓度为0.04mg/ml，加入nahco3使得终浓度为2mg/ml，手动振摇1min，25度静置反应1h后，8000r/min高速离心10min，取上清液，进液相按上述色谱条件进行测定。
三个不同浓度水平的平均回收率为98％，回收率rsd为0.6％，可见此方法可以对样品中的微量哌啶进行准确测定。
实施例11：哌啶衍生化测定稳定性考察
仪器与条件
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
表9
试验内容：
试验结果：在不同介质中，室温放置10h，与反应完成后0h比较，峰面积偏差均<2％，说明该反应物溶液状态下10小时内稳定。
结论：由以上数据可知该衍生物在上述稀释剂中稳定性良好。
实施例12：3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺样品中哌啶残留测定
仪器与条件
agilent1260液相色谱仪，泵的型号为g1311a，紫外检测器型号g1315d，及chemstation处理软件，色谱柱：phenomenexc18(250*4.6mm，5μm)，紫外检测波长为388nm，流动相：乙腈-水(65:35，v/v)，流速1ml/min，进样量10μl。
试验步骤：
对照品溶液的配制：取哌啶样品适量，dmso溶解，使其终浓度为0.6μg/ml。
样品：取3-甲氧基-6-{[(1e)-2-(2,4,6-三甲氧基)苯乙烯基]磺酰甲基}-2-吡啶胺样品适量，dmso溶解，使其终浓度为10mg/ml。
衍生化反应条件：加入样品或对照品后，加入2,4-二硝基氟苯使得终浓度为0.04mg/ml，加入nahco3使得终浓度为2mg/ml，手动振摇1min，25度静置反应1h后，8000r/min高速离心10min，取上清液，进液相进行测定。
按上述色谱条件进行测定。结果见下表所示，样品哌啶残留符合要求。
表10
样品中哌啶测定