专利名称：微胶囊大豆异黄酮及其原料中己酸含量的测定方法
技术领域：
本发明是一种药物分析技术，特别是用于豆制品黄水下脚料中提取的经酶法水解的微胶囊大豆异黄酮及其原料中己酸含量的测定方法。
背景技术：
豆制品黄水下脚料中提取的经酶法水解的大豆异黄酮，其含大豆异黄酮苷元有效成分高，但色泽深黄、气味浓烈，有强烈的异臭味，严重影响了其在保健食品和食品中作为功能型成分添加剂的应用。目前对大豆及其产品的国家标准中关于气味鉴定项目均采用感官鉴定，如大豆的国标中，“色泽、气味、口味”项按GB 5492-85相关解释执行，其中气味项为“1、取少量试样，嘴对试样呵气，立即嗅辨气味是否正常；2、将试样放入密闭器皿内，在60-70℃的温水杯中保温数分钟，取出，开盖嗅辨气味是否正常。”人为因素极大。文献对大豆及其产品报道的异味研究多为对豆浆等副食品进行，尚未见对大豆异黄酮类产品的类似报道。在大量文献调研的基础上，对频繁提及的挥发性异味物质如正己醛、苯甲醛和正己醇等，由豆制品废水中提取得到的大豆异黄酮原料及其微胶囊制品进行了色谱保留时间比对法定性，结果均否定。
发明内容
本发明目的是把豆制品黄水下脚料中提取的经酶法水解的大豆异黄酮，采用现代技术，对包接前后异味物质进行定性定量方法研究及建立，并以此法检测比较包接工艺的有效性，以评价工艺以及控制产品质量。对微囊化制备工艺进行有效的质量控制，使经微囊化制备后的产品有效地掩盖异臭，除制成胶囊剂外，还可广泛应用于片剂、颗粒剂及作为功能性添加剂，在食品、饮料、营养保健食品等方面起到很好的作用，将大大提高应用范围和销量。
科学评价包接的效果及严格控制产品质量，必须建立有代表性的异味物质定量质量控制方法，首先找到定性指标性成分，经气相色谱顶空法对原料中的挥发性成分进行分离，发现于12min至17min之间3个峰适合作指标性成分。见图1。
进一步查找合适的指标性物质，对原料进行了气相色谱-质谱联用分析，确定12min至17min之间的15min峰为戊酸，16min峰为己酸，其他挥发性成分尚有乙酸乙酯、1-辛烯-3-甲醇、苯甲醛、2，4-二氯-1-甲基-酚、庚酸等。根据戊酸和己酸两者的丰度，选择己酸作指标性成分，固体样品顶空进样难以定量，重现性差，进样方式改为用乙醚作溶剂，将样品中己酸成分充分溶解后，直接进样，并进行系列研究和方法验证。
本发明要解决的技术问题是解决微胶囊大豆异黄酮及其原料中己酸含量的测定。从豆制品废水中提取的经酶法水解的大豆异黄酮，对产品中的挥发性成分进行了气相色谱分离，并用气相色谱-质谱联用技术，选择己酸作为异味物质的指标性成分加以含量测定，对具有浓烈异味大豆异黄酮分子包接的工艺研究进行有效的质量控制。
本发明测定方法包括如下步骤1)测定样品微胶囊大豆异黄酮及其原料2)材料A.对照品己酸B.气相色谱仪C.色谱柱固定相为氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷的毛细管柱3)测定方法A.对照品溶液的制备取对照品用乙醚配制成每1mL含5-50ug的溶液。
B.供试品溶液的制备(1)样品供试品溶液的制备取样品0.8～1.2g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，定量配制成每1mL含供试品80～120mg的溶液。
(2)原料供试品溶液的制备取原料0.8～1.2g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，定量配制成每1mL含供试品80～120mg的溶液。
C.柱温采用程序升温，初始温度30-35℃，保持2-5min，以3-6℃·min-1升至55-65℃，以8-12℃·min-1升至95-105℃，以15-20℃·min-1升至220-250℃。
D.氢火焰离子化检测器(FID)检测器温度220-260℃E.进样器温度220-250℃F.理论塔板数按己酸峰计算≥400004).方法考察A.专属性试验溶剂对己酸测定无影响；B.标准曲线及线形关系己酸浓度为1～50ug·mL-1范围内线性关系良好，研究结果1.0～50.0ug·mL-1，A＝-0.46+2197.28C r＝0.9999；C.重复性试验相对标准偏差RSD≤3％，研究结果RSD为1.6％，n＝6；D.回收率试验回收率为80％-120％，研究结果本法回收率为99.2％，RSD为1.6％；E.灵敏度试验最低检测浓度≤1ug·mL-1，研究结果0.14ug·mL-1，方法灵敏。
为控制原料和体现微胶囊大豆异黄酮[制法]的合理性，本发明将气相色谱法测定己酸含量作为微胶囊大豆异黄酮的[检查]项目之一，并对其方法学进行考察，方法如下一. 试验材料(一)己酸对照品含量大于98％(二)气相色谱仪Agilent 6890N气相色谱仪；Agilent7683自动进样器，Agilent气相色谱工作站。
(三)色谱柱Agilent DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)。
(四)溶剂乙醚为分析纯二. 试验方法(一)对照品溶液制备1.对照品贮备液 精密量取己酸对照溶剂27μL(约25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为500ug·mL-1的溶液，摇匀，即得。
2.对照品溶液 精密量取对照品贮备液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为25ug·mL-1溶液，摇匀，即得。
(二)供试品溶液的制备1.样品供试品溶液的制备取样品约1.0g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，即得。
2.原料供试品溶液的制备取原料约1.0g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，即得。
(三) 色谱条件的选择柱温程序升温，初始温度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。进样器温度250℃；检测器温度260℃；载气氮气，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。进样1μL。理论板数按己酸峰计算为400000。
三.方法学考察试验(一)专属性试验取空白溶剂1μL，依法操作。由图中可见乙醚在待测溶剂出峰处不干扰检测。见附图2。
(二)灵敏度试验以信噪比为3计，本法中己酸的最低检测浓度为0.14ug·mL-1，方法灵敏。见附图3。
(三)标准曲线及线形关系配置5种浓度的对照品溶液精密量取对照品贮备液各1.0mL分置于10、20、50、100mL量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀，浓度分别为50.0，25.0，10.0，5.00ug·mL-1；精密量取10.0ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀，浓度为1.0ug·mL-1，依次进样1uL，按上述色谱条件测定峰面积。以己酸峰面积A对己酸浓度C(ug·mL-1)作一回归处理，得回归方程及相关系数A＝-0.4565+2197.28Cr＝0.9999n＝5结果表明己酸浓度为1.0～50.0ug·mL-1范围内线性关系良好。见附图4-附图8。
(四)重复性试验取同一批号的样品6份，按样品含量测定项方法连续测定，计算样品中己酸的平均含量为194ug·g-1，RSD为1.6％。见附图9-附图14。
(五)回收率试验取已知含量的同一批号样品约0.5g，精密称定，加入对照品贮备液0.25ml，加入乙醚依法处理，并稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，测定，6份测得的平均回收率为99.2％，RSD为1.6％。
四.样品中己酸含量测定取供试品溶液，进样1μl，测定。按所拟定的方法测定了3批样品，结果分别为194、198、201ug·g-1。
产品含己酸含量限度不得大于250ug·g-1。
原料的己酸含量亦作了测定，结果为5472ug·g-1。
以己酸作为考察指标，微胶囊的遮蔽率高于95％，进一步说明了工艺的有效性。
图1原料顶空进样GC2空白溶剂图谱图3灵敏度试验图谱图4线性与回归图谱A分析结果表
图5线性与回归图谱B分析结果表
图6线性与回归图谱C分析结果表
图7线性与回归图D分析结果表
图8线性与回归图谱E分析结果表
图9重复性试验A分析结果表
图10重复性试验B分析结果表
图11重复性试验C分析结果表
图12重复性试验D分析结果表
图13重复性试验E分析结果表
图14重复性试验F分析结果表
微胶囊大豆异黄酮及其原料中己酸含量的测定方法，对微囊化制备工艺进行了有效的质量控制，经微囊化制备后的产品有效地掩盖了异臭，除制成胶囊剂外，还可广泛应用在片剂、颗粒剂及作为功能性添加剂，在食品、饮料、营养保健品等方面起到很好的作用，大大提高了应用范围和销量，具有较大的社会效益和经济效益。该指标的建立，将有利于大豆异黄酮制剂的研究、生产、使用全过程的质量控制，包括原料投料、中间体及最终的成品，因此具有深远的实际意义。
具体实施例方式
实施例1标准曲线及线形关系毛细管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱温程序升温，初始温度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。进样器温度250℃；检测器温度260℃；载气氮气，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理论板数按己酸峰计算应不低于40000。
对照品贮备液制备 精密量取己酸对照溶剂27μL(约25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为500ug·mL-1的溶液，摇匀，即得。
配置5种浓度的对照品溶液精密量取对照品贮备液各1.0mL分置于10、20、50、100mL量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀，浓度分别为50.0，25.0，10.0，5.00ug·mL-1；精密量取10.0 ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀，浓度为1.0ug·mL-1，依次进样1uL，按上述色谱条件测定峰面积。以己酸峰面积A对己酸浓度C(ug·mL-1)作一回归处理，得回归方程及相关系数A＝-0.4565+2197.28Cr＝0.9999n＝5结果表明己酸浓度为1.0～50.0ug·mL-1范围内线性关系良好。
实施例2专属性试验毛细管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱温程序升温，初始温度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。进样器温度250℃；检测器温度260℃；载气氮气，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理论板数按己酸峰计算应不低于40000。
供试品溶液制备取微胶囊大豆异黄酮样品约1.0g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，即得。
测定法取乙醚溶剂和供试品溶液分别进样1μL，注入气相色谱仪，测定比较，乙醚在己酸出峰处不干扰检测。
实施例3灵敏度试验毛细管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱温程序升温，初始温度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。进样器温度250℃；检测器温度260℃；载气氮气，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理论板数按己酸峰计算应不低于40000。
对照品贮备液制备过且过精密量取己酸对照溶剂27μL(约25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为500ug·mL-1的溶液，摇匀，即得。
对照品溶液制备精密量取对照品贮备液各1.0mL分置于50mL量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀，浓度分别为10.0ug·mL-1；精密量取10.0ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀，浓度为1.0ug·mL-1，进样1uL，按上述色谱条件测定，以信噪比为3计，算得己酸的最低检测浓度为0.14ug·mL-1，方法灵敏。
实施例4微胶囊大豆异黄酮原料中己酸含量的测定毛细管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱温程序升温，初始温度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。进样器温度250℃；检测器温度260℃；载气氮气，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理论板数按己酸峰计算应不低于40000。
对照品贮备液制备精密量取己酸对照溶剂27μL(约25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为500ug·mL-1的溶液，摇匀，即得。
对照品溶液制备取对照品贮备液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为25ug·mL-1溶液，摇匀，即得。
供试品溶液制备取微胶囊大豆异黄酮原料约1.0g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀。再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，即得。
测定法对照品溶液和供试品溶液分别进样1μL，注入气相色谱仪，测定，即得。
实施例5微胶囊大豆异黄酮中己酸含量的测定毛细管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱温程序升温，初始温度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。进样器温度250℃；检测器温度260℃；载气氮气，流速1.5mL·min-1，分流比5∶1。理论板数按己酸峰计算应不低于40000。
对照品贮备液制备精密量取己酸对照溶剂27μL(约25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为500ug·mL-1的溶液，摇匀，即得。
对照品溶液制备取对照品贮备液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为25ug·mL-1溶液，摇匀，即得。
供试品溶液制备取微胶囊大豆异黄酮样品约1.0g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，即得。
测定法对照品溶液和供试品溶液分别进样1μL，注入气相色谱仪，测定，即得。
实施例6回收率试验毛细管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱温程序升温，初始温度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。进样器温度250℃；检测器温度260℃；载气氮气，流速1.5 mL·min-1，分流比5∶1。理论板数按己酸峰计算应不低于40000。
对照品贮备液制备精密量取己酸对照溶剂27μL(约25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为500ug·mL-1的溶液，摇匀，即得。
对照品溶液制备取对照品贮备液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为25ug·mL-1溶液，摇匀，即得。
供试品溶液制备取已知含量的同一批号样品约0.5g，精密称定，加入对照品贮备液0.25ml，加入乙醚依法处理，并稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，即得。共制备6份。
测定法对照品溶液和供试品溶液分别进样1μL，注入气相色谱仪，测定，计算即得。
权利要求
1.一种微胶囊大豆异黄酮及其原料中己酸含量的测定方法，其特征在于从豆制品废水中提取的经酶法水解的大豆异黄酮，对产品中的挥发性成分进行气相色谱分离，用气相色谱—质谱联用技术，选择己酸作为异味物质的指标性成分加以含量测定，对具有浓烈异味大豆异黄酮分子包接的工艺研究进行有效的质量控制。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)测定样品微胶囊大豆异黄酮及其原料2)材料A.对照品己酸B.气相色谱仪C.色谱柱固定相为氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷的毛细管柱3)测定方法A.对照品溶液的制备取对照品用乙醚配制成每1mL含5-50ug的溶液。B.供试品溶液的制备(1)样品供试品溶液的制备取样品0.8～1.2g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，定量配制成每1mL含供试品80～120mg的溶液。(2)原料供试品溶液的制备取原料0.8～1.2g，精密称定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密闭瓶盖，超声处理2min，并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，定量配制成每1mL含供试品80～120mg的溶液。C.柱温采用程序升温，初始温度30-35℃，保持2-5min，以3-6℃·min-1升至55-65℃，以8-12℃·min-1升至95-105℃，以15-20℃·min-1升至220-250℃。D.氢火焰离子化检测器(FID)检测器温度220-260℃E.进样器温度220-250℃F.理论塔板数按己酸峰计算≥400004).方法考察A.专属性试验溶剂对己酸测定无影响；B.标准曲线及线形关系己酸浓度为1～50ug·mL-1范围内线性关系良好，研究结果1.0～50.0ug·mL-1，A＝-0.46+2197.28 C r＝0.9999；C.重复性试验相对标准偏差RSD≤3％，研究结果RSD为1.6％，n＝6；D.回收率试验回收率为80％-120％，研究结果本法回收率为99.2％，RSD为1.6％；E.灵敏度试验最低检测浓度≤1ug·mL-1，研究结果0.14ug·mL-1，方法灵敏。
全文摘要
本发明是一种药物分析技术，特别是用于微胶囊大豆异黄酮及其原料中己酸含量的测定方法。本发明从豆制品废水中提取的经酶法水解的大豆异黄酮，对产品中的挥发性成分进行了气相色谱分离，并采用气相色谱—质谱联用技术，选择了己酸作为异味物质的指标性成分加以含量测定，经对具有浓烈异味大豆异黄酮微囊化制备工艺进行了有效的质量控制，而微囊化制备后的产品有效地掩盖了异臭，除制成胶囊剂外，还可广泛应用在片剂、颗粒剂及作为功能性添加剂，在食品、饮料、营养保健品等方面起到很好的作用，大大提高了应用范围和销量，具有较大的社会效益和经济效益。
文档编号G01N30/54GK1928546SQ20061005308
公开日2007年3月14日 申请日期2006年8月23日 优先权日2006年8月23日
发明者姜丽霞, 徐世芳, 陈爱瑛 申请人:浙江省医学科学院