本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种骨源性碱性磷酸酶检测试剂盒的制备方法。
背景技术：
骨源性碱性磷酸酶是由骨质中分泌出来，当骨头中钙盐沉淀不足时，该酶分泌增多，骨中钙盐充足时则分泌减少；因此，骨源性碱性磷酸酶可用于检查机体是否存在钙吸收不足的情况。
骨碱性磷酸酶(nbap)是成骨细胞的表型标志物之一，它可直接反映成骨细胞的活性或功能状况，是近年来主要用于小儿佝偻病早期诊断和亚临床鉴别的特异性参考指标，也是目前用于评价人体骨矿化障碍的最佳指标。检测小儿血中骨源性碱性磷酸酶催化活性，籍以筛查或辅助诊断因钙营养不良引起的骨钙化障碍或其他原因引起的代谢性骨病。
目前，血清中骨碱性磷酸酶含量的主要检测方法包括电泳法、凝集素凝集法、酶联免疫法和免疫比浊法。其中，电泳法、凝集素凝集法和酶联免疫法方法或者需要依赖相应的复杂的仪器设备，或者所需样本为血清，因此，存在用血量大，检测步骤复杂、检测速度慢等缺陷；所谓免疫比浊法，是利用抗原抗体反应原理，样品中的骨源性碱性磷酸酶与反应液中抗骨源性碱性磷酸酶的抗体，在一个最佳反应条件下，形成抗原－抗体聚合物，使反应液产生浊度变化，产生的浊度与样品中的骨源性碱性磷酸酶含量呈正比，通过测定吸光度变化，与骨源性碱性磷酸酶标准曲线比较，得出骨源性碱性磷酸酶含量。但是由于骨源性碱性磷酸酶临床临界值很低，当样品中骨源性碱性磷酸酶的含量处于正常生理范围时，即抗原浓度很低时，产生抗原-抗体聚合物的量少，反应液浊度变化极小，吸光度变化就不能被检出，这就是说此方法灵敏度不够。
胶乳增强免疫透射比浊法就是提高免疫透射比浊法的灵敏度，人血清中骨源性碱性磷酸酶与相应抗体在溶液相遇，立即形成抗原-抗体复合物，形成一定浊度；该浊度高低在一定量抗体存在时与抗原的含量成正比，在405nm波长下测定浊度进行补体的定量测定。
胶乳增加免疫比浊法的基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中在高分子促聚剂(聚乙二醇等)的作用下聚合析出直径为340nm-700nm的颗粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。当入射光照射不同浊度的反应液时可被不同程度的吸收、反射和折射，通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可得出检样中抗原的含量。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种检测速度快、灵敏度高的骨源性碱性磷酸酶检测试剂盒的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种骨源性碱性磷酸酶检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂r1：
试剂r1：
①按照上述试剂r1的组分含量，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠溶于纯化水中，搅拌均匀，待充分溶解，配制成r1缓冲液；
②按照上述试剂r1的组分含量，将聚乙二醇6000、叠氮钠、tween-20溶于r1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂r1；
(2)按照下列组分含量配制试剂r2：
试剂r2：
①按照上述试剂r2的组分含量，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠溶于纯化水中，搅拌均匀，待充分溶解，配制成r2缓冲液；
②按照上述试剂r2的组分含量，将tween-20、聚氧乙烯聚丙乙烯共聚物、叠氮钠溶于r2缓冲液中，搅拌均匀，即得分散液；
③制备骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒：
a.将胶乳颗粒用pb缓冲液稀释到浓度为1％-5％，每毫升体积溶液中加入edac1.6mg，室温反应2h，10000-20000rpm转速下离心30-40min，去上清，将沉淀悬浮于mes缓冲液中，超声分散；
b.再于10000-20000rpm转速下离心30-40min，弃上清，将沉淀悬浮于pb缓冲液中，使其中的胶乳颗粒最终浓度为3.0％，超声分散；接着，边搅拌边加入等体积的含骨源性碱性磷酸酶抗体的pb稀释液，混合搅拌，室温反应2h，其中的胶乳颗粒最终浓度为1.5％；
c.10000-20000rpm转速下离心30-40min，弃上清，沉淀悬浮mes缓冲液中，超声分散，加入bsa，4℃封闭过夜，离心去上清后，得最终所需的骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒；
④用分散液来溶解得到的骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒，使其中的胶乳颗粒终浓度为0.1-2.0％，超声分散，最终制得试剂r2。
作为本发明的优选方式之一，所述制备骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒的过程的步骤a中，采用的胶乳颗粒原料为粒径为50-80nm的胶乳颗粒。
作为本发明的优选方式之一，所述制备骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒的过程的步骤a中，采用的pb缓冲液为100-150mmol/l的pb缓冲液，采用的mes缓冲液为50-100mmol/l的mes缓冲液。
作为本发明的优选方式之一，所述制备骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒的过程的步骤b中，采用的pb缓冲液为100-150mmol/l的pb缓冲液。
作为本发明的优选方式之一，所述制备骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒的过程的步骤c中，采用的mes缓冲液为100-150mmol/l的mes缓冲液。
试剂盒中各成分功效：
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠：配制成缓冲液，主要是起到缓冲作用，保证反应过程中反应体系环境的稳定，保证检测结果不会受到波动和影响；
聚乙二醇6000：表面活性剂，增加聚氧乙烯聚丙乙烯共聚物与骨源性碱性磷酸酶的结合性；
氯化钠、氯化钾：主要作用为增加盐离子浓度；
迭氮钠：作为防腐剂，主要是防止试剂在储藏和运输中腐败变质；
tween-20：表面活性剂；
骨源性碱性磷酸酶特异抗体：与样本中抗原结合生成抗原抗体复合物，使浊度增加，引起吸光度变化。
本发明的反应原理是利用抗原抗体反应的原理：人血清中nbap与相应抗体在溶液相遇，立即形成抗原-抗体复合物，形成一定浊度；该浊度高低在一定量抗体存在时与抗原的含量成正比，在一定波长下测定浊度进行补体的定量测定。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明制备的试剂盒具有较高的检测灵敏度，操作简单、快速，从检测到出结果最多只需要6分钟，甚至更短；
(2)本发明制备的试剂盒的试剂r2中的抗体胶乳的制备由于采用的化学偶联法，稳定性好，在2-8℃至少可以保存12个月；
(3)本发明制备的试剂盒可应用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，可大规模的开展和推广。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种骨源性碱性磷酸酶检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂r1：
试剂r1：
①按照上述试剂r1的组分含量，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠溶于纯化水中，搅拌均匀，待充分溶解，配制成r1缓冲液；
②按照上述试剂r1的组分含量，将聚乙二醇6000、叠氮钠、tween-20溶于r1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂r1；
(2)按照下列组分含量配制试剂r2：
试剂r2：
①按照上述试剂r2的组分含量，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠溶于纯化水中，搅拌均匀，待充分溶解，配制成r2缓冲液；
②按照上述试剂r2的组分含量，将tween-20、聚氧乙烯聚丙乙烯共聚物、叠氮钠溶于r2缓冲液中，搅拌均匀，即得分散液；
③制备骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒：
a.将粒径为50nm的胶乳颗粒用100mmol/l的pb缓冲液稀释到浓度为1％，每毫升体积溶液中加入edac1.6mg，室温反应2h，10000rpm转速下离心30min，去上清，将沉淀悬浮于50mmol/l的mes缓冲液中，超声分散；
b.再于10000rpm转速下离心30min，弃上清，将沉淀悬浮于100mmol/l的pb缓冲液中，使其中的胶乳颗粒最终浓度为3.0％，超声分散；接着，边搅拌边加入等体积的含骨源性碱性磷酸酶抗体的pb稀释液，混合搅拌，室温反应2h，其中的胶乳颗粒最终浓度为1.5％；
c.10000rpm转速下离心30min，弃上清，沉淀悬浮于100mmol/l的mes缓冲液中，超声分散，加入bsa，4℃封闭过夜，离心去上清后，得最终所需的骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒；
④用分散液来溶解得到的骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒，使其中的胶乳颗粒终浓度为0.1％，超声分散，最终制得试剂r2。
实施例2
本实施例的一种骨源性碱性磷酸酶检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂r1：
试剂r1：
①按照上述试剂r1的组分含量，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠溶于纯化水中，搅拌均匀，待充分溶解，配制成r1缓冲液；
②按照上述试剂r1的组分含量，将聚乙二醇6000、叠氮钠、tween-20溶于r1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂r1；
(2)按照下列组分含量配制试剂r2：
试剂r2：
①按照上述试剂r2的组分含量，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠溶于纯化水中，搅拌均匀，待充分溶解，配制成r2缓冲液；
②按照上述试剂r2的组分含量，将tween-20、聚氧乙烯聚丙乙烯共聚物、叠氮钠溶于r2缓冲液中，搅拌均匀，即得分散液；
③制备骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒：
a.将粒径为80nm的胶乳颗粒用150mmol/l的pb缓冲液稀释到浓度为5％，每毫升体积溶液中加入edac1.6mg，室温反应2h，20000rpm转速下离心40min，去上清，将沉淀悬浮于100mmol/l的mes缓冲液中，超声分散；
b.再于20000rpm转速下离心40min，弃上清，将沉淀悬浮于150mmol/l的pb缓冲液中，使其中的胶乳颗粒最终浓度为3.0％，超声分散；接着，边搅拌边加入等体积的含骨源性碱性磷酸酶抗体的pb稀释液，混合搅拌，室温反应2h，其中的胶乳颗粒最终浓度为1.5％；
c.20000rpm转速下离心40min，弃上清，沉淀悬浮于150mmol/l的mes缓冲液中，超声分散，加入bsa，4℃封闭过夜，离心去上清后，得最终所需的骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒；
④用分散液来溶解得到的骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒，使其中的胶乳颗粒终浓度为2.0％，超声分散，最终制得试剂r2。
实施例3
本实施例的一种骨源性碱性磷酸酶检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂r1：
试剂r1：
①按照上述试剂r1的组分含量，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠溶于纯化水中，搅拌均匀，待充分溶解，配制成r1缓冲液；
②按照上述试剂r1的组分含量，将聚乙二醇6000、叠氮钠、tween-20溶于r1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂r1；
(2)按照下列组分含量配制试剂r2：
试剂r2：
①按照上述试剂r2的组分含量，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠溶于纯化水中，搅拌均匀，待充分溶解，配制成r2缓冲液；
②按照上述试剂r2的组分含量，将tween-20、聚氧乙烯聚丙乙烯共聚物、叠氮钠溶于r2缓冲液中，搅拌均匀，即得分散液；
③制备骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒：
a.将粒径为65nm的胶乳颗粒用125mmol/l的pb缓冲液稀释到浓度为3％，每毫升体积溶液中加入edac1.6mg，室温反应2h，15000rpm转速下离心35min，去上清，将沉淀悬浮于75mmol/l的mes缓冲液中，超声分散；
b.再于15000rpm转速下离心35min，弃上清，将沉淀悬浮于125mmol/l的pb缓冲液中，使其中的胶乳颗粒最终浓度为3.0％，超声分散；接着，边搅拌边加入等体积的含骨源性碱性磷酸酶抗体的pb稀释液，混合搅拌，室温反应2h，其中的胶乳颗粒最终浓度为1.5％；
c.15000rpm转速下离心35min，弃上清，沉淀悬浮于125mmol/l的mes缓冲液中，超声分散，加入bsa，4℃封闭过夜，离心去上清后，得最终所需的骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒；
④用分散液来溶解得到的骨源性碱性磷酸酶特异性抗体胶乳颗粒，使其中的胶乳颗粒终浓度为1.8％，超声分散，最终制得试剂r2。
实施例4
本实施例的采用上述实施例方法制备得到的骨源性碱性磷酸酶检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将2.0μl待测样品与240μl试剂r1混合，37℃孵育1min；
(2)用全自动生化分析仪在主波长405nm、副波长700nm处测定反应后的吸光度a1；
(3)再与60μl试剂r2混合，37℃孵育5min；
(4)用全自动生化分析仪在主波长405nm、副波长700nm处测定反应后的吸光度a2；
(5)根据吸光度变化值δa计算出样本中的骨源性碱性磷酸酶的浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。