伪狂犬病毒抗体快速定量检测卡及使用方法与流程

本发明涉及一种检测卡及使用，特别是涉及一种猪血清中伪狂犬病毒抗体快速定量检测卡及使用方法。

背景技术：

伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的一种高度接触性传染病。prv是双链dna病毒，属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，疱疹病毒i型。其完整病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm。有囊膜，囊膜表面有长约8～10nm呈放射状排列的纤突。

病毒基因组由长独特区(uniquelongregion，ul)、短独特区(uniqueshortregion，us)以及位于us两侧的末端重复序列(wetminalrepeat，tr)与内部重复序列(internalrepeat，ir)组成。对prv基因组序列测定发现其由72个阅读框组成，可编码70种蛋白，目前已发现和命名的有gb、gc、gd、ge、gg、gh、gl、gk、gl、gm、gn11种糖蛋白。编码gc、ge、gg、gi、gm和gn的基因为病毒复制非必需的，gb、gc、gd、ge和gi与病毒的毒力有关。此外，胸苷激酶(thymidinekinase，tk)、核苷酸还原酶(ribonucleotidereduetase，rr)、蛋白激酶(proteinkinase，pk)、碱性核酸外切酶(alkalineexonuclease，an)和脱氧尿苷三磷酸激酶(deoxyuridinetriphosphokinase，dutpase)等几种酶也与病毒的毒力密切相关，其中tk是prv最主要的毒力基因。糖蛋白gb、gc、gd在免疫诱导方面最为重要。目前已经发现prv有11种糖蛋白，其中，gb、gc、gd均为刺激机体产生中和抗体的蛋白，所产生的抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和prv的能力，因此，gb、gc、gd是研制prv亚单位疫苗的首选糖蛋白。本病毒可在猪肾细胞、兔肾细胞、牛睾丸细胞、鸡胚成纤维等原代细胞以及pk-15、bhk-21等传代细胞中都能很好的增殖，并产生明显的细胞病变和核内嗜酸性包涵体。

疫苗接种是预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病主要的措施之一。国内外已研制出猪伪狂犬病的灭活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已经相对成熟，而病毒载体重组疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗尚处于实验室研究阶段。常规的弱毒疫苗是通过在鸡和牛的细胞上多次传代而获得的，如bartha、buk、norden和nia24疫苗株，通过分子生物学方法已经证明这些疫苗株的ge基因都有部分或完全缺失。通过ge基因缺失苗可以将免疫猪与感染猪区分开来,我国目前广泛使用的pr弱毒冻干疫苗(bartha-k61)是一种gi／ge双基因缺失弱毒疫苗，由于该基因缺失而进一步阻断弱毒株回复毒力的可能性，所以大大提高了这种弱毒苗的安全性。世界上很多国家都用这个毒株做的活疫苗净化了伪狂犬病，目前国内还有鄂a株（98株）等生产，也是一种活疫苗。

2003年郭万柱主持研制的猪伪狂犬病ge-／gi-／tk-／lacz+基因缺失活疫苗sa215株正式获得国家新兽药证书。致细胞病变效应、安全性、免疫原性和接种动物抗体消长规律等生物学特性测定及田间试验结果显示，sa215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。陈焕春等也成功研制出prvgg-、ge-等单基因缺失灭活疫苗和tk-／gg-、tk-／ge-等双基因缺失弱毒疫苗。并建立了相应的区分野毒感染和疫苗免疫动物的鉴别诊断方法，为我国实施猪伪狂犬病根除计划提供了相应的技术和产品。

伪狂犬病毒的防控主要是疫苗免疫，而疫苗免疫动物与感染动物体内都会产生蛋白抗体，因此检测蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握猪群健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。

市场上大量使用检测伪狂犬病毒抗体酶标试剂盒，elisa试剂盒需要酶标仪、温育反应条件、洗板条件，操作工作环境和专业技术人员，另外检测样本还需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。而本发明专利的目的就是克服以上两类试剂盒的各自缺点，通过简单的操作，现场快速、准确、高灵敏地定量（半定量）分析，实现在养猪现场检测。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种伪狂犬病毒抗体快速定量检测卡及使用方法，克服胶体金快速检测卡和酶标试剂盒各自缺点，通过简单的操作，实现在现场快速、准确、高灵敏地定量检测，从而完全解决上述现有技术的不足之处。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种用于伪狂犬病毒抗体快速定量检测卡，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被伪狂犬病毒重组抗原为检测线，包被兔抗鸡lgy抗体为质控线，标记物为标记有伪狂犬病毒蛋白gb和gi(或ge)的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgy抗体的荧光质控微球。

进一步，所述伪狂犬病毒抗体快速定量检测卡是二合一产品，它是即能检测gb抗原产生的抗体，又可以检测gi(或ge)蛋白产生的抗体；所述硝酸纤维素膜上包被伪狂犬病毒重组抗原检测线分别是gb抗原和gi(或ge)抗原，两种检测产品区分是通过检测线位置不同来区分的；标记伪狂犬病毒蛋白gb和gi(或ge)两种重组抗原的荧光检测微球。

进一步，所述伪狂犬病毒蛋白是伪狂犬病毒gb和gi(或ge)蛋白，其为多表位表达的重组蛋白。

进一步，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的兔抗鸡lgy抗体为兔抗鸡lgy的lgg。所述检测线上伪狂犬病毒抗原制备方法，一种是采用生物信息学技术（bioinformatics）对伪狂犬病毒不同亚型毒株的gb和gi(或ge)基因进行比对，确认伪狂犬病毒gb和gi(或ge)蛋白基因序列，设计一对引物，经pcr扩增出目的gb和gi(或ge)基因，将gb和gi(或ge)基因亚克隆于ppic9k载体，转化top10感受态，pcr和酶切鉴定阳性克隆，salⅰ线性化重组穿梭质粒ppic9k-gb和ppic9k-gi（或ppic9k-ge），然后电转gs115感受态，利用g418抗性进行多拷贝整合子初步筛选，提取基因组并做pcr鉴定，得到阳性菌株，经诱导发酵后，上清发酵液提纯目标gb和gi(或ge)蛋白，经sds-page电泳检测确定制备重组蛋白分子量。

另一种制备上述伪狂犬病毒抗原的方法，采用生物信息学技术原理，应用计算机对伪狂犬病毒的蛋白gb和gi(或ge)抗原基因进行比对分析，及抗原表位预测，筛选和设计伪狂犬病毒蛋白特异性的抗原肽序列，并进行人工化学合成抗原肽。

一种上述检测卡的使用方法，所述检测卡为定量层析检测卡，将含有伪狂犬病毒抗体的待测液滴入检测卡的加样孔中，层析15分钟，然后使用层析扫描仪对检测卡进行扫描，层析扫描仪将扫描所得数据无线传输给客户端，客户端根据扫描数据计算得出检测卡上质控线和检测线的荧光信号强度值，同时客户端从云平台获得被检测伪狂犬病毒抗体的标准曲线，客户端根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中伪狂犬病毒抗体的含量。

作为优选，所述标准曲线是通过如下方式导入云平台的，首先制备一批检测卡，并配制对应的伪狂犬病毒抗体标准品，用检测卡层析标准品并用层析扫描仪检测，层析扫描仪将检测得到的数据处理传递给客户端，客户端计算得出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度值，并根据此数据进行回归从而得到伪狂犬病毒抗体的标准曲线，客户端将标准曲线传输至云平台储存。

作为优选，所述客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。

名词解释：

兔抗鸡lgy的lgg：兔抗鸡lgy的免疫球蛋白g

鸡lgy抗体：鸡卵黄抗体

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：灵敏度高，检测的批内差及批间差小，有较好的重复性，性能稳定，既可检测全血样本，也可以检测血清和血浆样本，与rv（狂犬病毒）、cdv（犬瘟热病毒)、cpiv（犬副流感病毒）、cav（犬腺病毒)、ccv（犬冠状病毒）等抗体没有交叉反应。可实现伪狂犬病毒抗体现场快速检测，具有较高的实用价值和推广价值，采用多表位表达的重组蛋白可以防止漏检，提高检测在敏感度。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是图1中试纸条的结构示意图；

图3是图2的俯视图；

图4是伪狂犬病毒抗体检测标准曲线；

图5是本发明检测卡的另一种结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

如图1至图4所示，一种伪狂犬病毒抗体快速定量检测卡，包括装配在外壳10内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板1，在塑料底板1上从左至右依次粘贴样品垫2、标记物垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5，且样品垫2的右端搭在标记物垫3的左端上，标记物垫3的右端搭在硝酸纤维素膜4的左端上，吸水纸5左端搭在硝酸纤维素膜4的右端上。所述硝酸纤维素膜4上包被伪狂犬病毒结构蛋白的重组抗原为检测线6两条，包被兔抗鸡lgy抗体为质控线7，在外壳10上对应样品垫2开设加样孔11，对应硝酸纤维素膜4上的检测线6和质控线7开设视窗孔12。

所述伪狂犬病毒重组抗原是伪狂犬病毒蛋白gb和gi(或ge)，其为多表位表达的重组蛋白。

所述硝酸纤维素膜4上质控线采用的兔抗鸡lgy抗体为兔抗鸡lgy的lgg。

所述标记物垫3由载体基层和标记物组成，标记物为标记有伪狂犬病毒gb和gi(或ge)蛋白的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgy抗体的荧光质控微球。

血样品中伪狂犬病毒抗体、伪狂犬病毒蛋白gb和gi(或ge)蛋白抗原的标记物和硝酸纤维素膜上包被伪狂犬病毒蛋白抗原是通过双抗原夹心法来检测血样本中伪狂犬病毒抗体。

作为一种优选技术方案，所述检测卡的外壳10表面对应吸水纸5的位置开设有多个通孔13，有利于溶剂挥发出外壳10，确保检测结果准确，解决了现有技术的检测卡外壳采用封闭结构，溶剂无法挥发出去的技术问题，参见图5。

为了保证挥发效果，在外壳10表面与吸水纸5大小相匹配的区域内等间距均匀开设通孔13。

作为另一种优选技术方案，所述检测卡本体倾斜固定在外壳10内，且样品垫2处于低端，吸水纸5处于高端。这种结构使得从加样孔11滴入的待测样品流速减缓，缓慢往上层析，保证足够的层析时间，能有效防止液体样品流动过快而影响检测结果，避免样品过快流入硝酸纤维素膜4导致检测结果失败。因为，如果待测样品流速过快，容易导致层析不充分，进而影响检测结果。检测卡本体倾斜的角度根据待测样品的不同具体进行设计。

作为层析检测卡的另一种优选结构，所述层析检测卡的外壳10内设有容纳槽，且在检测卡本体的两侧对称设有2个容纳槽，在容纳槽内安装有片状干燥剂。这种设计使得干燥剂与检测卡本体保持在一起，使得检测卡本体湿度得到有效控制，从而提高检测精度。

作为层析检测卡的另一种优选结构，还可以在层析检测卡的外壳10表面设置带盖的样品储存槽，可以封存样品。所述样品储存槽的盖顶面与外壳10表面齐平，盖上设有凹坑，方便使用者手指施力向外翻开盖。

实施例一、伪狂犬病毒蛋白gb蛋白的真核表达

步骤一、引物设计及目的基因的pcr扩增

根据genbank数据库中公开发表的猪伪狂犬gb基因核苷酸序列设计特异性上游引物sp1：5'-tcgaattcatgaaaaaactatttgtg-3';下游引物sp2：5'-ttgcggccgcttacatcacatggcgt-3'，斜体加黑部分为酶切位点。pichiap1：5'-gactggttccaattgacaagc-3'；p2：5'-gcaaatggcattctgacatcc-3'。以合成的gb基因组克隆为模板为模板，引物sp1、sp2进行pcr扩增反应，最后产品用0.8%琼脂糖凝胶电泳检查pcr产物。

步骤二、克隆载体ts的构建与鉴定

目的片段经凝胶回收试剂盒回收后，与pbs-t载体16℃连接，转化大肠杆菌感受态top10，经蓝白斑铺板筛选、pcr扩增、双酶切鉴定、测序分析判断重组质粒成功构建与否及片段插入载体的方向。

步骤三、表达载体ppic9k-gb的构建和鉴定

用限制性内切酶ecorⅰ、notⅰ双酶切ts质粒和穿梭质粒ppic9k，分别回收ppic9k与gb片段，16℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态top10，利用卡那霉素抗性铺板筛选，取1ul质粒建立pcr反应体系、鉴定获得的重组阳性质粒。

步骤四、重组表达载体转化酵母gs115感受态

ppic9k-gb重组质粒经salⅰ线性化，将其电转化新鲜制备的毕赤酵母gs115感受态细胞中，感受态细胞浓度约为5.5×10⁶～6.5×10⁶个/μl，然后，涂布md平板，29℃温箱孵育2～6d。

步骤五、pcr鉴定阳性整合子

不同浓度的ypd(g418)平板上筛选高抗性的整合子，g418浓度梯度为0，0.25，0.5mg/ml，直至6.0mg/ml。从6.0mg/mlg418ypd平板上挑取若干单菌落于ypd(g418)液体培养基培养过夜，用酵母基因组提取试剂盒提取基因组，用pichiap1、p2引物进行pcr扩增，鉴定阳性整合子，同时设穿梭质粒ppic9k对照。

步骤六、阳性整合子的诱导表达及最佳表达时间的确定

挑取阳性整合子的单菌落，接种于10mlbmgy培养基，29℃，200r/min振荡培养至od600为3～6。然后低速离心(3000r/min)，用bmmy培养基冲悬菌体至od600值为1，29℃，200r/min振荡培养，每24h添加100%甲醇至终浓度为1%。于诱导后的24h开始，每间隔24h取出1ml细菌培养物上清，用effendorf紫外分光光度计测定上清中蛋白浓度，根据公式:蛋白质浓度(g/l)=(1.55od280-0.75od260)×（稀释倍数)计算总蛋白量，确定蛋白表达量最高的时间为最佳表达时间。

步骤七、gb蛋白的sds-page检测

三氯乙酸(tca)沉淀1ml上清，沉淀中加入2×sds40μl上样缓冲液，煮沸10min，12%sds-page电泳检测。

同样的方法制备gi（或ge）蛋白。

实施例二、伪狂犬病毒蛋白gb和gi（或ge）蛋白采用特异性合成肽制备抗原

一种制备上述伪狂犬病毒结构蛋白gb蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤一、对伪狂犬病毒结构蛋白gb蛋白的序列分析：利用生物信息学mhcⅰ类分子预测：通过相关网站求证或应用计算机软件对prv-gb蛋白序列分析，了解其亲水性、疏水性、结构域的可及性、序列的可变性、α螺旋、β转角、抗原性等参数，再综合分析及同源建模的方法预测其三级结构，从中预测出抗原反应表位及氨基酸残基，以多肽合成仪难易程度进行综合分析设计。每条多肽链至少含有一个预测的抗原表位，共设计出5个抗原表位多肽片段。

步骤二、利用proteintec.公司（美国一家公司）的ps3型多肽合成仪，采用fmoc固相合成肽反应原理合成步骤一设计的抗原表位多肽片段，然后把多肽从fmoc树脂上切割下来，通过缩合反应再把多条多肽片段连接起来，最后用裂解液把侧链保护基团裂解下来，纯化就得到所合成的多肽，用westernblot实验确定伪狂犬病毒结构蛋白的gb蛋白。

同样的方法制备gi（或ge）蛋白。

实施例三、制备伪狂犬病毒抗体的检测卡

制备伪狂犬病毒gb抗体检测标准曲线：配置含有伪狂犬病毒抗体的校准液（含伪狂犬病毒抗体标准品）6份，浓度分别为0、1/1024、1/256、1/64、1/16、1/4（伪狂犬病毒抗体标准品倍比稀释）。将上述不同浓度的校准液分别加入装配好的检测卡的加样孔内，层析15分钟后，通过层析扫描仪进行检测，将6次得到的检测结果由客户端处理，客户端计算出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度值，并根据此数据进行线性回归做出伪狂犬病毒抗体的标准曲线，客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端将以条形码为文件名的文件（包含标准曲线）传输至云平台储存，参见图4。同样方法制备制备伪狂犬病毒gi（或ge）抗体检测标准曲线，并把两条标准曲线形成在一个文件上，两条标准曲线由检测线的不同位置来区分。

所述客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。

该检测卡的使用方法：将待检样品（以血清为例）与样品稀释液按1:40比例稀释，将稀释好的样本80ul加入加样孔11中，在吸水纸5的作用下，样本从样品垫2向吸水纸5方向移动。在避免强光照射的情况下层析15min，然后用层析扫描仪对检测卡进行检测，层析扫描仪获取检测线6和质控线7的荧光信号，层析扫描仪通过蓝牙把检测数据传到客户端，客户端根据检测数据计算出检测线的荧光信号强度值和质控线的荧光信号强度值，客户端通过扫描此批检测卡的条形码从云平台获得被检测伪狂犬病毒抗体的标准曲线，客户端根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中伪狂犬病毒抗体的含量，参见图4的标准曲线。客户端可以为手机或平板电脑。

上述检测卡的制备方法如下：

步骤一，把硝酸纤维素膜粘贴在pvc底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.5mg/ml的羊抗鸡lgy的lgg形成质控线和已稀释至0.4mg/ml的伪狂犬病毒蛋白gb和0.5mg/ml的伪狂犬病毒结构蛋白gi（或ge）的重组蛋白形成两条检测线，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤二，制备标记有鸡lgy的镧系荧光微球和标记有伪狂犬病毒蛋白gb和gi（或ge)的重组抗原的镧系荧光微球，将1ml的镧系荧光微球加入到50mg的mes（2-（n-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液（0.1m，ph7.0）中，再加入10mg碳二亚胺（edc）和10mgn-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mm硼酸缓冲液（ph8.2）复溶，加入2mg透析过的鸡lgy，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存（保存环境温度为2～8℃），即得标记有鸡lgy的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记伪狂犬病毒蛋白gb和gi（或ge)的重组抗原的镧系荧光微球；

步骤三，把标记有鸡lgy和标记有伪狂犬病毒gb和gi（或ge)蛋白的重组抗原的镧系荧光微球并分别稀释至浓度0.1μg/ml、3μg/ml和3μg/ml，采用点膜喷金机器将其喷涂在载体基层上构成标记垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤四，把样品垫、标记垫、吸水纸依次粘在pvc底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳内，即得到本伪狂犬病毒抗体检测卡。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。