R6GHO的制备及其化学发光分析方法的建立与流程

本发明属于化学发光分析领域，涉及r6gho的制备工艺以及基于罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)对亚硝酸盐的高选择性，从而建立了一种化学发光测定亚硝酸盐的新方法。

背景技术：

化学发光是指某些化学反应中发出可见光的现象。其发光机理是反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁至激发态，然后再从激发态返回基态，同时将能量以光辐射的形式释放出来，产生化学发光。最早发现的化学发光现象发生在生物体内，如萤火虫，现在称之为生物发光，是由生物体发出的可见光而得名。到了19世纪后期，人们发现简单的非生物有机化合物也能产生化学发光现象。但早期的化学发光研究进展一直比较缓慢，几乎没有获得实质性的应用。直到出现商品化的化学发光测试装置化学发光分析便得到迅速的发展，直至现在，化学发光分析的研究和应用仍然是痕量分析领域的一个十分重要的研究方向。

几十年来人们已经开发出了一系列化学发光体系，典型的有基于鲁米诺及其衍生物(环状二羧酸酰肼类)、过氧草酸酯、吖啶类化合物、联吡啶钌、多酚类、高锰酸钾等化学发光体系。可是，这几种试剂的化学发光体系所能测定的对象很有限，并且他们测定的选择性比较低。由于这些原因，开发新型化学发光体系对于促进化学发光分析法的进步具有重要意义。

罗丹明类荧光分子因具有良好的光稳定性、对ph不敏感、长波长发射和高量子产率等优点已成为最重要的荧光母体之一。作为重要的荧光材料，罗丹明类荧光分子是以氧杂蒽为母体的碱性吨染料，其羧基可与伯氨反应生成独特的五元环内酰胺结构。据此本发明利用罗丹明的特殊结构，制备了一种新的双罗丹明类化学发光试剂(罗丹明6g酰肼草酰胺)并对其化学发光性能做了系统考察，且以此建立了一种测定亚硝酸根的新的分析方法。

罗丹明6g酰肼草酰胺的分子结构式如附图1所示。

技术实现要素：

罗丹明6g酰肼草酰胺的合成工艺如下：

本发明先用罗丹明6g合成罗丹明6g酰肼，再由罗丹明6g酰肼(r6gh)和草酰氯反应制备罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)。

在制备罗丹明6g酰肼时将罗丹明6g溶于热无水乙醇中，直至其完全溶解，并在降温后边搅拌边加入80％水合联氨，水浴加热，回流2～3h。反应完成后，加入冷冻水使其析出土黄色固体，抽滤，用少量冷冻水洗涤，干燥，得到土黄色粉末。

制备罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)时，先将草酰氯用二氯甲烷稀释10倍后，再加入罗丹明6g酰肼溶液中。所有的试剂和玻璃仪器使用前应该要先干燥，加入试剂后，将搅拌的混合物放置在冷水浴中约2～3小时，然后减压除去溶剂。再用0.5mol/lhcl溶液使烧瓶中的固体全部溶解为澄清的紫红色溶液。之后，再缓慢加入0.5mol/lnaoh溶液，边加边搅拌直到溶液的ph达到8～9，经过滤，洗涤，干燥后得到紫红色固体。

罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)标准液的配制(1.00mmol/l)：用电子分析天平准确称量0.2276g罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)，放入干燥的小烧杯中，加入2ml2mol/l盐酸(hcl)，边加边搅拌，直至罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)恰好完全溶解，后加入适量水稀释，将小烧杯内的溶液转移至250ml容量瓶中，用纯净水定容至刻度并摇匀备用。

亚硝酸钠溶液(no^2-)的配制：准确称取0.0690g亚硝酸钠，溶解到100ml容量瓶中定容摇匀放置于暗处(可放1月)，其浓度为10.0mmol/l。用移液管准确移取10.00ml10.0mmol/l亚硝酸钠溶液于100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀放于暗处(可存放1星期)，此浓度为1.0mmol/l。取0.5ml1.0mmol/l亚硝酸钠溶液于100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀放于暗处(现配现用)，浓度为0.005mmol/l。

双氧水溶液：取25ml30％双氧水溶液于250ml容量瓶中，用纯净水定容，得3％的双氧水溶液备用。

本发明经实验探究发现rbho-h2o2-h⁺-no^2-体系也存在微弱的化学发光现象，但r6gho-h2o2-h⁺-no^2-体系的化学发光性能远比rbho-h2o2-h⁺-no^2-化学发光体系优异。

本发明研究发现几种试剂的混合先后顺序对化学发光信号强度略有影响，当r6gho溶液与no^2-先混合，然后再与双氧水混合的信号略大(如附图2所示)。

本发明的另一特征是罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)在酸性条件时化学发光性能很好，碱性条件下化学发光性能较弱，并且伴随背景信号增大的现象，中性条件几乎不发光。

附图3显示了r6gho浓度在0～0.6mmol/l范围内相对于化学发光强度的变化。结果表明，当r6gho浓度在0.3～0.45mmol/l范围内化学发光信号强度可达到最大值。

附图4显示了h2o2浓度对本发明化学发光体系中化学发光强度的影响，在h2o2浓度约1.5％时可以获得较大的化学发光强度信号，当h2o2浓度较低或较高时都会导致化学发光信号强度降低。

在优化条件下，本发明的r6gho-h2o2-h⁺体系对no^2-的选择性很好，基本不受其它阴离子的影响，阳离子除1000倍的cu²⁺抑制发光使其发光信号强度降低，500倍的fe³⁺以及2倍的fe²⁺可增强化学发光强度信号，此化学发光体系也几乎不受其它阳离子的干扰。

本发明原理如下：

罗丹明6g酰肼草酰胺在酸性条件下与双氧水、亚硝酸根离子反应使五元酰胺环打开，并形成强荧光物质，且伴随着能量的变化。

附图说明

图1为罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)分子结构图；

图2为本发明r6gho-h2o2-h⁺-no^2-化学发光体系的管路影响图；

图3为r6gho浓度对化学发光强度的影响图；

图4为h2o2浓度对化学发光强度的影响图；

图5为化学发光体系测no^2-的标准曲线图；

图6为动力学曲线图。

具体实施方式

本发明的具体实施例1

1)在100ml三口烧瓶中，加入2.40g罗丹明6g和60ml热无水乙醇，待罗丹明6g完全溶解后稍微冷却，然后边搅拌边逐滴加入8ml80％水合肼，热水浴回流2h。反应完成后，旋转蒸发除去部分溶剂，析出土黄色固体，抽滤，用少量冷冻水洗涤，干燥，得到2.0g土黄色色粉末，产率为95.2％。

2)向100ml双口烧瓶中加入0.912gr6gh，再加入35ml二氯甲烷，使r6gh完全溶解，然后用冷水浴冷却。再将0.1ml(稍过量)的草酰氯溶于10ml二氯甲烷中，在剧烈搅拌下滴加到上述100ml的双口烧瓶中(注意：r6gh和玻璃仪器应该使用前要先干燥)。加入后，将搅拌的混合物放置在冷水浴中约2小时，然后减压除去溶剂。再向双口烧瓶中加入0.1mol/lhcl溶液(约40ml)使烧瓶中的固体全部溶解为澄清的紫红色溶液，将溶液转移至烧杯中。之后，在搅拌下缓慢加入0.1mol/lnaoh溶液(约30ml)，直到溶液中有大量沉淀析出(溶液的ph＝8～9)，过滤得到沉淀并用水洗涤三次，在ir光下干燥后，称量得到0.741g紫红色固体，产率为76.5％。

本发明的具体实施例2

溶液的配制：

1)配制罗丹明6g酰肼草酰胺标准溶液

用分析天平准确称取0.2276g罗丹明6g酰肼草酰胺(r6gho)于50ml烧杯内，加入2ml2mol/lhcl溶液，用细玻璃棒搅拌致使r6gho全部溶解，再加入适量去离子水，然后转移至250ml容量瓶中，洗涤小烧杯与细玻璃棒，并将洗涤液一起转入上述容量瓶中，最后定容。所得r6gho标准溶液的浓度为1.00×10^-3mol/l。

2)配制亚硝酸钠(no^2-)标准溶液

用移液管准确移取10.00ml10.0mmol/l亚硝酸钠溶液于100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀放于暗处，得1.0mmol/l的亚硝酸钠(no^2-)储备液。

r6gho-h2o2-h⁺体系流动注射化学发光分析测定no^2-的实验条件探究：

罗丹明6g酰肼草酰胺最佳浓度的确定：固定双氧水、亚硝酸钠(no^2-)溶液的浓度为一定值，配制不同浓度的罗丹明6g酰肼草酰胺溶液，然后进行发光测试，发现罗丹明6g酰肼草酰胺溶液浓度过大或者过小都会导致化学发光的强度信号降低，当罗丹明6g酰肼草酰胺溶液浓度为0.3～0.45mmol/l时化学发光强度值达到最大(如附图3)。

双氧水最佳浓度的确定：固定罗丹明6g酰肼草酰胺溶液、亚硝酸钠(no^2-)溶液的浓度为一定值，配制不同浓度的双氧水溶液，然后进行发光测试，经测试发现将30％的双氧水稀释20倍时，该体系的化学发光强度达到最大值。

本发明化学发光体系测定水相中no^2-的方法：

准确称取0.0728g罗丹明6g酰肼草酰胺于50ml小烧杯内，加入1ml2mol/lhcl搅拌至罗丹明6g酰肼草酰胺全部溶解，加入适量水，将其转移至250ml容量瓶，洗涤玻璃棒和小烧杯2～3次，洗涤液全部转移至容量瓶，定容摇匀，既得0.32mmol/l罗丹明6g酰肼草酰胺溶液。用移液管准确移取5ml30％双氧水于100ml容量瓶中，定容使其浓度为1.5％。最后取8支25ml的比色管，分别编号①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧，按浓度由高到低配制一定浓度梯度的no^2-，进行化学发光测试并绘制标准曲线(附图6)。

本发明的化学发光体系的选择性分析：

为了研究本发明的化学发光系统对检测no^2-的选择性，在优化条件下，向1.0×10^-3mmol/lno^2-的标准溶液中加入一定量的干扰离子，最后考察发现该化学发光体系不受nh4⁺、na⁺、al³⁺、zn²⁺、ca²⁺、ba²⁺、ag⁺、mg²⁺、mn²⁺、ni²⁺、hg²⁺、cr³⁺、no^3-、cl^-、br^-、clo3^-、so4^2-、po4^3-等离子的干扰；但2倍的fe²⁺、100倍的fe³⁺、1000倍的co²⁺、5000倍的so3^2-能使化学发光强度增加；700倍的s2o3^2-、1000倍的clo^-抑制发光，使发光强度信号降低。

本发明的具体实施例3

本发明化学发光体系测定唾液中的no^2-含量：

样品处理：唾液样品来自于四个志愿者，在收集样品之前要求漱口。收集到的样品先以12000r/min的速度离心10min除去唾液中的蛋白质，随后取1ml上层清液于100ml容量瓶中定容备用。

依据本发明所建立的分析方法，在优化条件下对样品中的亚硝酸根离子含量进行测定，并与标准方法进行对比，结果列于表1。经实验结果表明，本发明所建立的r6gho-h2o2-h⁺化学发光体系测定no^2-的选择性好、准确度和精密度高(r.s.d为0.4％～4.8％)。

表1唾液中no^2-含量测定结果