本发明涉及一种生物标志物检测方法，具体是一种基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法。
背景技术：
：随着人类基因组计划(humangenomicproject，HGP)的完成，人们逐渐将研究靶向转变对蛋白质组(proteome)的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提出，指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学(proteomics)是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互作用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整体层次上对蛋白质进行动态研究。蛋白质是生命活动的执行者，是基因表达的产物，其表达、修饰、功能以及彼此相互作用均受到遗传及环境因素的影响，于是机体出现疾病状态必然会引起蛋白质含量或者存在形式的变化，这些变化的蛋白质分子可以为临床疾病诊断的物质基础提供依据。蛋白质组学主要是运用现代先进的检测技术，检测机体从小到一个细胞到大至整个机体的全部基因所表达的蛋白质的特性，比较分析生理或病理状态、用药及不用药状态下的差异表达蛋白质，找出不同状态下个体表达差异的蛋白质，从而为生命的物质基础、疾病的早期检测与诊断等研究寻找分子诊断标志物提供依据。近年来，随着现代科学及生物化学的微量检测分析技术的发展创新，唾液作为一种临床容易采集而且操作过程完全没有创伤性的体液逐渐进入了人们研究活动的视角，且具有无法估计的科研潜力以及临床应用前景。首先，相比血清标本而言，唾液标本的采集更安全，具有无创性，采集过程中患者无痛苦，易于接受，而且无血源性疾病传播的风险存在；与尿液标本相比，唾液标本具有可实时采样、更方便的优点。此外，唾液检测需要的样本量小、成本低、易于储存和运输。最重要的是，唾液标本成分与血液、尿液等体液成分具有极高的相似性，对疾病诊断具有极强的敏感性和特异性。唾液是人体常见的一种重要体液，其包涵大量的激素、蛋白质、酶、抗体、补体、细胞因子及各种微生物等血液成分，这些血液成分通过顺浓度梯度被动的跨细胞膜转运或逆浓度梯度的主动转运等途径分泌在唾液当中，且随体内病理生理变化的影响而呈动态变化过程。研究唾液的PH值、电解质、生化指标、微生物、免疫指标、蛋白质等成分变化与疾病的关系，发现唾液成分的变化可作为疾病诊断、疗效判断、药物监测的参考指标，在临床疾病的诊治活动中具有重要的潜在应用价值。根据目前的文献资料显示，唾液不仅能够作为艾滋病、乙型肝炎等传染性疾病、口腔恶性肿瘤及乳腺癌等恶性肿瘤的诊断标志，而且也可以应用于糖尿病、关节炎、心脏病及肾脏疾病等各个系统疾病的诊断，从而成为目前西方国家研究者热衷的取代血清学检查的首选标本。唾液具有消化食物、润滑、防御保护、缓冲、机械清洗、抗菌以及内分泌等生物作用，而蛋白质和多肽是唾液成分中最主要的具有生物学功能的物质，目前已发现唾液蛋白质和多肽有2300多种，主要有α-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、溶菌酶、乳铁蛋白、黏蛋白等蛋白质，其中有98％的唾液蛋白质是富酪蛋白及转铁蛋白。然而，通过对已发现的唾液蛋白质的功能进行分类，发现功能未知的蛋白质占有28.7％(比例最大)，与免疫功能相关的蛋白质占21％，与蛋白质复制及修复相关的蛋白质占1.6％，与细胞动力及分泌相关的蛋白质占4.8％，与转录和核糖体相关的蛋白质占2.3％，与细胞繁殖及细胞循环相关的占4.2％，而与信号传导、代谢、细胞骨架及内膜相关的蛋白质分别占9.7％、5.2％、7.1％等。可见，生物功能尚处于未知状态的唾液蛋白质仍占有相当大的比例，需要进一步研究挖掘，且意义重大。新近研究证实，大通量、大精度的蛋白组学技术的应用，使唾液蛋白质生物标记用于疾病的早期诊断预防、生物蛋白质靶向治疗、预后监测判断等均成为可能。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种安全可靠、有效率高的基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法，以解决上述
背景技术：
中提出的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；(8)检测结果：对肝癌脾虚证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，肝癌脾虚证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个。差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q66K66，基因注释为Transmembraneprotein198；2)检索号为Q9ULD9，基因注释为Zincfingerprotein608；3)检索号为Q8IVF7，基因注释为Formin-likeprotein3；4)检索号为O60282，基因注释为Kinesinheavychainisoform5C；5)检索号为Q86V2，基因注释为Kinesin-likeproteinKIF27；6)检索号为P06727，基因注释为ApolipoproteinA-IV；7)检索号为P13473，基因注释为Lysosome-associatedmembraneglycoprotein2；8)检索号为P31151，基因注释为ProteinS100-A7；9)检索号为O75629，基因注释为ProteinCREG1；10)检索号为P35321，基因注释为Cornifin-A；11)检索号为Q9Y239，基因注释为Nucleotide-bindingoligomerizationdomain-containingprotein1；12)检索号为Q9BRA2，基因注释为Thioredoxindomain-containingprotein17；13)检索号为Q07654，基因注释为Trefoilfactor3；14)检索号为P31949，基因注释为ProteinS100-A11；15)检索号为Q96RM1，基因注释为Smallproline-richprotein2F；16)检索号为Q6ZUA9，基因注释为Maestroheat-likerepeatfamilymember5；17)检索号为P68032，基因注释为Actin,alphacardiacmusle1；18)检索号为P01598，基因注释为IgkappachainV-IregionEU；19)检索号为P01708，基因注释为IglambdachainV-IIregionBUR；20)检索号为P83593，基因注释为IgkappachainV-IVregionSTH(Fragment)；21)检索号为P02814，基因注释为Submaxillaryglandandrogen-regulatedprotein3B；22)检索号为Q6P158，基因注释为PutativeATP-dependentRNAhelicaseDH57；23)检索号为Q9UBH0，基因注释为Interleukin-36receptorantagonistprotein；24)检索号为P49221，基因注释为Protein-glutaminegamma-glutamyltransferase4；25)检索号为P00480，基因注释为Ornithinecarbamoyltransferase,mitochondrial；26)检索号为P68871，基因注释为Hemoglobinsubunitbeta；27)检索号为P01871，基因注释为IgmuchainCregion；28)检索号为O75038，基因注释为1-phosphatidylinositol4,5-bisphosphatephosphodiesteraseeta-2；29)检索号为P31025，基因注释为Lipocalin-1；30)检索号为P01612，基因注释为IgkappachainV-IregionMev；31)检索号为P19957，基因注释为Elafin；32)检索号为P08697，基因注释为Alpha-2-antiplasmin；33)检索号为P32119，基因注释为Peroxiredoxin-2；34)检索号为Q7L0X2，基因注释为Glutamate-richprotein6；35)检索号为Q9UL2，基因注释为Ras-relatedproteinRab-21；36)检索号为P22528，基因注释为Cornifin-B；37)检索号为Q9Y5Y6，基因注释为Suppressoroftumorigenicity14protein；38)检索号为P69905，基因注释为Hemoglobinsubunitalpha；39)检索号为P01743，基因注释为；IgheavychainV-IregionHG3；40)检索号为Q6ZP82，基因注释为Coiled-coildomain-containingprotein141；41)检索号为Q01469，基因注释为Fattyacid-bindingprotein,epidermal；42)检索号为P01860，基因注释为Iggamma-3chainCregion；43)检索号为P09211，基因注释为GlutathioneS-transferaseP；44)检索号为Q8TED4，基因注释为Sugarphosphateexchanger2；45)检索号为P04179，基因注释为Superoxidedismutase[Mn],mitochondrial；46)检索号为P01624，基因注释为IgkappachainV-IIIregionPOM；47)检索号为P1059，基因注释为Thioredoxin；48)检索号为O95274，基因注释为Ly6/PLAURdomain-containingprotein3；49)检索号为Q9GZN4，基因注释为Brain-specificserineprotease4；50)检索号为Q9ULV4，基因注释为Coronin-1C；51)检索号为P35270，基因注释为Sepiapterinreductase；52)检索号为Q86SG5，基因注释为ProteinS100-A7A；53)检索号为P01764，基因注释为IgheavychainV-IIIregion23；54)检索号为P06870，基因注释为Kallikein-1；55)检索号为Q96PD5，基因注释为N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase；56)检索号为Q9UHY7，基因注释为Enolase-phosphataseE1；57)检索号为Q3ZCW2，基因注释为Galectin-relatedprotein；60)检索号为Q92692，基因注释为Nectin-2；61)检索号为P01834，基因注释为IgkappachainCregion；62)检索号为P00915，基因注释为Carbonicanhydrase1；63)检索号为P01771，基因注释为IgheavychainV-IIIregionHIL；64)检索号为P01857，基因注释为Iggamma-1chainCregion；65)检索号为P04220，基因注释为Igmuheavychaindiseaseprotein；66)检索号为P00450，基因注释为Ceruloplasmin；67)检索号为P00734，基因注释为Prothrombin；68)检索号为Q6MZM9，基因注释为Proline-richprotein27；69)检索号为P01610，基因注释为IgkappachainV-IregionWEA；70)检索号为P02763，基因注释为Alpha-1-acidglycoprotein1；71)检索号为P15328，基因注释为Folatereceptoralpha；72)检索号为P02042，基因注释为Hemoglobinsubunitdelta；73)检索号为O60701，基因注释为UDP-glucose6-dehydrogenase；74)检索号为O00154，基因注释为CytosolicacylcoenzymeAthioesterhydrolase；75)检索号为P41439，基因注释为Folatereceptorgamma；76)检索号为Q14126，基因注释为Desmoglein-2；77)检索号为Q92734，基因注释为ProteinTFG；78)检索号为Q92876，基因注释为Kallikrein-6；79)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin-1；80)检索号为P19404，基因注释为NADHdehydrogenase[ubiquinone]flavoprotein2,mitochondrial；81)检索号为P02787，基因注释为Serotransferrin；82)检索号为P22532，基因注释为Smallproline-richprotein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tal6B；36)检索号为P04438，基因注释为IgheavychainV-IIregionSESS；37)检索号为O43852，基因注释为Calumenin；38)检索号为Q9UHY1，基因注释为Nuclearreceptor-bindingprotein；39)检索号为Q12841，基因注释为Follistatin-relatedprotein1；40)检索号为Q9UPT6，基因注释为C-Jun-amino-terminalkinase-interactingprotein3；41)检索号为Q06828，基因注释为Fibromodulin；42)检索号为Q9H4M9，基因注释为EHdomain-containingprotein1；43)检索号为Q0491714-3-3，基因注释为proteineta；44)检索号为Q9HCU9，基因注释为Breastcancermetastasis-suppressor1；45)检索号为P05089，基因注释为Arginase-1；46)检索号为Q96RS0，基因注释为Trimethylguanosinesynthase；47)检索号为Q8IWF6，基因注释为ProteinDENND6A；48)检索号为Q92521，基因注释为GPImannosyltransferase3；49)检索号为P33241，基因注释为Lymphocyte-specificprotein1；50)检索号为Q96FZ7，基因注释为Chargedmultivesicularbodyprotein6；51)检索号为Q9ULZ3，基因注释为Apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD；52)检索号为P25787，基因注释为Proteasomesubunitalphatype-2；53)检索号为O60361，基因注释为Putativenucleosidediphosphatekinase；54)检索号为Q8TAX7，基因注释为Mucin-7；55)检索号为Q92688，基因注释为Acidicleucine-richnuclearphosphoprotein32familymemberB；56)检索号为P40394，基因注释为Alcoholdehydrogenaseclass4mu/sigmachain；57)检索号为Q14289，基因注释为Protein-tyrosinekinase2-beta；58)检索号为P55008，基因注释为Allograftinflammatoryfactor1；59)检索号为P08571，基因注释为MonocytedifferentiationantigenCD14；60)检索号为P21439，基因注释为Multidrugresistanceprotein3；61)检索号为O95777U6，基因注释为snRNA-associatedSm-likeproteinLSm8；62)检索号为Q96DA0，基因注释为Zymogengranuleprotein16homologB；63)检索号为Q16651，基因注释为Prostasin；64)检索号为Q9Y4Y9，基因注释为U6snRNA-associatedSm-likeproteinLSm5；65)检索号为P26583，基因注释为HighmobilitygroupproteinB2；66)检索号为Q9H008，基因注释为Phospholysinephosphohistidineinorganicpyrophosphatephosphatase；67)检索号为P01742，基因注释为IgheavychainV-IregionEU；68)检索号为Q15631，基因注释为Translin；69)检索号为Q9HC38，基因注释为Glyoxalasedomain-containingprotein4；70)检索号为Q9Y376，基因注释为Calcium-bindingprotein39；71)检索号为Q96DR5，基因注释为BPIfold-containingfamilyAmember2；72)检索号为P07477Trypsin-1；73)检索号为Q96C19，基因注释为EF-handdomain-containingproteinD2；74)检索号为P16870，基因注释为CarboxypeptidaseE；75)检索号为Q8NI35，基因注释为InaD-likeprotein；76)检索号为P05362，基因注释为Intercellularadhesionmolecule1；77)检索号为P15374，基因注释为Ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozymeL3；78)检索号为Q6ZNW5，基因注释为GDP-D-glucosephosphorylase1；79)检索号为Q15370，基因注释为TranscriptionelongationfactorBpolypeptide2；80)检索号为P0CG05，基因注释为Iglambda-2chainCregions；81)检索号为P30740，基因注释为Leukocyteelastaseinhibitor；82)检索号为Q7Z6J4，基因注释为FYVE,RhoGEFandPHdomain-containingprotein2；83)检索号为Q9H7L9，基因注释为Sin3histonedeacetylasecorepressorcomplexcomponentSDS3；84)检索号为P00533，基因注释为Epidermalgrowthfactorreceptor；85)检索号为P30046，基因注释为D-dopachromedecarboxylase；86)检索号为Q96BQ1，基因注释为ProteinFAM3D；87)检索号为Q9NP98，基因注释为Myozenin-1；88)检索号为P31146，基因注释为Coronin-1A；89)检索号为O75503，基因注释为Ceroid-lipofuscinosisneuronalprotein5；90)检索号为P63279，基因注释为SUMO-conjugatingenzymeUBC9；91)检索号为Q8IUE6，基因注释为HistoneH2Atype2-B；92)检索号为Q9NZ53，基因注释为Podocalyxin-likeprotein2；93)检索号为Q8NF91，基因注释为Nesprin-1；94)检索号为Q9BS40，基因注释为Latexin；95)检索号为P09382，基因注释为Galectin-1；96)检索号为Q9BRF8，基因注释为Serine/threonine-proteinphosphataseCPPED1；97)检索号为P08579，基因注释为U2smallnuclearribonucleoproteinB”；98)检索号为P49720，基因注释为Proteasomesubunitbetatype-3；99)检索号为P52566，基因注释为RhoGDP-dissociationinhibitor2；100)检索号为Q8NC60，基因注释为Nitricoxide-associatedprotein1；101)检索号为P10909，基因注释为Clusterin；102)检索号为P01712，基因注释为glambdachainV-IIregionWIN；103)检索号为P23280，基因注释为Carbonicanhydrase6；104)检索号为Q8IWQ3，基因注释为Serine/threonine-proteinkinaseBRSK2；105)检索号为Q86VR7，基因注释为V-setandimmunoglobulindomain-containingprotein10-like；106)检索号为Q99439，基因注释为Calponin-2；107)检索号为Q9GZZ8，基因注释为Extracellularglycoproteinlacritin；108)检索号为O43707，基因注释为Alpha-actinin-4；109)检索号为P62253，基因注释为Ubiquitin-conjugatingenzymeE2G1；110)检索号为Q13421，基因注释为Mesothelin；111)检索号为P35237，基因注释为SerpinB6；112)检索号为P14550，基因注释为Alcoholdehydrogenase[NADP(+)]；113)检索号为P06737，基因注释为Glycogenphosphorylase,liverform；114)检索号为O00584，基因注释为RibonucleaseT2；115)检索号为P62993，基因注释为Growthfactorreceptor-boundprotein2；116)检索号为P01707，基因注释为IglambdachainV-IIregionTRO；117)检索号为P01036，基因注释为Cystatin-S；118)检索号为P35908，基因注释为Keratin,typeIIcytoskeletal2epidermal；119)检索号为O95684，基因注释为FGFR1oncogenepartner；120)检索号为O75891，基因注释为Cytosolic10-formyltetrahydrofolatedehydrogenase；121)检索号为Q86VD1，基因注释为MORCfamilyCW-typezincfingerprotein1；122)检索号为Q9Y490，基因注释为Talin-1；123)检索号为P05154，基因注释为Plasmaserineproteaseinhibitor；124)检索号为O15143，基因注释为Actin-relatedprotein2/3complexsubunit1B；125)检索号为O75563，基因注释为Srckinase-associatedphosphoprotein2；126)检索号为A0M8Q6，基因注释为Iglambda-7chainCregion；127)检索号为Q6JBY9，基因注释为CapZ-interactingprotein。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现肝癌脾虚证中的特异性蛋白标记物，为肝癌脾虚证早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。附图说明图1为本发明中iTRAQ定量蛋白质组学实验的基本流程示意图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。请参阅图1，基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用。(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析。iTRAQ技术是一种同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术，可用于蛋白质的相对和绝对定量研究。本研究是基于iTRAQ技术，联合串联质谱蛋白质组学方法((liquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry，LC-MS/MS)，主要目的是通过肝癌脾虚证与正常健康人群对照，定量检测唾液中的差异蛋白表达情况，同时为进一步筛选与肝癌脾虚证证候相关的蛋白质或蛋白质组提供研究参考，从蛋白水平研究肝癌脾虚证的证候本质。1.材料与方法1.1病例选择1.1.1诊断标准(1)疾病诊断标准肝癌的诊断根据《内科学》的诊断标准。(2)中医证型诊断标准脾虚证诊断标准：1.1.2纳入标准①符合诊断标准，年龄在20-75岁之间；②未经手术和放化疗；③自愿且能够配合参加的受试对象。以上3项必须全部符合才能纳入。1.1.3排除标准①不符合上述诊断标准者；②年龄＜20或＞75岁者；③患有口腔局部及唾液腺的炎症、消化道溃疡、肿瘤及先天性疾病；患有舍格伦综合征、囊性纤维病；患有其他系统严重并发疾病。1.1.4质量控制①釆用统一诊断标准、统一调查表格、统一调查方法；②调査者在调査时严格按照“标准化”执行，减少调查者偏倚，确保资料的一致性和真实性；③病理结果均由1月内三级甲等医院诊断。1.2病例资料本研究自2014年12月-2015年04月共收集符合诊断和纳入标准的肝癌脾虚证患者11例，全部病例来源于湖南省肿瘤医院胃十二指肠胰腺外科，均经病理检查确诊。患者年龄24-73岁，中位年龄56岁，男39例，女18例，肿瘤类型(低分化腺癌35例，中-低分化腺癌5例，高分化腺癌1例，中分化腺癌2例，其他类型14例)。正常对照组45例，其中男28例，女17例，年龄23-72岁，中位年龄52岁，均来自于湖南中医药大学附属第一医院体检科健康自愿者。该研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，受试者在受试前已知情，且获得书面同意。1.3分组设计肝癌脾虚证组VS正常对照组，为减少实验误差，肝癌脾虚证组和正常对照组各进行2组技术重复。1.4主要仪器及试剂耗材1.4.1主要仪器(表1)表1主要仪器1.4.2主要试剂与耗材(表2)表2主要试剂与耗材1.5实验方法与技术1.5.1取材按照本课题专用临床观察表进行临床观察记录。取材前一天晚上临睡前清水漱口三次(不再进任何食物和药物)，采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起后漱口前空腹取材。由经过培训的课题组专人取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，患者将已经过消毒的无菌小圆柱形棉花含入口中，口腔唾液积聚至一定量后，将该棉花吐入置于冰浴中的15mL唾液离心管内，4℃下静置1h后，3000r/min、4℃下离心10min，冰浴上分装在1mLEP管中，每管200μL，于-80℃冰箱冷冻保存。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测唾液样本均1次冻融。1.5.2iTRAQ工作流程1.5.2.1样本处理及iTRAQ定量实验流程如图1所示：(1)样品蛋白提取；(2)蛋白定量；(3)蛋白酶解；(4)iTRAQ标记；(5)高pH条件下的反相色谱分离；(6)ABI-5600进行蛋白质分析；(7)质谱数据分析。1.5.2.2样品蛋白提取过程①样本中加入适量裂解缓冲液(7M尿素，2M硫脲，0.1％CHAPS)，涡旋混匀；②超声60s，0.2son、2soff，振幅22％；③室温提取30min；④15000r/min、4℃离心20min，小心取出上清；⑤收集上清，分装分装后冻存于-80℃。1.5.2.3蛋白定量采用Bradford法[MarionM.Bradford.AnalyticalBiochemistry，1976，72:248-254]测定提取的蛋白浓度。先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品(将BSA用裂解缓冲液溶解成系列浓度的标准蛋白)各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值(见表1)，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线。根据曲线公式计算各样品蛋白浓度。1.5.2.4蛋白酶解(FilterAidedSamplePreparation，FASP)①蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中。②加入4μl还原剂，60℃反应1h。③加入2μl半胱氨酸阻断剂，室温10min。④将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液。⑤加入iTRAQ试剂盒中的溶解缓冲液100μl，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次(为节省试剂，这步可以将溶解缓冲液用水稀释5倍后使用)。⑥更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg(与蛋白质量比1:50)，体积50μl，37℃反应过夜。⑦次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部。⑧在超滤管中加入50μl溶解缓冲液5，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品。1.5.2.5iTRAQ标记1.5.2.5.1iTRAQ标记实验步骤①从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将试剂离心至管底。②向每管试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底。③取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中。④将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h。⑤加入100μl水终止反应。⑥为了检测标记效率及定量准确性，从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF(ABSCIEX4800Plus)鉴定，确认标记反应良好。⑦混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底。⑧真空冷冻离心干燥。⑨抽干后的样品冷冻保存待用。1.5.2.5.2样品标记情况(表3)表3样品标记情况编号样品名称标记试剂标签1正常组-11132正常组-21143肝癌脾虚证组-11174肝癌脾虚证组-21181.5.2.6酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析1.5.2.6.1高pH条件下的反相色谱分离(1)所需试剂的调配流动相A：98％ddH2O，2％乙腈(pH10)流动相B：98％乙腈，2％ddH2O(pH10)ddH2O用氨水调pH值到10。(2)实验步骤①混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用。②使用400μg酶解好的BSA进行分离(柱温45℃，检测波长214nm)，检测系统情况。③取100ul准备好的样本上样。④流速0.7ml/min，分离梯度如下(表4)：表4第一次分离梯度时间(min)流动相B比例(％)055835186232649568957251.5.2.6.2ABI-5600质谱进行蛋白质分析(1)所需试剂的调配流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸(2)实验步骤①将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶。②12000r/min离心10min，吸取上清上样。③上样体积10μl，采取夹心法上样。④装载泵流速350nl/min，15min。⑤分离流速350nl/min，分离梯度如下(表5)：表5第二次分离梯度时间(min)流动相B比例(％)045154025653570958295854904(3)质谱参数设置a)离子源参数：喷涂电压：2.1kv；毛细管温度：250℃；离子源：简单喷雾源；DP：100；b)FullMS：分辨率：70000FWHM；全扫描控制目标：1e6；全扫描Max.IT：60ms；扫描范围：350-1800m/z；c)dd-MS2：分辨率：17500FWHM；AGC目标：5e6；最大IT：70ms；强度阈值：5.00E+03；破碎方法：HCD；NCE：29％；TopN：20。1.5.2.7质谱数据分析(1)数据库数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在选择数据库时，遵循如下原则，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。本次使用数据库uniprot数据库。(2)检索软件iTRAQ的质谱分析是由ABI-5600型质谱完成，产生的质谱原始文件采用ABI公司的配套商用软件ProteinPilot处理。2.结果本实验对肝癌脾虚证和正常对照组进行了对比实验。应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对肝癌脾虚患者唾液的全组蛋白进行鉴定和定量分析，初步获得肝癌脾虚证患者的蛋白组差异表达图谱。定量蛋白质组学研究结果显示：应用iTRAQ技术一共鉴定1310个蛋白；与正常对照组相比，肝癌脾虚证中鉴定到的显著差异蛋白(1.5倍以上表达差异)共283个，其中上调蛋白156个，下调蛋白127个。差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q66K66，基因注释为Transmembraneprotein198；2)检索号为Q9ULD9，基因注释为Zincfingerprotein608；3)检索号为Q8IVF7，基因注释为Formin-likeprotein3；4)检索号为O60282，基因注释为Kinesinheavychainisoform5C；5)检索号为Q86V2，基因注释为Kinesin-likeproteinKIF27；6)检索号为P06727，基因注释为ApolipoproteinA-IV；7)检索号为P13473，基因注释为Lysosome-associatedmembraneglycoprotein2；8)检索号为P31151，基因注释为ProteinS100-A7；9)检索号为O75629，基因注释为ProteinCREG1；10)检索号为P35321，基因注释为Cornifin-A；11)检索号为Q9Y239，基因注释为Nucleotide-bindingoligomerizationdomain-containingprotein1；12)检索号为Q9BRA2，基因注释为Thioredoxindomain-containingprotein17；13)检索号为Q07654，基因注释为Trefoilfactor3；14)检索号为P31949，基因注释为ProteinS100-A11；15)检索号为Q96RM1，基因注释为Smallproline-richprotein2F；16)检索号为Q6ZUA9，基因注释为Maestroheat-likerepeatfamilymember5；17)检索号为P68032，基因注释为Actin,alphacardiacmusle1；18)检索号为P01598，基因注释为IgkappachainV-IregionEU；19)检索号为P01708，基因注释为IglambdachainV-IIregionBUR；20)检索号为P83593，基因注释为IgkappachainV-IVregionSTH(Fragment)；21)检索号为P02814，基因注释为Submaxillaryglandandrogen-regulatedprotein3B；22)检索号为Q6P158，基因注释为PutativeATP-dependentRNAhelicaseDH57；23)检索号为Q9UBH0，基因注释为Interleukin-36receptorantagonistprotein；24)检索号为P49221，基因注释为Protein-glutaminegamma-glutamyltransferase4；25)检索号为P00480，基因注释为Ornithinecarbamoyltransferase,mitochondrial；26)检索号为P68871，基因注释为Hemoglobinsubunitbeta；27)检索号为P01871，基因注释为IgmuchainCregion；28)检索号为O75038，基因注释为1-phosphatidylinositol4,5-bisphosphatephosphodiesteraseeta-2；29)检索号为P31025，基因注释为Lipocalin-1；30)检索号为P01612，基因注释为IgkappachainV-IregionMev；31)检索号为P19957，基因注释为Elafin；32)检索号为P08697，基因注释为Alpha-2-antiplasmin；33)检索号为P32119，基因注释为Peroxiredoxin-2；34)检索号为Q7L0X2，基因注释为Glutamate-richprotein6；35)检索号为Q9UL2，基因注释为Ras-relatedproteinRab-21；36)检索号为P22528，基因注释为Cornifin-B；37)检索号为Q9Y5Y6，基因注释为Suppressoroftumorigenicity14protein；38)检索号为P69905，基因注释为Hemoglobinsubunitalpha；39)检索号为P01743，基因注释为；IgheavychainV-IregionHG3；40)检索号为Q6ZP82，基因注释为Coiled-coildomain-containingprotein141；41)检索号为Q01469，基因注释为Fattyacid-bindingprotein,epidermal；42)检索号为P01860，基因注释为Iggamma-3chainCregion；43)检索号为P09211，基因注释为GlutathioneS-transferaseP；44)检索号为Q8TED4，基因注释为Sugarphosphateexchanger2；45)检索号为P04179，基因注释为Superoxidedismutase[Mn],mitochondrial；46)检索号为P01624，基因注释为IgkappachainV-IIIregionPOM；47)检索号为P1059，基因注释为Thioredoxin；48)检索号为O95274，基因注释为Ly6/PLAURdomain-containingprotein3；49)检索号为Q9GZN4，基因注释为Brain-specificserineprotease4；50)检索号为Q9ULV4，基因注释为Coronin-1C；51)检索号为P35270，基因注释为Sepiapterinreductase；52)检索号为Q86SG5，基因注释为ProteinS100-A7A；53)检索号为P01764，基因注释为IgheavychainV-IIIregion23；54)检索号为P06870，基因注释为Kallikein-1；55)检索号为Q96PD5，基因注释为N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase；56)检索号为Q9UHY7，基因注释为Enolase-phosphataseE1；57)检索号为Q3ZCW2，基因注释为Galectin-relatedprotein；60)检索号为Q92692，基因注释为Nectin-2；61)检索号为P01834，基因注释为IgkappachainCregion；62)检索号为P00915，基因注释为Carbonicanhydrase1；63)检索号为P01771，基因注释为IgheavychainV-IIIregionHIL；64)检索号为P01857，基因注释为Iggamma-1chainCregion；65)检索号为P04220，基因注释为Igmuheavychaindiseaseprotein；66)检索号为P00450，基因注释为Ceruloplasmin；67)检索号为P00734，基因注释为Prothrombin；68)检索号为Q6MZM9，基因注释为Proline-richprotein27；69)检索号为P01610，基因注释为IgkappachainV-IregionWEA；70)检索号为P02763，基因注释为Alpha-1-acidglycoprotein1；71)检索号为P15328，基因注释为Folatereceptoralpha；72)检索号为P02042，基因注释为Hemoglobinsubunitdelta；73)检索号为O60701，基因注释为UDP-glucose6-dehydrogenase；74)检索号为O00154，基因注释为CytosolicacylcoenzymeAthioesterhydrolase；75)检索号为P41439，基因注释为Folatereceptorgamma；76)检索号为Q14126，基因注释为Desmoglein-2；77)检索号为Q92734，基因注释为ProteinTFG；78)检索号为Q92876，基因注释为Kallikrein-6；79)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin-1；80)检索号为P19404，基因注释为NADHdehydrogenase[ubiquinone]flavoprotein2,mitochondrial；81)检索号为P02787，基因注释为Serotransferrin；82)检索号为P22532，基因注释为Smallproline-richprotein2D；83)检索号为B3EWG3，基因注释为ProteinFAM25A；84)检索号为P68402，基因注释为Platelet-activatingfactoracetylhydrolaseIBsubunitbeta；85)检索号为O75506，基因注释为Heatshockfactor-bindingprotein1；86)检索号为P01770，基因注释为IgheavychainV-IIIregionNIE；87)检索号为Q8IVW1，基因注释为ADP-ribosylationfactor-likeprotein17；88)检索号为P01040，基因注释为Cystatin-A；89)检索号为P04217，基因注释为Alpha-1B-glycoprotein；90)检索号为P04181，基因注释为Ornithineaminotransferase,mitochondrial；91)检索号为P05388，基因注释为60SacidicribosomalproteinP0；92)检索号为Q15223，基因注释为Nectin-1；93)检索号为P0C870，基因注释为JmjCdomain-containingprotein7；94)检索号为P20160，基因注释为Azurocidin；95)检索号为P02768，基因注释为Serumalbumin；96)检索号为O15231，基因注释为Zincfingerprotein185；97)检索号为Q96PF2，基因注释为Testis-specificserine/threonine-proteinkinase2；98)检索号为Q8NI51，基因注释为TranscriptionalrepressorCTCFL；99)检索号为P01859，基因注释为Iggamma-2chainCregion；100)检索号为P02760，基因注释为ProteinAMBP；101)检索号为P08236，基因注释为Beta-glucuronidase；102)检索号为Q9Y3D6，基因注释为Mitochondrialfission1protein；103)检索号为P80188，基因注释为Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin；104)检索号为Q6UW32，基因注释为Insulingrowthfactor-likefamilymember1；105)检索号为O75131，基因注释为Copine-3；106)检索号为Q04760，基因注释为Lactoylglutathionelyase；107)检索号为Q9BPV8，基因注释为P2Ypurinoceptor13；108)检索号为P58062，基因注释为SerineproteaseinhibitorKazal-type7；109)检索号为P02749，基因注释为Beta-2-glycoprotein1；110)检索号为P02774，基因注释为VitaminD-bindingprotein；111)检索号为P01762，基因注释为IgheavychainV-IIIregionTRO；112)检索号为P00738，基因注释为Haptoglobin；113)检索号为P01767，基因注释为IgheavychainV-IIIregionBUT；114)检索号为P02671，基因注释为Fibrinogenalphachain；115)检索号为P04003，基因注释为C4b-bindingproteinalphachain；116)检索号为Q96L46，基因注释为Calpainsmallsubunit2；117)检索号为Q9NZH8，基因注释为Interleukin-36gamma；118)检索号为P31944，基因注释为Caspase-14；119)检索号为P02753，基因注释为Retinol-bindingprotein4；120)检索号为Q13740，基因注释为CD166antigen；121)检索号为Q8WWY7，基因注释为WAPfour-disulfidecoredomainprotein12；122)检索号为O75116，基因注释为Rho-associatedproteinkinase2；123)检索号为Q14210，基因注释为Lymphocyteantigen6D；124)检索号为P0CG39，基因注释为POTEankyrindomainfamilymemberJ；125)检索号为Q9UKR3，基因注释为Kallikrein-13；126)检索号为P01605，基因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ularadhesionmolecule1；77)检索号为P15374，基因注释为Ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozymeL3；78)检索号为Q6ZNW5，基因注释为GDP-D-glucosephosphorylase1；79)检索号为Q15370，基因注释为TranscriptionelongationfactorBpolypeptide2；80)检索号为P0CG05，基因注释为Iglambda-2chainCregions；81)检索号为P30740，基因注释为Leukocyteelastaseinhibitor；82)检索号为Q7Z6J4，基因注释为FYVE,RhoGEFandPHdomain-containingprotein2；83)检索号为Q9H7L9，基因注释为Sin3histonedeacetylasecorepressorcomplexcomponentSDS3；84)检索号为P00533，基因注释为Epidermalgrowthfactorreceptor；85)检索号为P30046，基因注释为D-dopachromedecarboxylase；86)检索号为Q96BQ1，基因注释为ProteinFAM3D；87)检索号为Q9NP98，基因注释为Myozenin-1；88)检索号为P31146，基因注释为Coronin-1A；89)检索号为O75503，基因注释为Ceroid-lipofuscinosisneuronalprotein5；90)检索号为P63279，基因注释为SUMO-conjugatingenzymeUBC9；91)检索号为Q8IUE6，基因注释为HistoneH2Atype2-B；92)检索号为Q9NZ53，基因注释为Podocalyxin-likeprotein2；93)检索号为Q8NF91，基因注释为Nesprin-1；94)检索号为Q9BS40，基因注释为Latexin；95)检索号为P09382，基因注释为Galectin-1；96)检索号为Q9BRF8，基因注释为Serine/threonine-proteinphosphataseCPPED1；97)检索号为P08579，基因注释为U2smallnuclearribonucleoproteinB”；98)检索号为P49720，基因注释为Proteasomesubunitbetatype-3；99)检索号为P52566，基因注释为RhoGDP-dissociationinhibitor2；100)检索号为Q8NC60，基因注释为Nitricoxide-associatedprotein1；101)检索号为P10909，基因注释为Clusterin；102)检索号为P01712，基因注释为glambdachainV-IIregionWIN；103)检索号为P23280，基因注释为Carbonicanhydrase6；104)检索号为Q8IWQ3，基因注释为Serine/threonine-proteinkinaseBRSK2；105)检索号为Q86VR7，基因注释为V-setandimmunoglobulindomain-containingprotein10-like；106)检索号为Q99439，基因注释为Calponin-2；107)检索号为Q9GZZ8，基因注释为Extracellularglycoproteinlacritin；108)检索号为O43707，基因注释为Alpha-actinin-4；109)检索号为P62253，基因注释为Ubiquitin-conjugatingenzymeE2G1；110)检索号为Q13421，基因注释为Mesothelin；111)检索号为P35237，基因注释为SerpinB6；112)检索号为P14550，基因注释为Alcoholdehydrogenase[NADP(+)]；113)检索号为P06737，基因注释为Glycogenphosphorylase,liverform；114)检索号为O00584，基因注释为RibonucleaseT2；115)检索号为P62993，基因注释为Growthfactorreceptor-boundprotein2；116)检索号为P01707，基因注释为IglambdachainV-IIregionTRO；117)检索号为P01036，基因注释为Cystatin-S；118)检索号为P35908，基因注释为Keratin,typeIIcytoskeletal2epidermal；119)检索号为O95684，基因注释为FGFR1oncogenepartner；120)检索号为O75891，基因注释为Cytosolic10-formyltetrahydrofolatedehydrogenase；121)检索号为Q86VD1，基因注释为MORCfamilyCW-typezincfingerprotein1；122)检索号为Q9Y490，基因注释为Talin-1；123)检索号为P05154，基因注释为Plasmaserineproteaseinhibitor；124)检索号为O15143，基因注释为Actin-relatedprotein2/3complexsubunit1B；125)检索号为O75563，基因注释为Srckinase-associatedphosphoprotein2；126)检索号为A0M8Q6，基因注释为Iglambda-7chainCregion；127)检索号为Q6JBY9，基因注释为CapZ-interactingprotein。其中多个差异蛋白(如Cadherin-1(CDH1)、Celldivisioncontrolprotein42homolog(CDC42)、Growthfactorreceptor-boundprotein2(GRB2)、Ankyrin-3(ANK3)、Guaninenucleotide-bindingproteinG(k)subunitalpha(GNAI3)等)参与了一些重要的代谢途径，可能与肝癌的发生、发展、预后密切相关。iTRAQ标记技术可同时分离和鉴定上千种蛋白质，能够最大程度地反映蛋白质组的信息。应用iTRAQ定量蛋白质组学研究我们发现了多个可能极具价值的肝癌脾虚证早期唾液无创伤分子诊断生物标志物；进一步揭示了肝癌脾虚证分子组学水平的物质基础与科学内涵，为其进一步的发生发展机制及其生物标志物研究打下了良好的基础。本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现肝癌脾虚证中的特异性蛋白标记物，为肝癌脾虚证早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。当前第1页1 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