本申请要求于2016年8月1日提交的美国临时申请第62/369,321号的优先权，通过引用将其公开内容合并于此。本公开大体上涉及用于快速克隆和表征t细胞受体的组合物和方法。
背景技术：
：：肿瘤抗原特异性t细胞经由异二聚体t细胞受体(tcr)识别癌症靶标，而该异二聚体t细胞受体识别加载在癌细胞上的主要组织相容性复合物(mhc)分子上的源自肿瘤抗原的肽。tcrα链和β链二者中的高度多样化序列(尤其是它们的补体决定区3(cdr3)中的序列)决定了mhc限制性和肽特异性。将自体肿瘤抗原特异性t细胞过继转移到癌症患者对于治疗癌症患者是有前景的治疗性策略。为了克服扩增大量的来自患者的自体肿瘤抗原特异性t细胞的局限性所带来的挑战，已经开发了具有肿瘤抗原特异性tcr基因的外周大量t细胞群体的基因工程。已经广泛证明了tcr基因工程化的t细胞具有与针对癌症靶标的亲本t细胞克隆可比较的抗肿瘤作用。测试tcr基因工程化t细胞的临床试验已经证明了其对于多种肿瘤类型具有可行性、安全性和治疗性效果。然而，仅开发了有限数量的治疗性抗肿瘤tcr基因，这限制了这种强有力的治疗性策略在癌症患者中的广泛应用。传统上，从在体外扩增的充分表征的肿瘤抗原特异性t细胞克隆获得肿瘤抗原特异性tcrα链和β链基因。然而，以高通量方式建立靶向各类肿瘤抗原和mhc限制性元件的肿瘤抗原特异性t细胞克隆是费力且在技术上具有挑战性。最近，单细胞方法，如单细胞pcr(g.c.wang,p.等人，sci.transl.med.4,128ra142(2012)；e.kobayashi,等人，nat.med.19,1542-1546(2013)；s.seitz,等人，proc.natl.acad.sci.usa103,12057-12062(2006)；g.dossinger,等人，plosone8,e61384(2013)；a.han,j等人，nat.biotechnol.32,684-692(2014))和乳液pcr((m.a.turchaninova,等人，eur.j.immunol.43,2507-2515(2013)；d.j.munson,等人，proc.natl.acad.sci.usa113,8272-8277(2016))已经成功确定了肿瘤抗原特异性tcr对。然而，从癌症样本中获得高质量的抗肿瘤t细胞需要收集并处理相对大量的手术样本，对于所有患者而言这可能是不可行的。可替换地，已经利用下一代测序(ngs)来确定来自肿瘤样本的成对的tcrα链和β链序列((c.linnemann,等人，nat.med.19,1534-1541(2013)；a.gros,等人，nat.med.22,433-438(2016)；a.pasetto,a等人，cancerimmunol.res.4,734-743(2016)；b.howie,等人，sci.transl.med.7,301ra131(2015))。在该方法中，获得了几乎完整的肿瘤浸润性t细胞的tcrα序列和β序列，并且基于每个样本中的匹配频率预测了tcrα链和β链基因的配对。然而，采用该方法估计tcr基因的绝对频率仍然具有挑战性，因为存在显著比例的t细胞表达两种tcrα链基因(padovan等人，science262,422-424(1993))。此外，在基于单细胞和基于ngs的方法中，对于许多候选对，终点结果通常是配对tcr基因序列。然后，需要多种繁琐程序(如合成tcr表达盒、表达载体中克隆和测试针对靶抗原的反应性)以确定治疗性tcr基因候选物。总而言之，快速确定肿瘤反应性tcr基因以用于个体化过继性t细胞疗法仍然存在重大挑战。因此，对于快速确定肿瘤反应性tcr基因的改进方法，存在持续和未满足的需求。本公开与此需求相关。技术实现要素：本公开提供了用于克隆tcr的方法、组合物、重组dna分子和试剂盒。特别地，本公开提供了从含有抗原特异性t细胞的生物样品构建tcr表达文库的新方法，所述生物样品包括但不限于肿瘤活组织检查物，包括冷冻的肿瘤活组织检查物。构建了tcr表达盒，并在24小时内通过无偏pcr扩增组装有tcr恒定区的tcrα链和β链可变区以在逆转录病毒质粒载体中进行克隆。通过由肿瘤抗原特异性t细胞克隆构建表达tcr的载体并且功能性评估经tcr基因转导的t细胞，成功验证了该方法。该方法适合用于肿瘤抗原特异性t细胞浸润的冷冻卵巢肿瘤样本。使源自肿瘤的tcr文库在来自健康志愿者的外周t细胞上表达，以用于通过采用mhc/肽四聚体试剂来筛选肿瘤抗原特异性tcr对。单轮筛选确定了功能性肿瘤抗原特异性tcr对。用源自文库的tcr基因工程化的外周t细胞在肿瘤异种移植模型中表现出有效的治疗性抗肿瘤作用。因此，本文提供的方法可以有效快速地提供表达肿瘤特异性tcr的病毒载体，用于以个体化方式制备治疗性抗肿瘤t细胞产物。在某些实施方式中，本公开提供了从任何含有t细胞的生物样品的t细胞tcr克隆多种tcrα链和β链可变序列的组合物和方法。在一些实施方式中，本公开涉及从t细胞的寡克隆群体克隆tcrα链和β链可变序列。在某些实现方式中，t细胞的寡克隆群体包括可识别由癌细胞表达的抗原的t细胞，其中该抗原与恶性表型相关。在一种方法中，本公开包括：从t细胞(如从寡克隆t细胞群体)获得rna，其中rna包含编码tcrα链和β链可变序列的mrna，并从mrna产生第一单链cdna，其中该第一单链cdna包括编码tcrα链的单链cdna和编码tcrβ链的单链cdna，其中采用逆转录和寡聚-dt引物来产生单链cdna，以获得从mrna扩增的第一链cdna的样品。将包含从编码tcrα链和β链可变序列的mrna扩增的第一链cdna的样品分开，使得存在至少两种含有第一链cdna的样品。在一个实施方式中，将从mrna扩增的第一链cdna样品分为第一样品和第二样品(其可以简单地包括：从第一链cdna合成反应中取出等分试样，并将其置于单独的容器中)，并且进行第一样品的pcr反应和第二样品的pcr反应以获得双链cdna。在一个实施方式中，在第一样品中，进行第二链cdna合成以获得编码tcrβ链的双链cdna。这通过采用表1中称为httcr#c-1至httcr#c-45的全部或部分引物(即，采用所有45种引物或部分这些引物)来进行。在第二样品中，采用表1中httcr#f-1至httcr#f-49的全部或部分引物(即，采用所有49种引物或部分这些引物)来进行第二链cdna合成，以获得编码tcrα链的双链cdna。在获得可以包含编码多种不同tcrα链和β链可变序列的序列的双链cdna之后，将第一样品和第二样品暴露于核酸外切酶中一段时期，其足以降解未合并到扩增子中的引物，并且降解可能存在的单链cdna。然后，通过例如使用热处理使核酸外切酶失活。在核酸外切酶处理(如果进行的话)之后，该方法包括采用标签特异性引物httcr#a-acttaagcttggtaccgagctcggatctgcggccgccaccatg(seqidno：1)和引物httcr#b-ctcaaacacagcgacctcgggtgggaacac(seqidno：2)在第一样品中对编码tcrβ链的扩增子进行pcr扩增，以获得编码tcrβ链的扩增子，其中编码tcrβ链的扩增子可以还包含限制性核酸内切酶识别位点、kozak序列和翻译起始atg序列之一或组合。该方法包括采用标签特异性引物httcr#dggagacgtggaagaaaaccccggtcccatg(seqidno：48)和ht-tcr#eaggcagacagacttgtcactggatttagag(seqidno：49)在第二样品中对编码tcrα链的扩增子进行pcr扩增，以获得编码tcrα链的扩增子，其中扩增子可以还包含p2a序列和起始atg序列。然后，该方法包括将编码tcrβ链和tcrα链的扩增子组装成dna载体以提供多种dna载体，其中每种dna载体包含编码仅一种tcrβ链和仅一种tcrα链的dna区段。因此，载体可以编码tcrβ链和tcrα链的不同对，它们并不是由用作克隆过程的起始材料的样品中的任一t细胞一起表达的。在一些实施方式中，可以通过dna接头片段(如2a-翻译跳跃位点片段)连接tcrβ链和tcrα链。在一些实施方式中，可以通过例如将编码tcrβ链和tcrα链的扩增子与一种或两种dna片段(如与常见或不可变的tcrcβ-2a片段或者tcrcβ-2a片段和tcrcα片段)混合来进行链组装。图1步骤5和图18举例说明了本公开在该方面的非限制性实例。也可以采用其它技术用于载体组装，包括但不必限于不依赖于连接的克隆、gibson组装克隆或鉴于本公开益处将由本领域技术人员可确认的任何类似的组装载体技术。可替换地，可以通过采用例如httcr#aβ链标签特异性正向引物和httcr#e反向引物由重叠pcr将该片段组装成包含编码tcrvβ、cβ、2a、vα序列的区段的单个片段。图16a描绘了该方法的非限制性实例。在一些实施方式中，提供了多种dna载体，并且多种dna载体中的每种载体仅编码来自t细胞的tcr的单种tcrβ链和单种tcrα链。在一些实施方式中，本公开采用寡克隆t细胞群体作为起始材料，其可以包括已经浸润肿瘤的t细胞。肿瘤的类型并不受特别限制，并且在一些实施方式中包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或肝癌、骨髓瘤、肉瘤，由白血病、淋巴瘤或黑素瘤形成的肿瘤。在一些实施方式中，用于作为起始材料的样品包括表达免疫原性肿瘤抗原的癌细胞，其中免疫原性肿瘤抗原的非限制性实例包括ny-eso-1、wt1、muc1、lmp2、hpve6和e7、egfrviii、her2/neu、mage-a3、p53、ny-eso-1、psma、gd2、cea、malana/mart1、突变ras、gp100、蛋白酶3、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、mage-a1、mage-a4、mage-c1、mage-c2、plac1、sp17、trp-2、周期素b1、间皮素、叶酸受体α和患者特异性新抗原。在一些实施方式中，通过本公开的方法制备的dna载体能够在淋巴细胞中表达tcrα链和tcrβ链，使得淋巴细胞表现出针对由癌细胞表达的抗原的抗原特异性。本公开包括向淋巴细胞中引入至少一种dna载体并允许表达由至少一种载体编码的tcrβ链和tcrα链，使得淋巴细胞表达包含tcrβ链和tcrα链的功能性tcr。本公开包括确定淋巴细胞是否表现出针对由癌细胞所表达的抗原的抗原特异性。本公开还包括任何类型的细胞，包括包含至少一种根据本公开的任何方法制备的dna载体的淋巴细胞。这类淋巴细胞可以识别与起始材料样品中的t细胞可识别的癌细胞类型和抗原相同的任何癌细胞类型和任何抗原。这类淋巴细胞也可以表现出改善的抗原识别特性。本公开还提供了包含本文描述的引物组合以及用于实施本公开方法的试剂(如包含合适的限制性核酸内切酶识别序列和编码半胱氨酸修饰的cα片段的区段的目的载体)的试剂盒。该试剂还可以包含一种或多种用于进行第一链cdna合成和/或第二链cdna合成的缓冲液，例如逆转录酶和/或dna聚合酶。附图说明图1.扩增tcr基因并将其克隆到逆转录病毒质粒载体中。(a)tcr表达盒的示意图。使用的缩写是：ltr，长末端重复；ψ，包装信号；sa，剪接受体位点；和wre：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。(b)tcr扩增和克隆程序。在实施例中描述了详细的程序。为简单起见，仅示出了tcrβ链的步骤1-4。对于α链，采用不同引物(步骤2中为httcr#f和步骤4中为httcr#d和#e)在分开的管中进行步骤2-4。寡聚dt区段的序列是seqidno：120。图13示出了组合的tcrβ链和tcrα链合成。寡聚dt序列是seqidno：132。图2.从肿瘤抗原特异性t细胞克隆构建表达tcr的逆转录病毒载体。(a)vjα和vdjβ片段的扩增。如图1b所示进行tcr基因的pcr扩增，并且在琼脂糖凝胶上对产物进行电泳并用溴化乙锭显现。泳道1-4：ny-eso-1特异性cd8+t细胞克隆；泳道5-9：ny-eso-1特异性cd4+t细胞克隆；和泳道10：jurkatt淋巴瘤细胞系。(b)从大量质粒载体切除tcr表达盒。从合并的大肠杆菌菌落获得大量质粒，并用noti和paci限制酶消化。(c)逆转录病毒转导后的tcr转基因的表达。将大量质粒用于产生逆转录病毒颗粒。用vβ亚型特异性抗体对经逆转录病毒载体转导的多克隆活化的t细胞进行染色。(d)将tcr基因转导的t细胞与特异性mhc/肽四聚体结合。用相应的四聚体对经hlab*35限制性ny-eso-1(94-102)肽特异性kq-tcr和hlaa*02限制性ny-eso-1(157-165)肽特异性jd-tcr转导的t细胞进行染色，并且通过流式细胞术进行分析。(e)识别表达ny-eso-1的癌细胞系。在莫能菌素存在下，将tcr基因转导的t细胞与癌细胞共培养6小时。通过细胞内染色检查ifn-γ和tnf-α的表达。图3.外周多克隆t细胞的tcr基因文库的构建和表征。(a)从多克隆t细胞扩增vjα和vdjβ片段。从3个健康个体的pbmc的cdna扩增tcr基因，并且在琼脂糖凝胶上对产物进行电泳并用溴化乙锭显现。(b，c)外周t细胞和tcr基因文库转导的j.rt3中vβ亚型频率的比较。通过流式细胞术测定pbmc中表达vβ亚型的cd3+t细胞和tcr基因文库转导的j.rt3的频率。由于vβ亚型特异性抗体的有限的可用性，3种供体中被这些抗体中的任一种染色的外周t细胞的总百分数分别为59％、62％和57％。将j.rt3的频率归一化为外周t细胞中的相应百分数。(b)将表达vβ亚型的cd3+pbmc的频率相对于j.rt3的相应值作图。(c)比较cd3+pbmc和j.rt3的平均频率。每个条形示出平均频率和标准偏差。*：p<0.05；**：p<0.01，双尾配对t检验。图4.源自肿瘤的tcr基因文库的构建。(a)tcr基因文库构建和筛选的程序。(1)选择富含肿瘤反应性t细胞的肿瘤样本进行实验。(2)从cdna扩增tcr基因，(3)与β链恒定区-p2a融合基因片段一起随机组装到目标质粒载体中。(4)用tcr文库转导来自健康个体的活化的外周t细胞，并且采用mhc/肽四聚体试剂分选肿瘤抗原特异性。(5)从分选出的被四聚体染色的细胞的基因组dna中扩增tcr转基因，和(6)重新组装至目的载体。(7)通过二代文库转导活化的t细胞并测试肿瘤抗原特异性。(b)以hla-cw*03/ny-eso-1(92-100)四聚体对tcr文库转导的t细胞进行染色。用源自肿瘤的tcr表达逆转录病毒文库转导活化的t细胞。转导后两天，将细胞用四聚体染色，然后用cd8染色。图5.源自文库的肿瘤抗原特异性tcr的表征。(a)对经二代tcr基因文库(secondarytcrgenelibrary)转导的t细胞进行四聚体染色。(b)经二代tcr基因文库转导的t细胞对同源肽的反应性。在莫能菌素存在下，将转导的t细胞与ny-eso-1(92-100)肽脉冲的或未脉冲的cw*03+靶细胞共培养6小时，并且在细胞表面cd8染色后进行细胞内ifn-γ染色。(c)癌细胞的反应性。用或不用ifn-γ处理cw*03+ny-eso-1+a27802天，并且用作tcr基因转导的t细胞的细胞内ifn-γ染色的靶细胞。(d)二代tcr基因文库转导的t细胞的治疗性效果。用ifn-γ体外处理cw*03+ny-eso-1+a27802天，并且皮下接种于nsg小鼠中。在第3天，向小鼠输注经转导的或未经转导的二代tcr文库的t细胞，或未处理小鼠。通过测量肿瘤直径监测肿瘤生长。*：p<0.05，双尾t检验。图6.构建用于tcr基因克隆的目的质粒。(a)目的质粒载体的示意图。为了产生目的质粒，采用正义引物(tggcgccggtgatgtgaaagaccccacctgtag(seqidno:116)，(sgrai位点用斜体表示)和反义引物(aatgtcgactatgcggccgcagatccgagctcggtacc(seqidno:117)(sali和noti位点用斜体表示)通过pcr扩增pdon-5逆转录病毒载体中的从5'长末端重复(ltr)至多克隆位点(mcs)的片段。将dna片段进行柱纯化，并用sgrai和sali限制酶处理，并且插入至基于鼠源干细胞病毒(mscv)的逆转录病毒质粒pmig-w(addgene质粒#12282))中。该质粒含有作为填充基因片段的tcr表达盒。在填充物tcr表达盒中，对cα区进行修饰以提供pspomi识别位点，用于与noti一起切除填充片段，在载体片段中留下cα编码区的3'部分。为了产生含有pspomi的tcr表达盒，通过采用(1)正义引物(accagctggggccctctaaatccagtgacaagtctgtctgcc(seqidno：99)，(pspomi位点用斜体表示)和反义引物(attgtcgacttaattaatcagctggaccacagccg(seqidno:100)(sali和paci位点用斜体表示)和(2)载体特异性正义引物(aattgatccgcggccgccaccatg(seqidno:131)(noti位点用斜体表示)和反义引物(gagggccccagctggtacacggcaggg(seqidno:101)(pspomi位点用斜体表示)来制备两种在α链恒定区中含有pspomi识别位点的dna片段。通过重叠延伸pcr融合两种pcr片段。将融合片段引入至质粒载体中的noti和sali位点。采用的缩写是：5'ltr：5'hcmv/mlv杂交长末端重复；sa：来自人延伸因子1α内含子-外显子连接的剪接受体位点；wre：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；3'ltr：mscvltr。(b)在组装反应期间pspomi修饰的校正。(1)修饰tcrα链恒定区以提供识别pspomi的序列；(2)组装前的tcrvjα和限制酶处理且纯化的载体片段的序列；(3)在组装反应过程中，两种片段在反应混合物中被5'→3'核酸外切酶降解，从而将载体片段中的识别人工pspomi的序列除去；和(4)组装后，tcrvjα片段的正链dna和载体片段的负链dna形成天然tcrcα序列。图7.表达ny-eso-1特异性tcr的t细胞的四聚体染色。由4种ny-eso-1特异性cd8+t细胞克隆(al、jd、kq和pp)构建表达ny-eso-1特异性tcr的逆转录病毒载体。作为tcr基因对照，从jurkat构建表达tcr的载体。通过逆转录病毒载体转导来自健康供体pbmc的多克隆活化的t细胞，并且用指定的四聚体染色。示出了以cd8设置门的染色细胞。图8.由表达mhcii类限制性ny-eso-1特异性tcr的t细胞识别天然加工的ny-eso-1。由5种ny-eso-1特异性cd4+t细胞克隆(sb、jm、3b5、5b8和pb-t)构建表达ny-eso-1特异性tcr的逆转录病毒载体。通过逆转录病毒载体转导来自健康供体pbmc的多克隆活化的t细胞并且与所示的表达ny-eso-1的表达mhcii类的癌细胞系共培养6小时，或者在莫能菌素的存在下用ny-eso-1蛋白脉冲。在细胞表面cd4染色后，对细胞内ifn-γ和tnf-α进行染色。示出了以cd4设置门的染色细胞。图9.源自肿瘤的表达tcr的二代文库中单个克隆的表征。由原初文库转导的t细胞中的分离的四聚体+t细胞构建二代文库。通过二代文库质粒转化大肠杆菌感受态细胞。(a)采用httcr#a和httcr#e引物由菌落pcr对克隆中的tcr插入物进行pcr扩增。在所示的dna片段中，灰色区域源自t细胞，而空心区是常见区域。这些常见区域不包含识别alui的位点和两种识别mspi的位点。(b)采用指定的限制酶消化(a)中的pcr扩增子，并且用琼脂糖凝胶进行电泳。通过消化模式确定所富集的克隆，并且以三角形、箭头和星形符号指示相同的克隆。图10.从二代文库选择ny-eso-1特异性tcr克隆。在二代文库中确定ny-eso-1特异性tcr克隆。从图s4中的选定克隆中分离质粒。通过逆转录病毒载体转导来自健康供体pbmc的多克隆活化的t细胞，并且用hla-cw*03/ny-eso-1(92-100)四聚体进行染色。图11.tcrα链和β链mrna的结构。在重组vα和jα及vβ、dβ和jβ期间，将核苷酸在连接处随机插入或使其缺失，这导致cdr3区域中的多样性极高。图12.表达载体和修饰tcr表达盒的实例。该实例示出了逆转录病毒质粒载体。限制酶位点为tcr插入物提供了克隆位点。通常将kozak序列定义为gccrcc，其中r是a或g，这能够实现有效的翻译。通过2a翻译跳跃位点(包括f2a、e2a、t2a或p2a)将tcrα链和β链连接起来，这使得能够化学计量两条链的表达。可替换地，可以采用其它的序列(如内部核糖体进入位点(ires))。可以将恒定区(cα和cβ)修饰为包含半胱氨酸残基，以通过形成二硫键来增强表达的tcrα链和β链的配对。图13.扩增tcr基因并将其克隆至图1中扩展形式的逆转录病毒质粒载体中以包含tcrα链合成。图14.来自t细胞克隆的vα和vβcdna的pcr扩增的实例。克隆#1/#2/#3/#4是cd8+t细胞克隆，克隆#5/#6/#7/#8是cd4+t细胞克隆，并且克隆#10是jurkatt淋巴瘤细胞。m是分子量标准品(marker)，来自赛默科技的generulerdnaladdermix。图15.当样品是单个t细胞或t细胞克隆时，采用多重引物扩增tcr可变链片段的替代性方法。该方法不适合用于寡克隆t细胞样品。图16.通过重叠pcr组装tcrvβ、cβ、vα片段的替代性方法(a)。在cα区域中引入nrui限制酶位点(b)。将该质粒用作克隆的noti/swai处理的扩增子的替代性目的载体，该noti/swai处理的扩增子是如(a)所示采用httcr#a和httcr#e-swai由重叠pcr获得的。由模板质粒经pcr扩增来制备tcrcβ-2a融合片段(c)。图17.通过重叠pcr组装tcrvβ、cβ和vα片段的实例。#1克隆#2/#3/#4/#5是cd4+t细胞克隆，克隆#6/#7/#8/#9/#10是cd8+t细胞克隆，并且克隆#1是jurkatt淋巴瘤细胞。m是分子量标准品，来自赛默科技的generulerdnaladdermix。图18.通过不依赖于连接的克隆来组装4个片段的替代性方法。如上所述获得了tag-vβdβjβ-xβ、cβ-2a、2a-vαjα-cα片段。采用httcr#i和httcr#j和含有该片段的模板(如质粒)由pcr扩增获得了cα-标签片段。图19.通过重叠pcr组装4个片段的替代性方法。采用不依赖于连接的克隆或采用限制酶(在该实例中为noti和paci)和dna连接酶将为完整tcr表达盒的扩增子克隆到表达质粒载体中。图20.提供了“高通量”的1天tcr克隆方案的代表性流程图。具体实施方式除非本文另有定义，否则本公开中使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。贯穿本说明书中给出的每个数值范围包括其上限值和下限值，以及落入其中的每个较窄的数值范围，如同这些较窄的数值范围都在本文中明确写出一样。本公开大体上涉及自体肿瘤抗原特异性t细胞的过继转移，其是治疗癌症患者的有效治疗性方法。用肿瘤抗原特异性tcr或嵌合抗原受体(car)基因对患者的外周t细胞进行基因工程化是克服挑战以从患者样本中获得足够数量的肿瘤抗原特异性t细胞的实用方法。在实体瘤中，因为大多数已知的肿瘤特异性抗原是细胞内蛋白质(如癌-睾丸抗原)，因此tcr基因而不是car基因可能更适合于制备治疗性t细胞产物。然而，由于众多的hla类型和肿瘤抗原表达模式，需要对不同肿瘤抗原和hla限制性元件具有特异性的大量tcr基因以用于治疗患有不同肿瘤类型的广泛患者群体。本公开涉及发现肿瘤抗原特异性tcrα链和β链对，并且提供从肿瘤抗原特异性t细胞浸润的肿瘤组织构建随机配对的tcr表达文库的快速方法。与需要单细胞混悬液的其它方法相比，目前的方法仅需要可以在大多数临床场所制备的快速冷冻的肿瘤样本，尽管该方法适合用于新获得的样品。如下面更加详细描述的，在总rna提取和逆转录之后，通过通用引物(而不是tcrvα或vβ特异性多重引物)扩增tcrα链和β链的可变区，以使pcr偏差最小化。采用高效克隆平台，将这些可变片段组装为表达盒。通过本公开提供的组合物和方法，可以在24小时内将源自肿瘤浸润性t细胞的tcr文库制备为逆转录病毒表达质粒，如图20中所示。然后，我们将tcr文库利用逆转录病毒转导到外周t细胞中，以筛选相关的肿瘤抗原特异性tcr。我们在单轮筛选后，从3个冷冻卵巢肿瘤样本中的2个样本中成功确定出肿瘤抗原特异性tcr对。重要的是，如体外肿瘤识别所证明的，通过这种独特方法获得的tcr具有功能。此外，我们通过在肿瘤异种移植模型中过继转移t细胞证明了源自文库的tcr的治疗性潜力。尽管在次优病毒滴度下由源自肿瘤的tcr表达文库感染的t细胞的频率相对较低，但是通过识别肿瘤反应性tcr的能力证明了本方法的稳健性。有趣的是，尽管原始肿瘤样本含有高频四聚体反应性cd8+t细胞，但是源自肿瘤的文库之一(肿瘤#1)并不含有显著比例的肿瘤反应性tcr。用于t细胞染色的单细胞混悬液和用于rna提取的样本可以含有不同比例的四聚体反应性t细胞。可替换地，四聚体反应性t细胞可以由寡克隆群体组成，其中在文库中形成功能性tcr对的概率呈指数降低。在本公开中，采用文库(3×105)以进行筛选。该文库大小被认为足以从t细胞克隆获得正确的tcr对(多于总t细胞数量的1％)，并且鉴于本公开的益处，可以通过采用电转化的感受态细胞以从更少的t细胞克隆中确定特异性tcr对来容易地扩大文库大小。已知已经将免疫球蛋白重链和轻链的随机配对文库用于确定针对包括癌症在内的治疗性靶标的新抗体(d.sanchez-martin,等人，trendsbiotechnol.33,292-301(2015))。通常，免疫球蛋白重链和轻链是经pcr扩增的，并经由接头肽随机融合以产生单链可变片段。然后，通过筛选用于结合靶抗原的文库来分离具有所需特异性的配对。然而，该方法尚未用于确定抗原特异性tcr异二聚体基因。本公开的结果首次证明源自肿瘤的随机配对tcr文库是有效确定肿瘤抗原特异性tcr对的有用资源。此外，我们能够快速直接地产生含有新tcr的病毒载体构建体，这不仅加速了筛选过程，而且提供了一种有效工具以基因工程化t细胞，用于过继转移研究。与通过单细胞pcr、乳液pcr或pairseq平台从单个细胞获得配对的tcrα链和β链序列的其它方法相比，本方法产生了识别癌症靶标的人工tcr对，与天然肿瘤抗原特异性tcr对相比，具有极高的亲和力。然而，已知人工tcr对具有与其它抗原(包括在正常组织中高表达的抗原)交叉反应的可能性。如同在亲和力增强的tcr或鼠源tcr中发现的，tcr基因工程化t细胞产物的脱靶毒性是确定亲和力高的非天然tcr的严重问题。对于临床应用，尽管测试脱靶反应性对于任何治疗性tcr基因都是重要的，但是通过当前方法确定的治疗性tcr基因的候选物可以更广泛地测试针对一组正常组织和含有tcr表位的同源序列的基因的交叉反应性。因此，本公开建立了用于发现和确定可以以病毒载体构建体形式直接用于针对癌症的有效治疗性过继细胞疗法的下游翻译验证的相关tcr的新的快速方法。更详细地，本公开大体上涉及用于快速克隆tcr的组合物和方法，和用于产生重组tcr(如tcr文库)的方法。如在本公开中所使用的，“重组tcr”是指由引入细胞的多核苷酸编码并且能够由其表达的tcr，这表示在引入多核苷酸之前，细胞中的染色体序列并不编码该tcr。本公开包括本文所公开的每种和所有的多核苷酸序列，以及不同序列的所有组合和所有亚组合。在某些实施方式中，本公开提供的组合物和方法包含寡核苷酸引物，因此可以包含引物组分。在某些方面，本公开的引物组分包含引物序列的任何组合或由引物序列的任何组合组成，其中引物序列选自本公开的表中所呈现的序列。本公开包括所有克隆步骤和所有克隆中间体，包括但不必是与rna和/或dna退火的引物、完全和部分的双链扩增子、限制性消化物及其片段(包括具有平末端或者5'或3'单链突出端的片段)、线性质粒、重叠引物等。可以按照顺序地或同时地进行本文描述的方法的某些步骤，并且可以在单个反应或单独反应中进行，如从特定实施方式和附图的描述中显而易见的。如将通过下文和本公开附图更加详细描述的，提供了用于从哺乳动物细胞群体扩增tcr编码序列的方法，使得可以将编码tcr的序列合并至编码和表达功能性tcr的表达载体中。因此，本公开涉及预期可用于开发和用于适合用于多种病症的治疗性方法的tcr的克隆、表达和功能表征。因此，本公开涉及可用于产生被编程为对所需抗原具有特异性的t细胞的tcr的鉴定和克隆，并且其中tcr与任何给定个体的hla类型相容。通常，该方法包括：使包含t细胞或由t细胞组成的哺乳动物细胞群体经受多核苷酸提取步骤，从所提取的多核苷酸扩增tcr编码区，修饰扩增的多核苷酸使得它们适合合并至重组载体中，并将编码至少tcrα链和β链编码序列的多核苷酸序列合并至重组表达载体中。因此，该合并序列可以包含vβ序列、dβ序列、jβ序列、恒定区(即，β链恒定区和α链恒定区)、vα和jα区及其它序列的组合。因此，将表达载体配置为表达从一个或多种个体获得的细胞群体所扩增的重组tcr多肽。图11提供了本公开的pcr扩增模板的非限制性说明，其描绘了tcrα链和β链mrna。提供用于本公开的tcr克隆方法的起始材料的细胞类型并不受特别限制，条件是至少一些经受克隆方法的细胞包括编码tcr的细胞。在这方面，本公开包括适合用于包含从任何哺乳动物(包括人类和非人哺乳动物)获得的t细胞的生物样品的快速tcr克隆方法，因此预期适合用于确定天然tcr序列，并产生可用于人类和兽医治疗实施的重组tcr。生物样品可以是预期含有t细胞的任何生物样品，包括但不必限于液体生物样品(如血液淋巴或骨髓)和固体生物样品(如淋巴结、脾脏、肿瘤或胸腺)。在某些实施方式中，该方法是在获自个体的细胞群体上进行的，其中预期该群体包括包含和/或编码tcrα链和tcrβ链的t细胞。该群体还可以包括包含γδt细胞的t细胞，但是采用本公开的方法将检测不到γδtcr。在某些实施方式中，用于本公开的tcr克隆方法的细胞可以包括外周血单核细胞(pbmc)，因此可以包括t细胞、b细胞、天然杀伤细胞、天然杀伤t细胞和单核细胞。t细胞可以是t细胞类型或单细胞的混合物，其包括但不必限于cd4+t细胞和cd8+t细胞。因此，t细胞可以是t辅助细胞(th细胞)、细胞毒性t细胞(tc细胞或ctl)、抑制性t细胞(如cd4+treg细胞)、或幼稚t细胞、干细胞样记忆性t细胞、效应t细胞、记忆t细胞、上皮内t细胞或组织驻留记忆t细胞。在替代性实施方式中，细胞可以是部分或完全纯化的细胞群体或t细胞克隆，其可以使用已建立的技术(如通过细胞分选或通过细胞培养)而获得。关于采用本公开方法所产生的表达载体，其中至少一些将编码包含tcrα链和tcrβ链的功能性tcr，其中在表达之后，两条链彼此以物理缔合的形式存在(例如，以复合物的形式)并且彼此非共价连接，或者其中两条链是不同的多肽但彼此共价连接(如通过二硫键或非肽键的其它共价键)，或者其中通过多肽接头将两条链连接起来(即，单链tcr)。在其它实施方式中，组成tcrα链和tcrβ链的两种多肽都可以被包含在单一多肽(如融合蛋白)中。在某些实施方式中，融合蛋白包含已经从同一开放阅读框(orf)、或不同orf、或包含产生非连续翻译的信号的orf翻译的tcrα链氨基酸序列和tcrβ链氨基酸序列。在一个实施方式中，orf包含位于tcrα链和tcrβ链之间的2a介导的翻译跳跃位点。用于制备含2a的蛋白质的构建体(也被称为2a肽连接的多顺反子载体)在本领域是已知的(参见，例如，genetransfer:deliveryandexpressionofdnaandrna，实验室手册(2007)，friedman等人，国际标准书号(isbn)978-087969765-5)。简而言之，当使2a肽序列包含在编码区之间时，使得能够通过发生在2a肽序列的新切割事件而在单个载体内化学计量地产生离散的蛋白质产物。2a肽序列通常是包含18-22个氨基酸的短序列，并且可以包含不同的氨基末端序列。因此，在一个实施方式中，本公开的融合蛋白包含p2a氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开的融合蛋白可以包含在tcrα链和tcrβ链之间的接头序列。在某些实施方式中，接头序列可以包含3-30个氨基酸(包括两种端点值)。在一些实施方式中，接头序列包含gsg(gly-ser-gly)接头或sgsg(ser-gly-ser-gly)(seqidno：118)接头。在某些实施方式中，通过包含弗林蛋白酶识别位点(如rakr(arg-ala-lys-arg)(seqidno：119)位点)的氨基酸序列将tcrα链和tcrβ链彼此连接。可以采用本公开的快速克隆方法制备的表达载体的非限制性实例示于图12中，其中涉及图1步骤5。在一个实施方式中，使用本公开的快速克隆方法制备的表达构建体编码tcr，并且还可以包括另外的或可替代的多核苷酸。该另外的多核苷酸可以使得它们能够将tcr克隆到表达质粒中，例如限制酶位点或与质粒重叠的序列。该另外的多核苷酸可以使得它们增强tcr表达，例如kozak一致序列。该另外的多核苷酸可以使得它们增强tcr异二聚体复合物形成，例如tcr恒定区中的半胱氨酸修饰。该另外的多核苷酸可以使得它们能够确定表达tcr的细胞，如通过添加由抗体(如，c-myc、v5或聚组氨酸)检测的短标签序列或通过编码可检测标记物(如荧光蛋白或发光蛋白)。该另外的多核苷酸可以使得它们编码允许选择性消除表达tcr的细胞的元件，例如胸苷激酶基因。在一个方面，本公开提供了适用于从单细胞/t细胞克隆快速克隆tcr并且还适用于从寡克隆t细胞快速克隆tcr的方法。如在本文中所使用的，“t细胞的寡克隆群体”是指多种不同t细胞，其中该多种不同t细胞中的每种t细胞具有不同的tcr，并且其中该多种不同t细胞具有共同的抗原性物质(antigenicagent)，其包含至少一种可以被群体中的至少一些t细胞识别的抗原。这类抗原性物质可以包括病原体，包括但不限于病原微生物和病毒，以及哺乳动物蛋白和其它抗原决定簇。例如，癌细胞可以是表达一种或多种癌抗原的抗原性物质，其可以被寡克隆群体中的至少一些t细胞直接识别，或者当被其它细胞(这些其它细胞例如可以是在例如人白细胞抗原(hla)环境下的例如主要组织相容性复合物(mhc)环境中的树突细胞)呈递至t细胞时可以被识别。在一个实施方式中，可以从组织样品获得寡克隆t细胞群体。在一个实施方式中，组织样品包括肿瘤样品(其中t细胞已经浸润至肿瘤中)，因此样品包含肿瘤浸润性t淋巴细胞的寡克隆群体。在一个实施方式中，本公开包括从样品获得总rna。“获得rna”可以表示取得样品或接收含有rna的任何样品。在一些实施方式中，如果需要，可以使用多种已知方法中的任一种从任何样品分离出总rna或mrna。在一些实施方式中，分离mrna不是必需的，因为可以将总rna或含有rna的细胞裂解物用于作为扩增编码tcrrna的mrna的起始材料，如本文进一步描述的。如果样品是肿瘤，则样品可以包括肿瘤的任何部分，包括但不限于单个或汇集的肿瘤活组织检查物、整个肿瘤、原发性肿瘤样品、转移瘤、转移灶等。在某些实施方式中，本公开包括从肿瘤浸润性t细胞确定tcr，其中肿瘤是任何实体瘤，或由例如液体肿瘤形成的实体瘤。在一些实施方式中，癌症包括选自以下的一种癌症类型：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或肝癌、骨髓瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤或黑素瘤。在一些实施方式中，癌症包括表达一种或多种免疫原性肿瘤抗原的癌细胞。一种或多种癌抗原可以包括ny-eso-1、wt1、muc1、lmp2、hpve6和e7、egfrviii、her2/neu、mage-a3、p53、ny-eso-1、psma、gd2、cea、malana/mart1、突变ras、gp100、蛋白酶3、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、mage-a1、mage-a4、mage-c1、mage-c2、plac1、sp17、trp-2、周期素b1、间皮素或叶酸受体α中的任一种。癌症可以表达患者特异性新抗原，即先前未被免疫系统识别的新形成的抗原。可以例如通过采用针对t细胞的抗体来分离肿瘤浸润性t细胞，但是分离肿瘤浸润性t细胞来实施本公开方法不是必要的。癌症可以处于任何阶段。对于获得样品的个体没有特别限制，因此个体可以是人类、非人哺乳动物，并且可以具有任何的年龄、性别或种族。此外，个体可以具有任何hla类型。样品可以具有任何大小，条件是样品含有至少一种t细胞。例如，可以将来自肿瘤组织的单个t细胞或任何大小的肿瘤组织样品用于本公开的实施方式中。在一些实施方式中，可以采用肿瘤活组织检查物。如通过本公开的寡克隆t细胞群体中的特异性α链和β链可变序列的不同组合确定的tcr的多样性可以在例如几种不同的tcr到数十万种不同的tcr的范围内。因此，本公开包括从寡克隆t细胞群体确定至少一种不同的tcr至高达十万种tcr或更多种。在一个方面，本公开包括从个体获得肿瘤样品，从肿瘤分离出t细胞或采用整个肿瘤组织，从t细胞分离出含有编码tcr-α链和β链的mrna的总rna或mrna，从mrna产生单链和/或双链cdna，将cdna克隆到载体中，和测定编码tcr-α链和β链的dna的序列，和/或测定tcr-α链和β链的氨基酸序列。本公开可选地包括重组表达tcr-α和β链，用于例如过继免疫疗法，用于患有表达可由表达重组tcr的淋巴细胞识别的抗原的癌症类型的个体。含有从寡克隆t细胞群体获得的编码tcr的多核苷酸的文库也包括在内。本公开还包括细胞，如包含重组多核苷酸的多种不同细胞和/或细胞类型。细胞可以是分离的细胞、在培养物中生长和/或扩增和/或维持的细胞，和可以是原核细胞或真核细胞或重组病毒。可以将原核细胞和真核细胞培养物及重组病毒用于例如繁殖或扩增本发明的tcr表达载体。在一些实施方式中，测试了经过工程化以表达由本公开方法所确定的tcr的经过修饰的t细胞针对任何特定抗原的特异性。因此，本公开提供了筛选(包括但不必限于高通量方法)合并至如本文描述的表达载体中的多种tcr。筛选可以基于结合mhc/肽复合物的能力，如通过用荧光mhc/肽多聚体染色。筛选可以基于在与mhc/肽复合物结合后产生分子(如细胞因子)的能力。可以在报告细胞系上表达tcr，其中将该报告细胞系工程化以表达荧光分子或发光分子或在与mhc/肽复合物结合后经抗体检测到的分子。用于本公开的实施方式的表达载体可以是任何合适的表达载体。在一些实施方式中，表达载体包含经过修饰的病毒多核苷酸，如来自逆转录病毒或如慢病毒载体。在一种方法中，本公开包括如图1和图13所示的步骤，即：1)从t细胞群体获得编码tcrα链和β链可变序列的mrna，t细胞群体可以例如来自例如肿瘤样品的寡克隆t细胞群体；和从mrna产生单链cdna，包括编码tcrα链的单链cdna和编码tcrβ链的单链cdna，其中采用任何合适的逆转录酶和例如寡聚-dt引物或任何其它合适的引物来产生单链cdna；2)将1)中的cdna制备物分成两步单独的反应(如图13所示)；并进行第二链cdna合成，以采用引物httcr#c-1至httcr#c-45(如表1所示，可以混合使用或单独使用)在一个单循环dna聚合酶反应(第一反应)中产生编码tcrβ链的双链cdna片段，和采用引物httcr#f-1至httcr#f-49(如表1所示，可以混合使用或单独使用)在第二个单循环dna聚合酶反应(第二反应)中产生编码tcrα链的双链cdna片段；3)使步骤2)中的反应物经受核酸外切酶i(如dna核酸外切酶i)以降解未使用的引物和单链cdna(例如，所有编码非tcr的cdna)，然后将核酸酶活性加热灭活；4)将3)中的包含双链cdna片段的反应物进行，i)采用httcr#aacttaagcttggtaccgagctcggatctgcggccgccaccatg(seqidno：1)和引物httcr#bctcaaacacagcgacctcgggtgggaacac(seqidno：2)对包含tcrβ链序列的双链cdna进行pcr以获得编码tcrβ链的扩增子，和ii)采用httcr#d-ggagacgtggaagaaaaccccggtcccatg(seqidno：48)和ht-tcr#eaggcagacagacttgtcactggatttagag(seqidno：49)对包含tcrα链序列的双链cdna进行pcr。在不希望受任何具体理论约束下，认为通过标签特异性引物和通用恒定区特异性引物进行扩增将从寡克隆t细胞群体或多克隆t细胞群体扩增多种tcr种类的偏差最小化；5)将4)中的tcrβ链扩增子和tcrα链扩增子组装成载体，以提供包含编码tcrβ链的区段和编码tcrα链的区段的载体，该编码tcrβ链的区段和编码tcrα链的区段通过dna接头片段(如2a-翻译跳跃位点片段)连接，其中通过例如以下方式进行组装：i)将扩增子与一种或两种dna片段(如与常见或不变的tcrcβ-2a片段或者tcrcβ-2a片段和tcrcα片段)混合，如图1步骤5和图18所示，和采用例如不依赖于连接的克隆、gibson组装克隆或类似技术来组装载体。可替换地，可以通过采用例如图16a所示的httcr#aβ链标签特异性正向引物和httcr#e反向引物由重叠pcr将该片段组装成包含分别编码tcrvβ、cβ、2a、vα序列的各区段的单个片段。在一些实施方式中，本公开包括采用表1中引物的子集，并且在某些实施方式中，包括采用#c引物的子集，并且采用#f引物的子集。例如，可以选择引物的子集，其中将特异性vβ亚型用于肿瘤抗原特异性t细胞。在一个实施方式中，这可以通过例如采用vβ或vα亚型特异性抗体由流式细胞术来确定。在一些实施方式中，本公开包括引物混合物的子库，例如，取代将所有#c引物混合和将所有#f引物混合，可以采用5种子库(约10种引物/每种子库)，即将引物子库a、b、c、d、e用于α和将引物子库f、g、h、i、j用于β。在本公开的一些实施方式中，可以采用通用tcrcβ-2a片段，并且可以通过例如从含有cβ-2a片段的模板质粒采用引物httcr#g和httcr#h进行pcr来制备。图16c示出了从模板质粒通过pcr扩增制备tcrcβ-2a融合片段。如果将扩增子与两种dna片段混合，则可以将扩增子与例如图18所示的cβ-2a片段和cα片段混合，并通过例如不依赖于连接的克隆组装成连续性片段。本领域技术人员将认识到，前述步骤均可在t细胞为多克隆t细胞或寡克隆t细胞以及单一t细胞和t细胞克隆的情况下进行，但优选用于单一t细胞和t细胞克隆(即，在不用考虑多重vα或vβ特异性引物引起的pcr偏差下，每个反应只存在一种tcr种类)以省略步骤3(将反应物经受核酸酶处理)并且将步骤2和步骤4结合(即，不需要核酸酶或将未采用的引物加热灭活)，并且可以同时进行第二链cdna合成以产生编码tcrβ链的cdna扩增子和编码tcrα链的cdna扩增子(在各自反应中)。例如，可以通过采用所有的httcr#aβ链-标签特异性正向引物、httcr#bcβ特异性反向引物和所有的httcr#c引物来将步骤2和步骤4组合以用于扩增β链。同样，对于α链扩增，可以采用所有的httcr#d引物和httrc#ecα特异性反向引物及所有的httcr#f引物。附图中描述的所有引物浓度都包括在本公开中。采用不同的引物组合、聚合酶和纯化方法，以多种配置和条件测试了目前方法的各个方面，产生了超过10次失败尝试而获得合适的结果。如上所述，在某些实施方式中，本公开包括采用两种不同的目的载体，其中一种适合用于不依赖于连接的克隆，另一种适合用于限制酶-连接酶克隆。修饰包含在这些载体中的cα区以引入限制酶位点，但克隆后的序列编码天然cα序列，因此在某些实施方式中，克隆方法相对于cα序列是无痕的(scar-free)。更详细地，表达载体可以含有cα片段。为了提供可以在cα片段处切割载体的序列，在cα区中引入人工限制酶位点。在该实例中，引入了被pspomi(或bsp120i)酶识别的gggccc序列。设计了含有gggccc序列的正向引物(pspomi-cα-f)和反向引物(pspomi-cα-r)。将未修饰的tcr表达盒作为模板，采用httcr#a和pspomi-cα-r及httcr#j和pspomi-cα-f进行两种pcr反应。采用httcr#a和httcr#j由重叠pcr连接所得的扩增子，并将其克隆到表达载体中。其它的引物序列包括：pspomi-cα-f：accagctggggccctctaaatccagtgacaagtctgtctgcc(seqidno：99)pspomi-cα-r：gagggccccagctggtacacggcaggg(seqidno：101)使用不依赖于连接的克隆方法(如gibson组装和nebuilderhifidna组装)将tcrvαpcr片段连接到pspomi处理的表达载体中，这两种方法均可作为试剂盒获得自newenglandbiolabs。这些方法利用5'核酸外切酶在两种片段之间产生互补性末端。5'核酸外切酶破坏pspomi产生的5'突出端。结果是，连接产物成为天然cα序列。类似的不依赖于连接的克隆方法可以采用3'核酸外切酶，如可获得自clontech的infusion克隆。在这种情况下，可以采用识别相同gggccc序列但产生3'突出端的apai。在另一种方法中，本公开提供了采用限制酶来克隆组装片段的载体和相关方法。特别地，可以通过采用dna连接酶，随后采用限制酶将组装的tcrvβ-cβ-vα片段克隆到含有tcrcα片段的表达质粒载体中。为了提供可以在cα片段处切割载体的序列，将人工限制酶位点引入至cα区中。在该实例中，引入了由nrui(或rrui)酶识别的tcgcga序列。设计了含有tcgcga序列的正向引物(nrui-cα-f)和反向引物(nrui-cα-r)。将未修饰的tcr-表达盒作为模板，采用httcr#a和nrui-cα-r及httcr#j和nrui-cα-f进行两种pcr反应。采用httcr#a和httcr#j由重叠pcr将得到的扩增子连接起来，并克隆到表达载体中。其它的引物序列包括：nrui-cα-f：ttcaccgatcgcgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaagg(seqidno：102)nrui-cα-r：gagaatcgcgatcggtgaataggcagacagactt(seqidno：103)。16b提供了一个实例，其示出了在cα区处引入nrui限制酶位点。为了在tcrvα片段的3'末端产生限制酶位点以与质粒的nrui处理的平末端连接，用含有被swai(或smii)识别的atttaaat序列的httcr#e-swai引物取代httcr#e。nnn代表任何3个核苷酸序列，用于提高限制酶反应的效率。其它的引物序列包括：httcr#e-swai：nnnatttaaatcggtgaataggcagacagacttgt(seqidno：104)。在一个实施方式中，用noti和swai限制酶处理组装的tcrvβ-cβ-2a-vα片段(例如，由如图16所示的3片段重叠pcr产生的片段)。noti-识别性序列(gcggccgc)和swai-识别性序列(atttaaat)不存在于任何先前已知的tcrvα、jα、cα、vβ、dβ、jβ或cβ片段和2a序列中。此外，在tcr重组过程中通过随机核苷酸插入和缺失产生这8种核苷酸序列的可能性极低。因此，预计用noti和swai处理不会从内部切割组装tcr产物。用noti和nrui限制酶处理nrui修饰的质粒载体。通过采用dna连接酶将组装tcr片段与质粒载体连接起来。在质粒中将swai处理的tcr片段和nrui处理的cα片段连接起来产生编码天然cα氨基酸序列的核苷酸序列。如上所述，一般而言，本发明的方法包括从t细胞提取的多核苷酸扩增tcr编码区，修饰经过扩增的多核苷酸以使其适合于合并至重组载体中，和将编码至少tcrα链和β链编码序列的多核苷酸序列合并至重组表达载体。这是通过使用以上描述的按照顺序的系列步骤来进行的。通常以克隆方案采用本公开的引物，图1和13提供了其非限制性的表示。对于表1的引物，本公开的每种引物序列可以不包含序列aaggatccgaattcctgcagg(seqidno：105)，并且可以不包含序列tggaggagaaccctggacct(seqidno：106)，并且可以排除这些序列位于引物序列的5'末端、3'末端或任何其它位置的情况。本公开的引物(如表1的tcr可变β引物)可以各自包含序列cggccgccacc(seqidno：107)，其可以位于5'末端，用作pcr中的标签。该序列可以包括位于3'末端的tcrβ链的起始密码子atg。本公开的引物(如表1中的tcr可变α引物)可以各自包含可以位于5'末端的序列aaccccggtccc(seqidno：108)。可以采用逆转录酶和寡聚dt引物从t细胞的总rna或mrna合成互补性dna(cdna)。可以将其它引物(如随机六聚体和tcr基因特异性引物)用于引发逆转录。在该实例中，采用表1所述的引物组合来合成第二链cdna。特别地，将含有atg起始密码子的45种正向引物的组合设计为扩增具有已知vβ区段的任何tcr，并将含有atg起始密码子的49种正向引物的组合设计为扩增具有已知vα区段的任何tcr。将tcrvβ特异性引物(表1中以引物名称“httcr#c”开头的那些)在起始密码子之前侧接有不完整的noti限制性位点和kozak一致序列(cggccgccacc(atg))(seqidno：109)。将tcrvα特异性httcr#f引物(表1中以引物名称“httcr#f”开头的那些)在起始密码子之前侧接有一部分2a序列(aaccccggtccc(atg))(seqidno：110)。这些侧接序列用作pcr扩增过程中的标签，图1步骤4提供了其非限制性举例说明。如图13步骤4所示，采用通用引物对(例如，将httcr#a和httcr#b用于vβ，和将httcr#d和httcr#e用于vα)由pcr扩增tcrα链和β链的可变区。在将通用引物对应用于寡克隆t细胞群体时，在pcr中采用通用引物对允许无偏扩增tcr基因。图2a和图14示出了通过图1和图13描述的方法从t细胞克隆进行tcrvα和vβpcr扩增的一种非限制性实例。然而，为了从t细胞克隆扩增tcr，可以将图1(和图13)的步骤2和步骤4中的第二链cdna合成和pcr反应结合，同时可以省略步骤3。用于t细胞克隆或单个t细胞的这种替代性方法如图15所示。如果样品包含t细胞克隆或单个t细胞，则该方法是优选的，其中通过多重引物产生的不同扩增效率不成问题，但不适用于寡克隆t细胞样品。通过琼脂糖凝胶电泳和/或采用市售试剂(如来自zymoresearch的zymocleantm凝胶dna回收试剂盒)纯化扩增出的tcrα链和β链可变片段。图13步骤5所示的下一步骤包括用恒定片段组装并克隆到质粒中。特别地，由含有图12所示的融合基因的储存模板(stockedtemplate)扩增tcrβ链恒定区+2a序列融合片段。该片段分别与在cβ位点和2a位点处的β链和α链可变区片段重叠。该恒定区片段可以含有人工半胱氨酸修饰，其通过形成二硫键增强与半胱氨酸修饰的tcrα链的配对，但本领域技术人员将认识到，鉴于本公开的益处，各种实施方式允许恒定区是未修饰的片段，或者其可以包含任何其它修饰，其中一些修饰如上所述。修饰可以是以下一种或多种：(1)由来自其它物种的tcr恒定区取代，如来自鼠源tcr的那些，(2)添加亮氨酸拉链基序，(3)添加t细胞活化结构域，如来自cd3、cd28、4-1bb、ox-40、gitr、icos的细胞内结构域。可替换地，可以通过重叠pcr融合三个片段。图16a示出了一个实例。在该实例中，将三个片段混合，并且采用httcr#a和httcr#e引物由pcr进行扩增。可以通过不依赖于连接的克隆或相关方法或通过采用dna连接酶将融合片段克隆到表达载体中。图17示出了通过重叠pcr组装三个片段的实例。质粒载体(其中克隆了组装的tcrα和β可变区和cβ区)含有由半胱氨酸修饰的tcrα链的恒定区，在这个实例中其增强了与半胱氨酸修饰的tcrβ链的配对。tcrα链恒定区的修饰可以是以下一种或多种：(1)由来自其它物种的tcr恒定区取代，如来自鼠源tcr的那些，(2)添加亮氨酸拉链基序，(3)添加t细胞活化结构域，如来自cd3、cd28、4-1bb、ox-40、gitr、icos的细胞内结构域。该tcrcα与α链可变片段重叠。克隆载体含有与β链可变片段重叠的标签序列。将连接产物用于转化感受态细胞(如stb13或nebstable)，并铺在含有抗生素的琼脂平板上。作为三片段克隆方案的可替代方案(例如，参见图16)，也可以使用四片段方法，在图18和图19中进行了总结，但是通常已知通过不依赖于连接的克隆组装4个片段的效率低于组装3个片段的效率。将组装的pcr产物克隆到质粒中，例如通过dna连接酶采用noti和paci限制酶位点，或通过使用不依赖于连接的克隆方法(如gibson组装克隆)。鉴于前述内容，对于本领域技术人员显而易见的是，本公开提供了能够在一天内进行的高通量tcr克隆方案，如图20中描绘的非限制性流程图所示。表1提供了可用于本公开实施方式的引物序列和引物的名称。因此，本公开包括包含适用于本文描述的快速tcr克隆方法的这些引物的组合的试剂盒。试剂盒可以包含一种或多种引物，如以任何组合形式的引物的混合物，并且可以在一个或多个单独的容器中提供这类混合物。在某些实施方式中，试剂盒中的引物组合可以包含含有atg起始密码子的45种和49种引物组合或由含有atg起始密码子的45种和49种引物组合组成，分别用于扩增含有已知vβ和vα等位基因的任何tcr。这些包括以表1中的引物名称“httcr#c”开头的tcrvβ特异性引物和以表1中的“httcr#f”开头的tcrvα特异性引物。该试剂盒可以包含用于扩增tcr的试剂和用于将tcr克隆到表达载体中的试剂。试剂盒可以包括指导使用者如何从表达tcr的细胞的样品克隆tcr的印刷材料。除了表1中提供的序列之外，本公开还包括以下序列：nxgcggccgccaccatg(nx表示0-50)(seqidno：111)，其可以用作例如ht-tcr#a的替代物。该序列中的“nx”表示任何可以被包含在引物中的长达50nt的核苷酸序列，这取决于克隆方法，以便促进限制酶的使用和/或不依赖于连接的克隆(包括但不必限于gibson组装、infusion克隆、nebuilder克隆等)。以下实施例旨在说明而非限制本发明。实施例1tcr基因的扩增和克隆图1a示出了如上所述的设计用于构建逆转录病毒载体的示意性tcr表达盒。为了能够从单个转录物化学计量地表达tcrα链和β链，经由p2a翻译跳跃位点将tcrα链和β链遗传连接(j.matsuzaki,等人，sci.rep.5,14896(2015)；n.banu,等人，sci.rep.4,4166(2014))。在tcrβ链的起始密码子前面连接kozak一致序列(gccacc)以便有效地翻译。通过半胱氨酸残基修饰这两条链的恒定区以产生人工二硫键，其增强转基因tcrα链和β链的配对并抑制与内源性tcr的配对(c.j.cohen,y.等人，cancerres.67,3898-3903(2007))。在tcr表达盒中，需要从抗原特异性t细胞获得的对抗原识别至关重要的tcrα链和β链可变区(vα/vβ)、连接区(jα/jβ)和tcrβ链多样区(dβ)。相比之下，可以将恒定区制备成含有人工修饰(如半胱氨酸修饰和与p2a位点融合)的储存片段(图16c举例说明了制备这种恒定区的合适方法)。另外，可以使tcrα链恒定区包括在目的质粒载体中以减少待组装的片段的数量。如图6a所示，构建了目的逆转录病毒表达质粒。目的质粒含有作为填充片段的tcr表达盒，其中将tcrcα区修饰为含有pspomi识别位点(gggccc)，用于与noti限制酶一起切除填充片段。在组装反应期间，将该人工序列校正为天然cα序列(图6b)。tcrα链和β链的5'部分(vα和vβ)是高度可变的。因此，在不了解tcr序列的情况下，pcr扩增需要大量多重正向引物。针对imgt数据库中报道的所有已知的vα和vβ，设计了两组多重正向引物(m.p.lefranc,等人，nucleicacidsres.43,d413-422(2015))。表1列出了用于本研究的引物序列。tcrvβ特异性引物组由45种在起始密码子之前具有常见5'标签序列的引物组。类似地，49种vα特异性引物具有另一种常见的标签序列(p2a位点的3'区域)。图1b示出了扩增和克隆tcr基因的步骤。在该研究的所有实验中，我们采用了由寡聚dt引物和逆转录酶从总rna制备的标准cdna作为pcr模板(步骤1)。由于多重引物进行的pcr扩增可以引起扩增偏差(由于每种引物的效率不同)，因此采用标签特异性正向引物和tcr恒定区(cα和cβ)特异性反向引物扩增vα和vβ区。为此，通过由多重引物引发的单循环聚合酶反应来合成第二链tcrcdna，从而将标签序列添加至第二链-cdna的5'末端(步骤2)，然后通过核酸外切酶i处理以消除过量引物(步骤3)。然后，采用标签特异性正向引物和tcr常见区(cβ或cα)特异性反向引物对由pcr扩增vα和vβ片段(步骤4)。vβ的标签序列与目的质粒载体中的克隆位点具有30个核苷酸的重叠，而vα的标签序列与p2a序列具有重叠。对与p2a序列连接的tcrβ链的半胱氨酸修饰的恒定区进行从含有该片段的目的质粒的pcr扩增。用含有半胱氨酸修饰的cα片段(采用nebuilderhifidna组装主混合物由改良的gibson组装得到)的线性化目的逆转录病毒质粒载体组装三个片段(vdjβ、cβ-p2a和vjα)(步骤5)。采用冷冻储存的cβ-p2a和线性化的目的载体片段，在4小时内制备了用于转化大肠杆菌感受态细胞的组装载体。实施例2从肿瘤抗原特异性t细胞克隆构建表达tcr的逆转录病毒载体为了验证快速tcr克隆方法，我们构建了表达tcr的逆转录病毒载体，用于具有来自我们细胞库的tcrα链和β链基因的独特组合的四种cd8+特异性t细胞克隆和五种cd4+ny-eso-1特异性t细胞克隆。作为t细胞克隆对照，包括jurkatt淋巴瘤细胞系(atcc；tib-152)。对于测试的所有t细胞克隆，vβ和vα片段被扩增为单一条带(图2a)。将组装的表达tcr的载体用于以化学的方式转化感受态大肠杆菌。将转化的细胞铺展并在琼脂平板上孵育过夜以产生汇合的菌落。为了证实tcr表达盒被正确组装，用切除全长tcr表达盒的noti和paci限制酶消化从合并的菌落中获得的大量质粒(图1a)。如图2b所示，从质粒切下具有预期大小的单一条带tcr表达盒(约1.8kb)，表明我们的克隆方法正确地组装了作为表达盒的片段。为了测试所克隆的tcr的功能性，将健康供体t细胞多克隆激活，并且用由含有源自t细胞克隆的tcr表达盒的大量质粒所产生的逆转录病毒感染。在单次感染后，25-35％的t细胞表达经过转导的tcr，如通过tcrvβ亚型表达增加所确定的，其中可获得合适的抗体(图2c)。通过mhc/肽四聚体染色测定抗原特异性tcrα链和β链对的功能性表达。未转导的t细胞和与tcr基因转导无关的t细胞的染色可忽略不计。由相应四聚体对在cd8+t细胞上表达的所有4种hlai类限制性tcr染色(图2d和图7)。在用抗原和表达hla的癌细胞系共培养后，经tcr转导的t细胞产生ifn-γ和tnf-α(图2e)。为了评估hlaii类限制性ny-eso-1特异性tcr的功能性表达(其中mhc/肽-四聚体试剂不可获得)，将tcr基因转导的t细胞与抗原脉冲的靶细胞或mhcii类和ny-eso-1共表达的癌细胞共培养，然后进行细胞内细胞因子染色。如图8所示，hlaii类限制性tcr基因转导的t细胞在抗原刺激后产生ifn-γ和tnf-α。这些结果证明了，对于测试的所有t细胞克隆，我们的克隆方案快速构建了功能性tcr表达载体，而不需要tcr序列信息。实施例3从多克隆t细胞构建和表征随机配对的tcr文库接下来，我们应用我们的tcr克隆方案从多克隆t细胞群体构建随机配对的tcr表达文库。我们首先测试了从3个健康供体的外周血单核细胞(pbmc)的多克隆t细胞构建tcr表达文库的可行性。从pbmccdna有效扩增了tcrvα和vβ两者(图3a)。在感受态细胞中扩增了组装的质粒，并从合并的菌落进行纯化。通过连续稀释转化的细胞，确定来自一个含有感受态细胞的50μl小瓶的文库大小为2.8±0.5×105(3个供体的平均值±sd)。为了研究采用针对标签特异性正向引物和常见tcr恒定区特异性反向引物的常见引物组进行的tcr基因扩增是否能够对不同tcr种类进行无偏扩增，我们采用vβ亚型特异性抗体通过流式细胞术比较了pbmc中cd3+t细胞和质粒文库中的tcrvβ亚型的使用。通过将逆转录病毒颗粒感染到tcrβ链突变的j.rt3-t3.5(j.rt3)jurkatt-淋巴瘤亚系(atcc：tib-153)中来研究表达tcr的逆转录病毒文库中的tcrvβ的使用。用逆转录病毒文库以转导少于30％细胞的次优病毒滴度转导j.rt3，以使多拷贝转导最小化。采用24种针对vβ亚型的不同抗体由流式细胞术测试了细胞表面tcrvβ的表达。图3b示出了对于来自不同供体的3种独立文库的pbmc中cd3+t细胞和转导文库的j.rt3的每种vβ亚型的频率之间的关系。总体而言，文库保留了在cd3+t细胞中使用vβ。图3c比较了vβ使用的平均百分数，用配对t检验统计分析结果。尽管pbmc和tcr文库之间的vβ使用存在一些显著差异(如文库中vβ5.1的过量表达和几种微小差异)，但是外周t细胞中的vβ使用在文库中良好再现。这些结果支持多克隆t细胞群体中的大多数tcr基因种类进行pcr扩增和组装，而没有显著偏差。实施例4从源自肿瘤的tcr表达文库确定肿瘤抗原特异性tcr对接下来，我们测试了在不分离肿瘤抗原特异性t细胞下本公开方案是否可以从多克隆t细胞群体中确定肿瘤抗原特异性tcr基因。已知肿瘤抗原特异性t细胞高度富集免疫原性肿瘤(j.matsuzaki,等人，proc.natl.acad.sci.usa107,7875-7880(2010))。因此，我们分析了来自肿瘤样本的随机组装的tcr文库是否可以是确定肿瘤抗原特异性tcr基因的有价值的来源(图4a)。采用上述的tcr扩增和组装方案，我们从3个冷冻肿瘤样本构建了tcr基因文库，已知该肿瘤样本浸润有高频率的hla-cw*03限制的ny-eso-1特异性cd8+t细胞。从冷冻卵巢肿瘤样本的cdna扩增tcr可变片段，并组装成逆转录病毒质粒载体。然后，采用大量质粒文库产生逆转录病毒颗粒。用源自肿瘤的tcr表达文库以次优病毒滴度感染多克隆激活的t细胞一次，以将多拷贝转导最小化。如图4b所示，与未转导的t细胞相比，在3种测试文库的2种文库(#2和#3)中观察到cw*03/ny-eso-1四聚体反应性cd8+t细胞和cd4+t细胞(其为cd8-细胞)显著增加，尽管由于随机配对这3种文库在较低频率下进行测试。为了分离ny-eso-1特异性tcrα链和β链基因，通过流式细胞术分选四聚体染色的t细胞，并且提取通过逆转录病毒tcr转基因整合的基因组dna。通过巢式pcr从基因组dna扩增tcr转基因，并且将其重新组装成表达tcr的质粒。将该二代tcr文库用于制备逆转录病毒载体以转导原代t细胞。大量二代tcr文库转导的t细胞对同源抗原具有反应性，如通过特异性四聚体染色(图5a)和针对特异性肽脉冲的靶细胞的细胞因子释放所证明的(图5b)。这些结果表明，即使原代文库中正确配对的tcr频率较低，但是可以通过分离具有所需功能的经tcr转导的细胞(如四聚体结合)和通过巢式pcr有效pcr扩增整合的tcr转基因来有效地确定肿瘤抗原特异性tcr基因。通过用限制酶消化由tcr转基因dna指纹图谱来表征二代文库中的tcr克隆。如图9所示，通过单个克隆(7/14克隆)显著富集肿瘤#2的二代tcr文库，而肿瘤#3富集有2种克隆(克隆型3a:7/14和克隆型3b:4/14)。用肿瘤#2中的富集tcr克隆和肿瘤#3中的克隆型3a(而非3b)转导会诱导四聚体+t细胞(图10)。我们接下来研究了新确定的tcr是否最终是功能性的并且能够排斥肿瘤。我们利用体内肿瘤异种移植模型来研究二代tcr文库转导的t细胞的治疗性效果。与最近的报道一致，ny-eso-1(92-100)表位由免疫蛋白酶体产生(k.woods,等人，j.immunother.cancer4,10(2016))，并且通过ifn-γ处理癌细胞显著增强了工程化的t细胞在体外识别a2780卵巢癌细胞系(其被工程化以表达cw*03和ny-eso-1)(图5c)。对nod/scid/共同γ链缺陷(nsg)小鼠皮下接种hla-cw*03+ny-eso-1+a2780。在建立可触知的肿瘤的第3天，对小鼠静脉内输注4×106个tcr基因转导的t细胞或未转导tcr基因的t细胞。未转导的t细胞没有显示出抗肿瘤作用，但是tcr基因转导的t细胞产物完全消除了所有动物中已建立的肿瘤(图5d)。实施例5材料和方法样本在rpci手术中获得卵巢肿瘤样本。将部分样本冷冻在液氮中，并储存在-80℃。用剪刀和温和macs离解器(miltenyi)切碎剩余样本，并且用密度梯度法分离单核细胞。在液氮罐中，将肿瘤单细胞混悬液储存于90％胎牛血清(fbs)和10％二甲基亚砜(dmso)中。如前所述产生ny-eso-1特异性t细胞(j.matsuzaki,等人，proc.natl.acad.sci.usa107,7875-7880(2010))。简而言之，在体外用ny-eso-1刺激来自卵巢癌患者的外周或肿瘤浸润性t细胞，并且在10u/ml重组人类(rh)il-2(罗氏诊断公司)和10-20ng/mlrhil-7(r&d系统)存在下进行培养，其中通过存在血清抗ny-eso-1自身抗体证明该卵巢癌患者具有针对ny-eso-1的自发免疫力。通过利用ny-eso-1特异性四聚体试剂或ifn-γ分泌测定试剂(miltenyi)染色来确定肽反应性t细胞，并采用facsariaii仪器通过细胞分选进行分离。通过在rhil-2和rhil-7存在下用植物凝集素(pha；remel)和经辐射的同种异体pbmc刺激来进一步扩增细胞。采用tri试剂随后进行苯酚/氯仿提取或采用直接-zolrna微型试剂盒(zymoresearch)从ny-eso-1特异性t细胞获得总rna。采用组织匀浆器以tri试剂从肿瘤样本(重量为70-100mg)获得总rna，随后利用直接-zolrna微型试剂盒进行柱纯化。采用寡聚-dt引物(赛默飞世尔)和逆转录第一链cdna合成试剂盒进行逆转录。tcr可变区的pcr扩增和纯化表1列出了引物序列。为了通过标签特异性引物提供用于pcr扩增的标签序列，在含有1×phusion聚合酶反应主混合物(赛默飞世尔)的单个管中，将cdna与针对tcrα链的httcr#f混合，或与针对tcrβ链httcr#c混合。98℃持续40秒的单次循环，快速冷却至72℃，然后缓慢(-0.1℃/秒)冷却至66℃，66℃持续30秒，并且72℃持续5分钟，以进行第二链dna的合成。通过添加核酸外切酶i并在37℃下孵育15分钟，随后在85℃下灭活15分钟来破坏未使用的多重引物和所有单链cdna。在1×phusion聚合酶反应主混合物中，将每个反应添加有标签特异性正向引物和tcr恒定区特异性反向引物对，即针对tcrα链的httcr#d和httcr#e，和针对tcrβ链的httcr#a和httcr#b。pcr如下进行：98℃持续30秒，1个循环；98℃持续10秒、62℃持续30秒和72℃持续30秒，2个循环；98℃持续10秒和72℃持续60秒，30个循环；和72℃持续2分钟，1个循环。将反应物加载到含有sybrsafedna凝胶染料(赛默飞世尔科技)的1％琼脂糖凝胶上，并在90v下电泳30分钟。在透照仪(英杰)下切下tcr可变片段的主要条带(约450bp)，并采用zymoclean凝胶dna回收试剂盒(zymoresearch)提取dna片段。通过在260nm处的吸光度测量dna浓度。为了从tcr基因转导的t细胞扩增整合的tcr转基因，在1×phusion聚合酶反应混合物中将来自tcr转导的t细胞的基因组dna与扩增整个tcr表达盒的载体特异性引物对(正向：cgaattcccaaacttaagcttggtaccg(seqidno：114)；和反向：gcagcgtatccacatagcgtaaaagg(seqidno：115)混合。pcr如下进行：98℃持续30秒，1个循环；98℃持续10秒、71℃持续30秒和72℃持续40秒，35个循环；和72℃持续2分钟，1个循环。随后，在1×phusion聚合酶反应混合物中，将1μl反应物与vβ标签特异性正向引物(httcr#a)和cα特异性反向引物(httcr#e)混合，并且进行如下循环：98℃持续30秒，1个循环；98℃持续10秒和72℃持续70秒，35个循环；和72℃持续2分钟，1个循环。如上所述，分离并定量扩增的dna片段。将tcr表达盒组装至质粒载体通过pcr从含有编码半胱氨酸修饰的tcrcβ-p2a融合蛋白的dna片段的质粒扩增该片段，并进行凝胶纯化。图6提供了目的质粒载体的描述。基本上，目的质粒基于含有剪接受体位点修饰(在tcr克隆位点之前对来自人延伸因子1α启动子的剪接受体位点进行修饰)且含有半胱氨酸修饰的cα片段的mscv逆转录病毒载体。在10μl1×nebuilderhifidna组装主混合物中(newenglandbiolabs)，将用noti和pspomi处理并凝胶纯化的线性化目的质粒(50ng)与等摩尔量的vβ、cβ-p2a(采用httcr#f和httcr#g引物通过pcr从目的质粒获得)vα片段混合，并在50℃下孵育60分钟。为了克隆从经过转导的t细胞的基因组dna扩增的tcr表达盒，将线性化质粒和tcr表达盒插入物以1:2的摩尔比在10μl1×nebuilderhifidna组装主混合物中混合，并在50℃下孵育60分钟。在用dnaclean&concentrator试剂盒(zymoresearch)纯化后，将组装的产物用于以化学的方式转化感受态大肠杆菌nebstable。将转化后的大肠杆菌涂布在3个10cm琼脂平板上，并在37℃下孵育14-16小时。将三个平板中的汇合大肠杆菌菌落合并，并且通过zymopure中量质粒制备试剂盒(zymoresearch)纯化质粒。通过用noti和paci进行限制酶处理(其从质粒主链上切下tcr表达盒)来检查大量质粒制备物的质量，然后在琼脂糖凝胶中进行电泳。在一些实验中，将从合并的大肠杆菌菌落获得的质粒用于再转化感受态细胞以获得单菌落。采用onetaq(newenglandbiolabs)和引物对httcr#a和httcr#e通过直接菌落pcr测试部分菌落的tcr转基因的dna指纹图谱，并且用alui或mspi限制酶(赛默科技)处理反应物。逆转录病毒转导通过lipofectamine2000(英杰-赛默科技)将编码tcr的转移质粒和pvsv-g包膜质粒共转染到gp2-293包装细胞系(clontech)中以产生逆转录病毒颗粒。将包装细胞与质粒共孵育7小时，更换培养基。36小时后，收获上清液，以400×g离心5分钟，持续5分钟，并立即用于转导t细胞。使用密度梯度法以淋巴细胞分离培养基从健康供体的血沉棕黄层获得pbmc，并在液氮罐中将其储存于90％fbs+10％dmso中。在10u/mlrhil-2、10ng/mlrhil-7和20ng/mlrhil-12p70(peprotech)存在下，在补充有10％fbs、青霉素、链霉素和l-谷氨酰胺的rpmi1640培养基中，通过10μg/mlpha预活化pbmc，持续40小时。收获预活化的pbmc(1×105)、计数并涂布于在rhil-2、rhil-7和rhil-12存在下用10μg/mlretronecting和5μg/ml抗人cd3单克隆抗体(mab)(okt3；ebioscience)预涂覆过夜的96孔平底板上。通常，加入125μl逆转录病毒上清液以转导t细胞，并培养24小时。在存在rhil-2和rhil-7及不存在rhil-12下使细胞增殖，并用于在转导后7天内进行评估。类似地，进行jurkat(e6-1；atcc)或j.rt3-t3.5(atcc)转导，但不使用活化试剂和细胞因子，并采用体积减少的逆转录病毒上清液。抗原特异性t细胞的检测和分离通过特异性mhc/肽四聚体试剂(路德维希癌症研究中心，洛桑大学)检测ny-eso-1特异性t细胞。用含有1％fbs的pbs洗涤tcr基因转导的t细胞，并且在6μg/ml藻红蛋白(pe)缀合的四聚体的存在下在1％fbs-pbs中于37℃下孵育15分钟。然后用别藻蓝蛋白(apc)缀合的抗cd4mab和percp/cy5.5缀合的抗cd8mab(biolegend)在4℃下将细胞染色15分钟。通过facscalibur仪器获取荧光信号，并通过flowjo软件进行分析。在一些实验中，采用facsaria仪器对四聚体+t细胞进行分选。采用quick-gdna微型试剂盒(zymoresearch)获得分选细胞的基因组dna。通过细胞内细胞因子染色来测试tcr基因转导的t细胞的细胞因子产生。靶细胞是表达ny-eso-1的黑素瘤细胞系(用ny-eso-1和ciita基因利用逆转录病毒转导的hla-a*02+drb1*01+dpb1*04+sk-mel-37；hla-b*35+sk-mel-52；hla-drb1*04+dp*04+colo316)或ny-eso-1-阴性的hla-cw*03+mz-mel-12。为了测试cw*03限制性ny-eso-1特异性反应活性，通过sleepingbeauty转座子系统将cw*03阴性和ny-eso-1阴性的a2780卵巢癌细胞系工程化。通过将人延伸因子1α启动子及随后cw*03-p2a-egfp(a206k)-t2a-ny-eso-1表达盒插入至pt2/bh(addgene质粒#26556)来构建cw*03和ny-eso-1共表达的转座子质粒。采用4d-核转染系统(lonza)以pcmv(cat)t7-sb100(addgene质粒#34879)和pt2-ef-cw3-gfp-eso对a2780进行核转染。通过受限的稀释来获得gfp+克隆。为了在cw*03+ny-eso-1+a2780中诱导免疫蛋白酶体表达，用1,000u/mlrhifn-γ(peprotech)将细胞预处理2天。在与t细胞共培养之前，用10μg/ml合成的ny-eso-1肽(genscript)或10μg/ml重组ny-eso-1蛋白(路德维希癌症研究中心)对靶细胞脉冲或非脉冲过夜，并用rpmi1640培养基充分洗涤。在golgistop(bdbiosciences)存在下，将t细胞与靶细胞共培养6小时。用异硫氰酸荧光素(fitc)缀合的抗cd4和percp/cy5.5缀合的抗cd8mab对细胞染色，采用bdcytofix/cytopermplusfixation/permeabilization试剂盒(bdbiosciences)透化，并用pe缀合的抗tnf-α和apc-缀合的抗ifn-γmab(biolegend)染色。通过facscalibur仪器和flowjo软件分析细胞。肿瘤异种移植模型在rpci的实验动物资源繁殖nsg小鼠(jackson实验室)。用1×106ifn-γ处理的cw3+ny-eso-1+a2780接种小鼠。通过逆转录病毒转导cw*03限制性ny-eso-1(92-100)特异性二代tcr文库(肿瘤#3)来产生治疗性t细胞。在第3天，小鼠接受4×106个经tcr转导或未转导的t细胞，或不处理小鼠。在第3至5天，将所有输注t细胞的动物腹膜内注射5×104il-2(peprotech)。每隔一天测量肿瘤生长。通过公式0.5×(长径)×(短径)2来计算肿瘤体积。当肿瘤体积达到2,000mm3时，处死动物。统计分析采用学生t检验来评估两组值之间的统计学显著差异。尽管出于举例说明的目的已经详细描述了本发明，但应理解，这些详细描述仅用于说明目的，并且本领域技术人员可以在不脱离由权利要求限定的发明的精神和范围的情况下对其进行改变，其旨在举例说明本公开的实施方式，但并不表示限制性的。当前第1页12当前第1页12