本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测卡那霉素的生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术：
抗生素具有杀死和摧毁微生物细胞结构的功能，在世界范围内被广泛的应用于各种抗菌药物的制备，与此同时，抗生素的滥用已经成为世界范围内急需解决的难题。抗生素的过量使用，可以刺激感染引起的细菌变得更具耐药性。抗生素也被用于食品行业，比如牛奶，蜂蜜，肉制品等食物中。食品中的抗生素残留会对人体健康产生严重威胁，因此，发明一种能够检测食品和环境中微量抗生素的方法来保护我们的健康是很迫切而且重要的。
卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，不按量使用易引发过敏反应，损害神经系统、泌尿系统、消化系统。目前，常用的卡那霉素检测方法包括荧光检测、高效液相色谱法(hplc)、毛细管电泳法(ce)、酶联免疫吸附测定(elisa)和表面等离子体共振(spr)等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应抗生素检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。
因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测食品中残留的卡那霉素。
技术实现要素：
为了解决以上现有技术中检测卡那霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体构象变化及exoiii辅助循环放大检测卡那霉素的生物传感器。
本发明还提供了上述生物传感器检测卡那霉素的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种基于核酸适配体检测卡那霉素的生物传感器，包括金电极，由内到外依次修饰在金电极上的hap2层和hap1-aptamer-primer层；
所述hap2的序列如seqno.1所示，其5’端修饰巯基（-sh）；
所述hap1的序列如seqno.2所示、所述aptamer的序列如seqno.3所示；所述primer的序列如seqno.4所示；
所述hap1-aptamer-primer层中含有hap1、aptamer、primer、exoiii。
所述的生物传感器，hap2层的厚度为15±2nm，hap1-aptamer-primer层的厚度为10±2nm。
所述hap1-aptamer-primer层中hap1（摩尔）、aptamer（摩尔）、primer（摩尔）、exoiii（活性）的摩尔与活性的比为1:1:1:250。
一种上述生物传感器的检测卡那霉素的方法，包括以下步骤：
（1）对电极进行抛光处理；
（2）将hap2溶液滴加到电极表面，37℃恒温孵育；
（3）将hap1、aptamer、primer和exoiii的混合液分别与待测液或系列浓度的卡那霉素溶液在37℃下温孵育，然后将上述混合液分别滴加到步骤（2）获得的电极表面，37℃下温孵育，然后清洗电极；
（4）将血红素滴加到步骤（3）获得的电极上，37℃恒温孵育，然后清洗电极；
（5）以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，以步骤（4）获得的电极为工作电极，在含h2o2的溶液中采用差分脉冲伏安法进行信号的检测；根据电信号计算回归方程，计算待测液中卡那霉素含量。
上述方法中，所述血红素的终浓度为1-30mm，优选为1-20mm。所述h2o2的终浓度为1-3.5mm，优选为1-2.5mm。所述反应时间为0.5-3h，优选为0.5-2h。
所述步骤（1）中抛光处理方法为：电极分别在0.3µm和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）和二次水冲洗3-5次。
所述步骤（5）中电位设置为-0.1~-1v，扫描速率为0.06s，脉冲宽度为0.05v。
本生物传感器的原理如下：
卡那霉素的aptamer与primer能够形成拱形探针，在卡那霉素存在的情况下，拱形探针中的aptamer同抗生素结合，释放primer。
hap1含有能够形成发夹结构的序列，primer存在的情况下能够打开发夹形成双链结构，在exoiii作用下剪切hap1，释放trigger链（5’-cccagttggccctatt-3’）。
hap2含有能够形成发夹结构的序列，其5’端修饰有巯基(-sh)，可以与金电极形成稳定的au-s键，从而将hap2固定在电极表面；trigger链打开hap2发夹形成双链结构，在exoiii作用下剪切hap2，释放的部分hap2序列中含有大量鸟嘌呤g，在存在钾离子的情况下，加入血红素可形成g-四联体/血红素复合物，该复合物能够充当辣根过氧化物酶的作用，氧化还原双氧水，从而得到明显的电信号，通过检测该氧化还原电信号实现定量检测目标物的目的。
本发明具有以下优点：
本发明的生物传感器的电极简便、小型化、易携带、可多次使用；检测的主要过程均是在电极上实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，反应条件温和，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；本发明的生物传感器，制备方法简单，工艺成本低，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中卡那霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。
附图说明
图1为本生物传感器的工作原理；
图2为不同血红素浓度对检测卡那霉素的影响；
图3为不同h2o2浓度对检测卡那霉素的影响；
图4为不同反应时间对检测卡那霉素的影响；
图5为不同卡那霉素浓度的电流扫描图；
图6为检测卡那霉素的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例中，pbs缓冲液含na2hpo4(10mm)，nah2po4(10mm)，nacl(140mm)，kcl(1mm)，mgcl2(1mm)，cacl2(1mm)，ph值为7.4。
配制的pbs缓冲液与超纯水均在120℃的温度下灭菌20min。
各dna序列如下：
hap2：5’-sh-gggttgggcgggatggggggccaactggg-3’；
hap1：5’-cccagttggccctattcccgcaactagccg-3’；
aptamer：5’-gcgacccgtgggggttgaggctaagccg-3’；
primer：5’-cggctagttgcgggtcgc-3’。
实施例1不同血红素浓度对检测卡那霉素的影响。
（1）对电极进行抛光处理：电极分别在0.3µm和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）和超纯水分别冲洗3次；
（2）将10μl1.0μm的hap2滴加到电极表面，在37℃下孵育2h；
（3）将灭菌水，2μl1×的exoiii缓冲液，2μlhap1(10μm)，2μlaptamer(10μm)，2μlprimer(10μm)，2μlexoiii(100u/μl)，8μl灭菌水和2μl10nm卡那霉素溶液加入到预先准备好的灭菌的离心管中；震荡30s混匀，然后将混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h；再将上述混合液分别滴加到步骤（2）获得的电极表面，37℃下温孵育2h，然后用pbs漂洗电极3次；
（4）将10μl血红素（终浓度为1.0mm，5.0mm，10mm，15mm，20mm，25mm，30mm）滴加到步骤（3）获得的电极上，然后将电极置于37℃的恒温箱中孵育20min，然后用pbs漂洗电极3次；
（5）以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，以步骤（4）获得的电极为工作电极，在15ml包含了2.5mmh2o2的pbs中采用差分脉冲伏安法进行信号的检测；电位设置为-0.1~-1v，扫描速率为0.06s，脉冲宽度为0.05v。
以血红素浓度为横坐标，以电流信号为纵坐标做曲线，如图2所示。根据图2可知，检测到的电流信号随着血红素的浓度在0-20mm区间内增大而增大，当浓度超过20mm后，电流趋于稳定。
实施例2不同h2o2浓度对检测卡那霉素的影响。
（1）对电极进行抛光处理：电极分别在0.3µm和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）和超纯水分别冲洗3次；
（2）将10μl1.0μm的hap2滴加到电极表面，在37℃下孵育2h；
（3）将灭菌水，2μl1×的exoiii缓冲液，2μlhap1(10μm)，2μlaptamer(10μm)，2μlprimer(10μm)，2μlexoiii(100u/μl)，8μl灭菌水和2μl10nm卡那霉素溶液加入到预先准备好的灭菌的离心管中；震荡30s混匀，然后将混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h；再将上述混合液分别滴加到步骤（2）获得的电极表面，37℃下温孵育2h，然后用pbs漂洗电极3次；
（4）将10μl血红素（终浓度为20mm）滴加到步骤（3）获得的电极上，然后将电极置于37℃的恒温箱中孵育20min，然后用pbs漂洗电极3次；
（5）以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，以步骤（4）获得的电极为工作电极，在15ml包含了1.0mm，1.5mm，2.0mm，2.5mm，3.0mm，3.5mmh2o2的pbs中采用差分脉冲伏安法进行信号的检测；电位设置为-0.1~-1v，扫描速率为0.06s，脉冲宽度为0.05v。
以h2o2浓度为横坐标，以电流信号为纵坐标做曲线，如图3所示。根据图3可知，检测到的电流信号随着h2o2的浓度在0-2.5mm区间内增大而增大，当浓度超过2.5mm后，电流趋于稳定。
实施例3不同反应时间对检测卡那霉素的影响。
（1）对电极进行抛光处理：电极分别在0.3µm和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）和超纯水分别冲洗3次；
（2）将10μl1.0μm的hap2滴加到电极表面，在37℃下孵育2h；
（3）将灭菌水，2μl1×的exoiii缓冲液，2μlhap1(10μm)，2μlaptamer(10μm)，2μlprimer(10μm)，2μlexoiii(100u/μl)，8μl灭菌水和2μl10nm卡那霉素溶液加入到预先准备好的灭菌的离心管中；震荡30s混匀，然后将混合液放入37℃的恒温箱中孵育0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h；再将上述混合液分别滴加到步骤（2）获得的电极表面，37℃下温孵育2h，然后用pbs漂洗电极3次；
（4）将10μl血红素（终浓度为20mm）滴加到步骤（3）获得的电极上，然后将电极置于37℃的恒温箱中孵育20min，然后用pbs漂洗电极3次；
（5）以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，以步骤（4）获得的电极为工作电极，在15ml包含了2.5mmh2o2的pbs中采用差分脉冲伏安法进行信号的检测；电位设置为-0.1~-1v，扫描速率为0.06s，脉冲宽度为0.05v。
以反应时间为横坐标，以电流信号为纵坐标做曲线，如图4所示。根据图4可知，检测到的电流信号随着h2o2的浓度在0-2.5mm区间内增大而增大，当浓度超过2.5mm后，电流趋于稳定。
实施例4检测卡那霉素。
（1）对电极进行抛光处理：电极分别在0.3µm和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）和超纯水分别冲洗3次；
（2）将10μl1.0μm的hap2滴加到电极表面，在37℃下孵育2h；
（3）将灭菌水，2μl1×的exoiii缓冲液，2μlhap1(10μm)，2μlaptamer(10μm)，2μlprimer(10μm)，2μlexoiii(100u/μl)，8μl灭菌水和2μl卡那霉素溶液（浓度分别为0.5pm，1pm，5pm，10pm，50pm，100pm，500pm，1nm，5nm，10nm，50nm）加入到预先准备好的灭菌的离心管中；震荡30s混匀，然后将混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h；再将上述混合液分别滴加到步骤（2）获得的电极表面，37℃下温孵育2h，然后用pbs漂洗电极3次；
（4）将10μl血红素（终浓度为20mm）滴加到步骤（3）获得的电极上，然后将电极置于37℃的恒温箱中孵育20min，然后用pbs漂洗电极3次；
（5）以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，以步骤（4）获得的电极为工作电极，在15ml包含了2.5mmh2o2的pbs中采用差分脉冲伏安法进行信号的检测；电位设置为-0.1~-1v，扫描速率为0.06s，脉冲宽度为0.05v。
结果见图5和图6，从图5中可以看出，检测到的电流信号随着目标物浓度在1pm-10nm区间内增大而增大，图6显示卡那霉素浓度的对数与电流峰值大小呈正比关系，拟合曲线为i=0.73101+0.47343lg(c/pm)，其中c为卡那霉素的浓度（pm），相关系数是0.97959。
同时，从图5和图6中可以看出，在1pm和10nm的浓度基础上继续分别向更低和更高的浓度检测，经检测当浓度低于1pm和高于10nm时，卡那霉素浓度的对数与电流峰值大小恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流峰值最低值和最高值。因此，可得到该方法检测下限与上限分别为1pm和10nm。
<110>济南大学
<120>一种基于核酸适配体检测卡那霉素的生物传感器
<130>20180117
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
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<220>
<223>primer
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cggctagttgcgggtcgc18