本发明属于石蜡切片技术领域，具体涉及一种枣花石蜡切片的制备方法。
背景技术：
枣树(ziziphusjujubamill.)原产于中国，是一种重要的经济树种。其果形美观、味道鲜美，富含人体所需的多种氨基酸、维生素、多糖等有益物质，具有很高的食疗价值和保健功效，深受广大消费者的喜爱。杂交育种是目前果树新品种培育最主要的方法之一，但枣树杂交育种长期徘徊不前，主要原因是枣树花为两性花，花朵很小，致使去雄困难，且落花落果严重，坐果率低等等生物学特性不利于杂交育种及选种，同时目前枣树胚胎学方面相关的研究不够深入，一定程度上也限制了枣树遗传改良工作的开展，使得枣树种质创新较为落后。
石蜡切片是组织学研究中的重要实验技术，其基本步骤包括取材与固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、修蜡、切片、展片与烘片、脱蜡、复水、染色、封片和观察等一系列特殊处理。虽然整个操作过程不复杂，但是要制出高质量的切片，每一个步骤的操作都很重要，且具有不同组织结构的植物以及植物不同部位的组织结构所需的处理方法不同。
目前，以枣花为材料开展石蜡切片技术的研究较少，且切片效果不是特别理想，主要问题是枣花较小且比较幼嫩，容易造成切片破碎不完整、组织结构不清晰，不利于观察。鉴于目前枣树生殖生物学研究基础较为薄弱，且石蜡切片技术又是研究植株生物学特征较好的方法，所以找到适合枣树花朵石蜡切片的制备方法，对观察枣花发育过程中胚囊组织结构的变化及生殖过程的基本规律具有重要意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种枣花石蜡切片的制备方法，所述方法制备的切片组织结构完整，清晰，易于观察。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种枣花石蜡切片的制备方法，包括如下步骤：
1)将枣花花蕾置于固定液中，固定24～36h，得到固定枣花；
所述枣花花蕾带有长度为0.3～0.5cm的茎段；
所述固定液是将体积浓度为38％的甲醛水溶液、冰醋酸和体积浓度为50％的乙醇水溶液按体积比为0.95～1.05:0.95～1.05:17.5～18.5配置得到；
2)将所述步骤1)中的固定枣花脱水，得到脱水枣花；
3)将所述步骤2)中的脱水枣花与第一透明剂混合浸泡进行第一透明处理，得到第一透明枣花；
所述第一透明剂为无水乙醇和二甲苯按照体积比为0.95～1.05：0.95～1.05混合形成的混合液；
4)将所述步骤3)中第一透明枣花与二甲苯混合浸泡进行第二透明处理，得到第二透明枣花和二甲苯体系；
5)向所述步骤4)的第二透明枣花依次加入二甲苯和温度为54～57℃液体石蜡，形成的含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液在39～41℃下烘烤35～37h，再以每1.4～1.6h升温3℃的速率升温到57～59℃保温2.8～3.2h，形成预浸蜡枣花；所述保温后用57～59℃的液体石蜡替换二甲苯石蜡混合液浸泡预浸蜡枣花，得到浸蜡枣花；
6)将所述步骤5)中的浸蜡枣花和57～59℃的液体石蜡同时倒入包埋盒中进行包埋，2～3s后调整浸蜡枣花的位置，使浸蜡枣花与包埋盒底面平行，冷却，得到包埋枣花蜡块；
7)将所述步骤6)中的包埋枣花蜡块进行修蜡，得到修整蜡块；
8)将所述步骤7)中的修整蜡块进行切片，得到枣花切片蜡带；
所述枣花切片蜡带的厚度为7.5～8.5μm；
9)将所述步骤8)得到的枣花切片蜡带转移至23～28℃的水中，将枣花切片蜡带在水中舒展，将舒展后的枣花切片蜡带转移至载玻片上，将负载在载玻片上的枣花切片蜡带展片，得到负载在载玻片上的枣花切片；
10)将所述步骤9)得到的负载在载玻片上的枣花切片用二甲苯浸泡脱蜡13～17min，更换二甲苯再次浸泡脱蜡10～15min，得到脱蜡的枣花切片；
11)将所述步骤10)得到的脱蜡的枣花切片用复水剂浸泡复水9～11min，得到预复水枣花切片；
所述复水剂为二甲苯和无水乙醇按体积比为0.95～1.05:0.95～1.05混合得到的混合液；
12)将所述步骤11)得到的预复水枣花切片依次采用无水乙醇、体积浓度为95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液浸泡复水，再转入蒸馏水中浸泡170～190s，得到复水枣花切片；
所述无水乙醇、体积浓度为95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液浸泡的时间独立为170～190s；
13)将所述步骤12)得到的复水枣花切片用质量浓度为4％的铁矾溶液浸泡9.5～10.5min后第一水洗，再用苏木精染液浸泡染色23～27min后第二水洗，再用饱和苦味酸溶液浸泡15～30min后第三水洗，得到染色枣花切片；
14)将所述步骤13)得到的染色枣花切片用二甲苯浸湿，吸去二甲苯，向浸湿的枣花切片滴入中性树胶，盖片，在37～39℃下烘烤28～35min，得到枣花石蜡切片。
优选的，所述步骤2)中脱水的方式为：先用体积浓度为30％的乙醇水溶液对所述固定枣花冲洗1～2次后，再依次采用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇浸泡，更换无水乙醇再浸泡25～35min；
所述体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇浸泡的时间独立为0.9～1.1h。
优选的，所述步骤3)中浸泡的时间为1.8～2.2h。
优选的，所述步骤4)中浸泡的次数为2次，每次浸泡的时间为1.4～1.6h/次。
优选的，所述步骤5)中浸泡的方法为：将第二透明枣花在57～59℃条件下每浸泡2.8～3.2h后更换57～59℃的液体石蜡；所述更换的次数为2次。
优选的，所述步骤5)或6)中液体石蜡为首次使用石蜡和多次使用石蜡的混合液；
所述首次使用石蜡和多次使用石蜡的体积比为0.95～1.05:0.95～1.05。
优选的，所述步骤9)中载玻片上展片的时间为30～50min。
优选的，所述步骤9)中载玻片上展片的温度为45～55℃。
优选的，所述步骤13)中第一冲洗的时间为8～12min；
第二冲洗的时间为8～12min；
第三冲洗的时间为5～10min。
优选的，所述步骤14)中的中性树胶的使用量为10～20μl/片。
本发明提供了一种枣花石蜡切片的制备方法，包括如下步骤：1)将枣花花蕾固定；2)脱水；3)第一透明处理4)第二透明处理；5)浸蜡；6)包埋；7)修蜡；8)切片；9)展片；10)脱蜡；11)一次复水；12)二次复水；13)染色；14)盖片，封片。本发明提供的枣花石蜡切片制备方法，在花蕾基部保留一段0.3～0.5cm的茎段，方便后续操作中夹住茎段移取和包埋时调整位置，同时茎段能够维持花蕾水平放置，使得包埋时花蕾始终是平行于包埋盒底面，使切片时能够切到胚囊完整的纵截面，进而方便观察胚囊内部细胞和组织结构的发育变化；由于枣树花蕾材料比较幼嫩，选择体积浓度为50％的乙醇水溶液配制固定液，采用较低浓度的乙醇水溶液进行配制固定液，可以防止材料缩水，进而能够保持细胞的完整形态；选择切片厚度为8μm可以在每一片蜡带中更完整的保留胚囊发育结构。
同时，本发明以质量浓度为4％铁矾溶液作为媒染剂，能够使得材料更好更充分的染色，缩短染色时间、增加染色效果；以饱和苦味酸进行分色，能够根据前期染色效果调整分色时间，获得组织结构清晰、完整的切片。
进一步的，脱水方式为先用体积浓度为30％的乙醇水溶液冲洗1～2次后，依次采用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇浸泡，更换无水乙醇再浸泡25～35min，选择梯度差较小的各体积浓度的乙醇依次进行浸泡脱水，防止梯度浓度过大引起材料组织结构变形。
进一步的，本发明提供的方法浸蜡过程中所有使用的石蜡都是由体积比为0.95～1.05:0.95～1.05新蜡和旧蜡融合而成，避免新蜡硬度太大，渗入到材料中凝固后破坏材料组织原有结构和防止切片时蜡带出现破碎和断裂。浸蜡时选择石蜡混合液在39～41℃下烘烤35～37h，使得浸蜡过程持续充分，能够让石蜡完全进入材料组织各部位，为后期制作出高质量的蜡带奠定基础。本发明制备得到的石蜡切片质量高、组织结构清晰完整、效果明显、可操作性强、可重复性高、实用性强。本发明提供的方法可以对不同发育时期的枣花花蕾进行石蜡切片，进而观察整个枣花发育过程中囊胚组织结构的变化及生殖过程的基本规律。
附图说明
图1为实施例1中制备得到的处于胚珠倒生时期枣花石蜡切片显微照片；
图2为实施例2中制备得到的处于胚珠倒生时期枣花石蜡切片显微照片；
图3为实施例3中制备得到的处于胚珠倒生时期枣花石蜡切片显微照片；
图4为对照例1中制备得到的处于胚珠倒生时期枣花石蜡切片显微照片；
图5为实施例1中制备得到的大孢子母细胞时期枣花石蜡切片显微照片；
图6为实施例2中制备得到的大孢子母细胞时期枣花石蜡切片显微照片；
图7为实施例3中制备得到的大孢子母细胞时期枣花石蜡切片显微照片；
图8为对照例1中制备得到的大孢子母细胞时期枣花石蜡切片显微照片。
具体实施方式
本发明提供了一种枣花石蜡切片的制备方法，包括如下步骤：
1)将枣花花蕾置于固定液中，固定24～36h，得到固定枣花；
所述枣花花蕾带有长度为0.3～0.5cm的茎段；
所述固定液是将体积浓度为38％的甲醛水溶液、冰醋酸和体积浓度为50％的乙醇水溶液按体积比为0.95～1.05:0.95～1.05:17.5～18.5配置得到；
2)将所述步骤1)中的固定枣花脱水，得到脱水枣花；
3)将所述步骤2)中的脱水枣花与第一透明剂混合浸泡进行第一透明处理，得到第一透明枣花；
所述第一透明剂为无水乙醇和二甲苯按照体积比为0.95～1.05：0.95～1.05混合形成的混合液；
4)将所述步骤3)中第一透明枣花与二甲苯混合浸泡进行第二透明处理，得到第二透明枣花和二甲苯体系；
5)向所述步骤4)的第二透明枣花依次加入二甲苯和温度为54～57℃液体石蜡，形成的含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液在39～41℃下烘烤35～37h，再以每1.4～1.6h升温3℃的速率升温到57～59℃保温2.8～3.2h，形成预浸蜡枣花；所述保温后用57～59℃的液体石蜡替换二甲苯石蜡混合液浸泡预浸蜡枣花，得到浸蜡枣花；
6)将所述步骤5)中的浸蜡枣花和57～59℃的液体石蜡同时倒入包埋盒中进行包埋，2～3s后调整浸蜡枣花的位置，使浸蜡枣花与包埋盒底面平行，冷却，得到包埋枣花蜡块；
7)将所述步骤6)中的包埋枣花蜡块进行修蜡，得到修整蜡块；
8)将所述步骤7)中的修整蜡块进行切片，得到枣花切片蜡带；
所述枣花切片蜡带的厚度为7.5～8.5μm；
9)将所述步骤8)得到的枣花切片蜡带转移至23～28℃的水中，将枣花切片蜡带在水中舒展，将舒展后的枣花切片蜡带转移至载玻片上，将负载在载玻片上的枣花切片蜡带展片，得到负载在载玻片上的枣花切片；
10)将所述步骤9)得到的负载在载玻片上的枣花切片用二甲苯浸泡脱蜡13～17min，更换二甲苯再次浸泡脱蜡10～15min，得到脱蜡的枣花切片；
11)将所述步骤10)得到的脱蜡的枣花切片用复水剂浸泡复水9～11min，得到预复水枣花切片；
所述复水剂为二甲苯和无水乙醇按体积比为0.95～1.05:0.95～1.05混合得到的混合液；
12)将所述步骤11)得到的预复水枣花切片依次采用无水乙醇、体积浓度为95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液浸泡复水，再转入蒸馏水中浸泡170～190s，得到复水枣花切片；
所述无水乙醇、体积浓度为95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液浸泡的时间独立为170～190s；
13)将所述步骤12)得到的复水枣花切片用质量浓度为4％的铁矾溶液浸泡9.5～10.5min后第一水洗，再用苏木精染液浸泡染色23～27min后第二水洗，再用饱和苦味酸溶液浸泡15～30min后第三水洗，得到染色枣花切片；
14)将所述步骤13)得到的染色枣花切片用二甲苯浸湿，吸去二甲苯，向浸湿的枣花切片滴入中性树胶，盖片，在37～39℃下烘烤28～35min，得到枣花石蜡切片。
本发明将枣花花蕾置于固定液中，固定24～36h，得到固定枣花；所述枣花花蕾带有长度为0.3～0.5cm的茎段；所述固定液是将体积浓度为38％的甲醛水溶液溶液、冰醋酸和体积浓度为50％的乙醇水溶液按体积比为0.95～1.05:0.95～1.05:17.5～18.5配制得到。
本发明中，所述枣花花蕾带有长度为0.3～0.5cm的茎段，优选为0.4cm。枣花花蕾带有上述长度的茎段，方便后续操作中夹住茎段移取和包埋时调整位置，同时茎段能够维持花蕾水平放置，使得包埋时花蕾始终是平行于包埋盒底面，使切片时能够切到胚囊完整的纵截面，进而方便观察胚囊内部细胞和组织结构的发育变化。
本发明中，所述枣花花蕾与固定液的比例没有特殊限制，将枣花花蕾能够完全浸没在固定液中即可。
本发明对所述枣花花蕾所用的枣树的品种没有特殊限定，采用本领域常规枣树即可。本发明实施例中采用冬枣直径为1.2～3.1mm的枣花花蕾。
本发明中，所述枣花花蕾置于固定液中的固定时间为24～36h，优选为30h。在本发明中，所述体积浓度为38％的甲醛水溶液、冰醋酸和体积浓度为50％的乙醇水溶液按体积比优选为1:1:18。所述固定液能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。由于枣树花蕾材料比较幼嫩，选择体积浓度为50％的乙醇水溶液作为组分配制固定液，可以防止枣花材料缩水，进而能够保持细胞的完整形态；选择切片厚度为8μm可以在每一片蜡带中更完整的保留胚囊发育结构。
本发明对所述甲醛水溶液、冰醋酸和乙醇水溶液的来源没有特殊限定采用本领域常规市售产品即可。
得到固定枣花后，本发明对所述固定枣花脱水，得到脱水枣花。
本发明中，所述脱水的方式优选为：先用体积浓度为30％的乙醇水溶液对所述固定枣花冲洗后，再依次采用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇浸泡，更换无水乙醇再浸泡25～35min。所述冲洗的时间优选为1～3min，更优选为2min。所述体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇浸泡的时间独立为0.9～1.1h，优选为1h。所述更换无水乙醇再浸泡的时间优选为30min。采用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇依次浸泡，乙醇浓度的梯度差较小，防止梯度浓度过大引起材料组织结构变形。
本发明中，所述脱水时，对加入的脱水溶液的体积没有特殊限定，能够完全浸没固定枣花即可。
本发明对所述体积浓度为30％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售无水乙醇产品配制即可。
得到脱水枣花后，本发明将所述脱水枣花与透明剂混合浸泡进行第一透明处理，得到第一透明枣花；所述透明剂为无水乙醇和二甲苯按照体积比为0.95～1.05：0.95～1.05混合形成的混合液。
本发明中，所述无水乙醇和二甲苯的体积比优选为1:1。所述浸泡的时间优选为1.8～2.2h，更优选为2h。
本发明对所述脱水枣花与透明剂混合时的比例没有特殊限定，加入的透明剂能够完全浸没固定枣花即可。
本发明对所述无水乙醇和二甲苯的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
得到第一透明枣花后，本发明将所述第一透明枣花与二甲苯混合浸泡进行第二透明处理，得到第二透明枣花和二甲苯体系。
本发明中，所述第二透明处理时浸泡的次数优选为2次。所述浸泡的时间优选为1.4～1.6h/次，更优选为1.5h/次。脱水枣花经二次透明处理，组织内细胞液替换成酒精，进而利于后续过程中石蜡进入枣花花蕾组织中。
本发明对所述第一透明枣花与二甲苯混合的比例没有特殊限定，加入的二甲苯能够完全浸没固定枣花即可。
本发明对所述二甲苯的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
得到第二透明枣花后，本发明向所述第二透明枣花依次加入二甲苯和温度为54～57℃的液体石蜡，形成的含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液在39～41℃下烘烤35～37h，再以每1.4～1.6h升温3℃的速率升温到57～59℃保温2.8～3.2h，形成预浸蜡枣花；所述保温后用57～59℃的液体石蜡替换二甲苯石蜡混合液，浸泡预浸蜡枣花，得到浸蜡枣花。
本发明中，向所述第二透明枣花依次加入二甲苯和温度为54～57℃的液体石蜡，形成的含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液。所述液体石蜡的温度优选为58℃。所述温度为54～57℃的液体石蜡是处于半凝固状态的石蜡。半凝固状态的石蜡有利于防止温度过高对材料造成伤害。所述温度为54～57℃的液体石蜡的熔点优选为56～58℃。
在本发明中，所述液体石蜡优选为首次使用和多次使用石蜡的混合液。所述首次使用和多次使用石蜡的体积比优选为0.95～1.05:0.95～1.05，更优选为1:1。使用首次使用和多次使用石蜡的混合液，可以避免新蜡硬度太大，渗入到材料中凝固后破坏材料组织原有的结构和防止切片时蜡带出现破碎和断裂。
本发明中，所述二甲苯与液体石蜡的体积比优选为0.95～1.05:0.95～1.05，更优选为1:1。形成含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液，本发明将形成的含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液在39～41℃下烘烤35～37h。所述烘烤的温度优选为40℃，所述烘烤的时间优选为36h。在本发明中，所述烘烤使得浸蜡过程持续充分，能够让石蜡完全进入枣花花蕾组织各个部位，为后期做出高品质的蜡带奠定基础。
所述烘烤后，本发明将得到的烘烤体系再以每1.4～1.6h升温3℃的速率升温至57～59℃后，保温2.8～3.2h，用57～59℃的液体石蜡替换二甲苯石蜡混合液浸泡预浸蜡枣花，得到浸蜡枣花。在本发明中，所述升温时的所述间隔的时间优选为1.5h。所述保温的时间优选为3h。
本发明中，所述液体石蜡对预浸蜡枣花进行浸泡的方法优选为：将预浸蜡枣花在57～59℃条件下每浸泡2.8～3.2h后更换57～59℃的液体石蜡。所述更换57～59℃液体石蜡的次数优选为2次。所述液体石蜡的组成同上述方案所述的液体石蜡。
得到浸蜡枣花后，本发明将所述浸蜡枣花和57～59℃的液体石蜡同时倒入包埋盒中进行包埋，2～3s后调整浸蜡枣花的位置，使浸蜡枣花与包埋盒底面平行，冷却，得到包埋枣花蜡块。
本发明中，在包埋前优选对包埋盒进行预热。所述预热的温度优选为55～60℃，更优选为58℃。
将所述浸蜡枣花和57～59℃的液体石蜡同时倒入包埋盒中，2～3s后优选采用预热到80～90℃的解剖针调整浸蜡枣花的位置，使浸蜡枣花与包埋盒底面平行。本发明中，所述冷却的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。所述冷却的时间为12～36h，更优选为24h。
得到包埋枣花蜡块后，本发明将所包埋枣花蜡块进行修蜡，得到修整蜡块。
本发明中，所述修蜡优选为：根据枣花花蕾在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成截面为矩形的小蜡块，蜡块切面的边长为枣花花蕾直径的2～3倍。对包埋枣花蜡块进行修蜡，有利于使后续切片得到的蜡带笔直，方便按顺序依次分段进行展片，同时也避免了在切腊过程中断带和不完整条带的出现，完整的保存每一片蜡带上的材料，保证观察到完整的胚囊发育过程。
得到修整蜡块后，本发明将所述修整蜡块进行切片，得到枣花切片蜡带；所述枣花切片蜡带的厚度为7.5～8.5μm，优选为8μm。所述切片可以在每一片蜡带中完整的保留胚囊发育结构。
本发明对所述修蜡、切片所用的设备没有特殊限定，采用本领域常规设备即可。
得到枣花切片蜡带后，本发明将所述枣花切片蜡带转移至23～28℃的水中，将枣花切片蜡带在水中舒展，将舒展后的枣花切片蜡带转移至载玻片上，将负载在载玻片上的枣花切片蜡带展片，得到负载在载玻片上的枣花切片。
本发明中，所述水的温度为23～28℃，优选为25℃。本发明中，将舒展后的枣花切片蜡带转移至载玻片上前优选在载玻片上先涂抹粘片剂，在滴加1～2滴蒸馏水。所述粘片剂的涂抹量为10～20μl/片，更优选为15μl/片。所述粘片剂优选为蛋清和甘油的混合溶液。所述蛋清和甘油的体积比优选为0.9～1.5，更优选为1:1。在本发明中，所述展片的温度为45～55℃，优选为50℃。所述展片的时间优选为30～50min，更优选为40min。展片完成后载玻片上的水分蒸干。
得到负载在载玻片上的枣花切片后，本发明将所述负载在载玻片上的枣花切片用二甲苯浸泡脱蜡13～17min，更换二甲苯再次浸泡脱蜡10～15min，得到脱蜡的枣花切片。本发明中，所述浸泡脱蜡的时间为13～17min，优选为15min。所述再次浸泡脱蜡的时间为10～15min，优选为13min。脱蜡后材料周围变的透明。
得到脱蜡的在枣花切片后，本发明将所述脱蜡的枣花切片用复水剂浸泡复水9～11min，得到预复水枣花切片。所述浸泡时间优选为10min。所述复水剂为二甲苯和无水乙醇按体积比为0.95～1.05:0.95～1.05混合得到的混合液，优选为1:1。
得到预复水枣花切片后，本发明将所述预复水枣花切片依次采用体积浓度为100％、95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液浸泡复水，再转入蒸馏水中浸泡170～190s，得到复水枣花切片。所述蒸馏水中浸泡的时间优选为180s。所述体积浓度为100％、95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液浸泡的时间独立为170～190s，更优选为180s。
得到复水枣花切片后，本发明将所述复水枣花切片用质量浓度为4％的铁矾溶液浸泡9.5～10.5min，第一冲洗，再用苏木精染液浸泡染色23～27min，第二冲洗，再用饱和苦味酸溶液浸泡15～30min，第三冲洗，得到染色枣花切片。
本发明中，用质量浓度为4％的铁矾溶液浸泡的时间为9.5～10.5min，优选为10min。所述第一冲洗的时间优选为8～12min，更优选为10min。采用质量浓度为4％的铁矾溶液作为媒染剂，能够使得枣花花蕾更好更充分染色，能够缩短染色时间、增加染色效果。
本发明中，用苏木精染液浸泡染色的时间为23～27min，优选为25min。所苏木精染液的质量浓度为0.4～0.8％，更优选为0.5％。采用苏木精作为染色剂利于细胞核染色。所述第二冲洗的时间优选为8～12min，更优选为10min。
本发明中，用饱和苦味酸溶液浸泡的时间为15～30min，优选为20～25min，更优选为23min。采用饱和苦味酸进行分色，能够根据使获得的组织结构清晰，完整。所述第三冲洗的时间优选为5～10min，更优选为8min。
本发明对所述质量浓度为4％的铁矾溶液、苏木精和饱和苦味酸的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
得到染色枣花切片后，本发明将所述染色枣花切片用二甲苯浸湿，吸去二甲苯，向浸湿的枣花切片滴入中性树胶，盖片，在37～39℃下烘烤28～35min，得到枣花石蜡切片。
本发明中，将所述染色枣花切片用二甲苯浸湿后，优选将载玻片背面及染色枣花周围的多余二甲苯用擦镜纸吸去。在滴入中性树胶后优选晃动载玻片，使中性树胶和二甲苯充分混合。所述中性树胶优选为加拿大中性树胶。所述中性树胶的使用量优选为10～20μl/片，更优选为15μl/片。
本发明中，所述盖片的方式为将盖玻片一侧放置在滴有树胶的切片上，慢慢放下盖玻片，并将空气排除。
本发明中所述烘烤的温度为37～39℃，更优选为38℃，所述烘烤的时间为28～35min，更优选为30min。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
从枣树枝条上剪取两个不同开花时间的枣花花蕾，分别为直径为1.21mm，颜色为绿黄色的枣花花蕾和直径为2.00mm，颜色为黄绿色的枣花花蕾，并依次标记为1和2号，将这两个枣花花蕾分别按照下述操作步骤：
将枣花花蕾基部保留0.3cm的茎段，置于固定液(固定液为：将体积浓度为38％的甲醛水溶液、冰醋酸和体积浓度为50％的乙醇水溶液按体积比为0.95:1.05:17.5配置)中固定36h，得到固定枣花。将得到的固定枣花先用体积浓度为30％的乙醇水溶液冲洗3min，再依次用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇各浸泡0.9h，更换无水乙醇再浸泡35min，得到脱水枣花。将得到的脱水枣花与透明剂(透明剂为：无水乙醇和二甲苯按0.95:1.05的体积比配制)混合浸泡1.8h，得到第一透明枣花。将得到的第一透明枣花与二甲苯混合浸泡1.4h，弃掉二甲苯，从新倒入二甲苯浸泡1.6h，得到第二透明枣花与二甲苯的混合物。将得到的第二透明枣花依次加入二甲苯和温度为54～57℃的液体石蜡，形成含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液，在39℃下烘烤37h后再以每1.4h升高3℃的速率升温至57℃后，保温2.8h，将二甲苯石蜡混合液倒出，加入温度为57℃的液体石蜡，在57℃下每浸泡3.2h后更换温度为57℃的液体石蜡，更换2次，得到浸蜡枣花。
将得到的浸蜡枣花和57℃的液体石蜡一起倒入预热到60℃的包埋盒中，2～3s后枣花花蕾沉入包埋盒底部，用预热的解剖针调整枣花花蕾位置，使枣花花蕾平行于包埋盒底部，在30℃下冷却36h，得到包埋枣花蜡块。将得到的包埋枣花蜡块根据枣花花蕾在蜡块中的位置和方向，将蜡块修整，使蜡块切面的边长为枣花花蕾直径的2～3倍，切面光滑平整。修蜡后进行切片，切片厚度为7.5μm，得到枣花切片蜡带。将得到的枣花切片蜡带的条带正面朝上按顺序平铺在洁净处。再用小镊子将蜡带放到温度为23℃的水中，蜡带平铺在水面上。在载玻片上涂上10μl粘片剂(粘片剂为：蛋清和甘油按0.9:1的体积比配制)，再滴加1滴蒸馏水。将平铺在水面上的切片蜡带转移至涂油粘片剂的载玻片上，在45℃下展片50min，得到负载在载玻片上的枣花切片。将负载在载玻片上的枣花切片用二甲苯浸泡13min，更换二甲苯再次浸泡15min，得到脱蜡的枣花切片。将得到的脱蜡枣花切片用复水剂(复水剂为：二甲苯和无水乙醇按0.95:1的体积比配制)浸泡9min，得到预复水枣花切片。将得到的预复水枣花切片依次采用无水乙醇和体积浓度为95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液各浸泡复水190s，再转入蒸馏水中浸泡170s，得到复水枣花切片。
将得到的复水枣花切片用质量浓度为4％的铁矾溶液浸泡9.5min，冲洗12min后，再用质量浓度为0.8％的苏木精染液染色23min，冲洗8min，再用饱和苦味酸溶液浸泡30min，冲洗10min，得到染色枣花切片。将得到的染色枣花切片用二甲苯浸湿，用擦镜纸吸去枣花切片周围及载玻片底面的二甲苯，向浸湿二甲苯的枣花切片上滴加10μl加拿大中性树胶，轻轻晃动载玻片使二甲苯和树胶充分混合，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的切片上，慢慢放下盖玻片并将空气排除，在37℃的烘箱中烘烤35min，得到枣花石蜡切片。将石蜡切片在400倍显微镜下进行观察，具体结果1号花蕾如图1所示，切片观察到花蕾胚珠倒生，可以判定此时处于胚珠倒生时期；2号花蕾如图5所示，切片观察到细胞核大，细胞质浓的大孢子母细胞，可以判定处于大孢子母细胞时期。由图1和图5可以看出，本发明制备得到的枣花石蜡切片组织结构清晰、完整，易于观察，能够观察到整个胚囊内部细胞和组织结构。
实施例2
从枣树枝条上剪取两个不同开花时间的枣花花蕾，分别为直径为1.50mm，颜色为绿黄色的枣花花蕾和直径为2.23mm，颜色为黄绿色的枣花花蕾，并依次标记为3和4号，将这两个枣花花蕾分别按照下述操作步骤：
将枣花花蕾基部保留0.5cm的茎段，置于固定液(固定液为：将体积浓度为38％的甲醛水溶液、冰醋酸和体积浓度为50％的乙醇水溶液按体积比为1.05:0.95:18.5配置)中固定24h，得到固定枣花。将得到的固定枣花先用体积浓度为30％的乙醇水溶液冲洗1min，再依次用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇各浸泡1.1h，更换无水乙醇再浸泡25min，得到脱水枣花。将得到的脱水枣花与透明剂(透明剂为：无水乙醇和二甲苯按1.05:0.95的体积比配制)混合浸泡2.2h，得到第一透明枣花。将得到的第一透明枣花与二甲苯混合浸泡1.6h，弃掉二甲苯，从新倒入二甲苯浸泡1.5h，得到第二透明枣花与二甲苯的混合物。将得到的第二透明枣花依次加入二甲苯和温度为54～57℃的液体石蜡，形成含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液，在41℃下烘烤35h后再以每1.6h升高3℃的速率升温至59℃后，保温3.2h，将二甲苯石蜡混合液倒出，加入温度为59℃的液体石蜡，在59℃下每浸泡2.8h后更换温度为59℃的液体石蜡，更换2次，得到浸蜡枣花。
将得到的浸蜡枣花和59℃的液体石蜡一起倒入预热到55℃的包埋盒中，2～3s后枣花花蕾沉入包埋盒底部，用预热的解剖针调整枣花花蕾位置，使枣花花蕾平行于包埋盒底部，在20℃下冷却12h，得到包埋枣花蜡块。将得到的包埋枣花蜡块根据枣花花蕾在蜡块中的位置和方向，将蜡块修整，使蜡块切面的边长为枣花花蕾直径的2～3倍，切面光滑平整。修蜡后进行切片，切片厚度为8.5μm，得到枣花切片蜡带。将得到的枣花切片蜡带的条带正面朝上按顺序平铺在洁净处。再用小镊子将蜡带放到温度为28℃的水中，蜡带平铺在水面上。在载玻片上涂上20μl粘片剂(粘片剂为：蛋清和甘油按1.5:1的体积比配制)，再滴加1滴蒸馏水。将平铺在水面上的切片蜡带转移至涂油粘片剂的载玻片上，在55℃下展片30min，得到负载在载玻片上的枣花切片。将负载在载玻片上的枣花切片用二甲苯浸泡17min，更换二甲苯再次浸泡10min，得到脱蜡的枣花切片。将得到的脱蜡枣花切片用复水剂(复水剂为：二甲苯和无水乙醇按1.05:1的体积比配制)浸泡11min，得到预复水枣花切片。将得到的预复水枣花切片依次采用无水乙醇和体积浓度为95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液各浸泡复水170s，再转入蒸馏水中浸泡190s，得到复水枣花切片。
将得到的复水枣花切片用质量浓度为4％的铁矾溶液浸泡10.5min，冲洗8min后，再用质量浓度为0.4％的苏木精染液染色27min，冲洗12min，再用饱和苦味酸溶液浸泡15min，冲洗5min，得到染色枣花切片。将得到的染色枣花切片用二甲苯浸湿，用擦镜纸吸去枣花切片周围及载玻片底面的二甲苯，向浸湿二甲苯的枣花切片上滴加20μl加拿大中性树胶，轻轻晃动载玻片使二甲苯和树胶充分混合，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的切片上，慢慢放下盖玻片并将空气排除，在39℃的烘箱中烘烤28min，得到枣花石蜡切片。将石蜡切片在400倍显微镜下进行观察，具体结果3号花蕾如图2所示，切片观察到花蕾胚珠倒生，可以判定此时处于胚珠倒生时期；4号花蕾如图6所示，切片观察到细胞核大，细胞质浓的大孢子母细胞，可以判定处于大孢子母细胞时期。由图2和图6可以看出，本发明制备得到的枣花石蜡切片组织结构清晰、完整，易于观察，能够观察到整个胚囊内部细胞和组织结构。
实施例3
从枣树枝条上剪取两个不同开花时间的枣花花蕾，分别为直径为1.40mm，颜色为绿黄色的枣花花蕾和直径为2.10mm，颜色为黄绿色的枣花花蕾，并依次标记为5和6号，将这两个枣花花蕾分别按照下述操作步骤：
将枣花花蕾基部保留0.4cm的茎段，置于固定液(固定液为：将体积浓度为38％的甲醛水溶液、冰醋酸和体积浓度为50％的乙醇水溶液按体积比为1:1:18配置)中固定30h，得到固定枣花。将得到的固定枣花先用体积浓度为30％的乙醇水溶液冲洗2min，再依次用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液和无水乙醇各浸泡1h，更换无水乙醇溶液再浸泡30min，得到脱水枣花。将得到的脱水枣花与透明剂(透明剂为：无水乙醇和二甲苯按1:1的体积比配制)混合浸泡2h，得到第一透明枣花。将得到的第一透明枣花与二甲苯混合浸泡2h，得到第二透明枣花与二甲苯的混合物。将得到的第二透明枣花依次加入二甲苯和温度为54～57℃的液体石蜡，形成含有第二透明枣花的二甲苯石蜡混合液，在40℃下烘烤36h后再以1.5h升高3℃的速率升温至58℃后，保温3h，将二甲苯石蜡混合液倒出，加入温度为58℃的液体石蜡，在58℃下每浸泡3h后更换温度为58℃的液体石蜡，更换2次，得到浸蜡枣花。
将得到的浸蜡枣花和58℃的液体石蜡一起倒入预热到58℃的包埋盒中，2～3s后枣花花蕾沉入包埋盒底部，用预热的解剖针调整枣花花蕾位置，使枣花花蕾平行于包埋盒底部，在25℃下冷却24h，得到包埋枣花蜡块。将得到的包埋枣花蜡块根据枣花花蕾在蜡块中的位置和方向，将蜡块修整，使蜡块切面的边长为枣花花蕾直径的2～3倍，切面光滑平整。修蜡后进行切片，切片厚度为8μm，得到枣花切片蜡带。将得到的枣花切片蜡带的条带正面朝上按顺序平铺在洁净处。再用小镊子将蜡带放到温度为25℃的水中，蜡带平铺在水面上。在载玻片上涂上15μl粘片剂(粘片剂为：蛋清和甘油按1：1的体积比配制)，再滴加2滴蒸馏水。将平铺在水面上的切片蜡带转移至涂油粘片剂的载玻片上，在50℃下展片40min，得到负载在载玻片上的枣花切片。将负载在载玻片上的枣花切片用二甲苯浸泡15min，更换二甲苯再次浸泡13min，得到脱蜡的枣花切片。将得到的脱蜡枣花切片用复水剂(复水剂为：二甲苯和无水乙醇按1:1的体积比配制)浸泡10min，得到预复水枣花切片。将得到的预复水枣花切片依次采用无水乙醇和体积浓度为95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液各浸泡复水180s，再转入蒸馏水中浸泡180s，得到复水枣花切片。
将得到的复水枣花切片用质量浓度为4％的铁矾溶液浸泡10min，冲洗10min后，再用质量浓度为0.5％的苏木精染液染色25min，冲洗10min，再用饱和苦味酸溶液浸泡23min，冲洗8min，得到染色枣花切片。将得到的染色枣花切片用二甲苯浸湿，用擦镜纸吸去枣花切片周围及载玻片底面的二甲苯，向浸湿二甲苯的枣花切片上滴加15μl加拿大中性树胶，轻轻晃动载玻片使二甲苯和树胶充分混合，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的切片上，慢慢放下盖玻片并将空气排除，在38℃的烘箱中烘烤30min，得到枣花石蜡切片。将石蜡切片在400倍显微镜下进行观察，具体结果5号花蕾如图3所示，切片观察到花蕾胚珠倒生，可以判定此时处于胚珠倒生时期；6号花蕾如图7所示，切片观察到细胞核大，细胞质浓的大孢子母细胞，可以判定处于大孢子母细胞时期。由图3和图7可以看出，本发明制备得到的枣花石蜡切片组织结构清晰、完整，易于观察，能够观察到整个胚囊内部细胞和组织结构。
对照例1
从枣树枝条上剪取两个不同开花时间的枣花花蕾，分别为直径为1.42mm，颜色为绿黄色的枣花花蕾和直径为2.12mm，颜色为黄绿色的枣花花蕾，并依次标记为7和8号，采用现有技术中的石蜡切片的制作方法制作枣花石蜡切片，具体操作方法如下：
1固定：将枣花花蕾置于固定液(固定液为改良的faa：固定液为：体积浓度为38％甲醛：冰醋酸：体积浓度为50％乙醇＝1：1：18)中固定30h，置于滤纸上吸干固定液后，将花蕾分别置于对应等级标记的10ml离心管中进行下一级操作。
2脱水：按照50％酒精(1h)-60％酒精(1h)-70％酒精(1h)-80％酒精(1h)-90％酒精(1h)-95％酒精(1h)-100％酒精(1h)-100％酒精(1h)的顺序和时间进行脱水。
3透明:按照1/2二甲苯+1/2无水乙醇(1.5h)-纯二甲苯(2h)-纯二甲苯(2h)的顺序和时间进行透明处理(所述1/2二甲苯+1/2无水乙醇为体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇的混合液)。
4浸蜡：透明后的材料置于1/2二甲苯+1/2纯腊中，在38℃～40℃恒温烘箱中放置36h后，按照每次增加3℃的梯度逐步升温到60℃后保持2h，然后将材料两次换置于纯腊中，每次1.5h。
5包埋：恒温水浴锅温度设置为55℃，选择一块表面光滑平整的玻璃板置于水浴锅上，将提前准备好的牛皮纸折叠而成的小方盒置于玻璃板上，小盒上提前标记好与不同直径大小的材料分别对应的编号，以方便后续的统计；同时准备一枚在酒精灯上烘烤加热的解剖针；包埋时，从恒温烘箱中迅速的拿出浸蜡的小烧杯，将石蜡和材料一起倒入小方盒中，2～3s待材料沉入盒底后，用解剖针将材料均匀的排列在纸盒中，待石蜡凝固后，放置于通风处，1～2天后可进行修蜡及切片。
6修蜡：将牛皮纸做成的盒子与包埋材料的石蜡块分开后，根据材料的大小和实际切片的要求，将石蜡块分割成方形的小块。
7切片：将包埋有材料的方形小块石蜡固定在切片机上后快速的进行切片，切片厚度为8μm。
8粘片及烘干：将事先涂抹有粘片剂的载玻片准备好，在其上面滴上2～3滴水，将水滴均匀的分散到载玻片上，根据载玻片的长度将切好的材料分成适宜的长度，依次在载玻片上展平，置于55℃下烘干30min。
9染色：材料经二甲苯脱蜡后，依次置于无水乙醇和体积浓度为95％、85％、75％、65％、50％和30％的乙醇水溶液浸泡复水，每个梯度浓度酒精中浸泡的时间为3～5min，再转入蒸馏水中浸泡3～5min。得到复水枣花切片；将得到的复水切片置于体积浓度为4％铁矾溶液中浸泡10min，后用流水冲洗10min；再置于0.5％的苏木精染液中浸泡10min，继续流水冲洗5min，最后置于4％铁矾溶液分色10～20min(浸泡过程中镜检确定分色程度)，结束后用自来水冲洗10～15min至材料返蓝。
10镜检：染色结束后，将载玻片在二甲苯中沾湿，用擦镜纸擦去载玻片底部和周围多余的二甲苯，在载玻片中央滴入一滴加拿大中性树胶，轻轻晃动玻片使树胶和二甲苯充分混合，从载玻片一端请放上盖玻片，然后置于38℃的烘箱中烘干，得到冬枣花朵组织的永久切片，可随时在显微镜下进行观察。
将石蜡切片在400倍显微镜下进行观察，具体结果如图4、8所示，由图4和8可以看出，采用现有技术制备得到的枣花石蜡切片图片模糊，不易于观察。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。