本发明涉及一种生物素的检测方法，尤其涉及一种可快速、准确、灵敏的检测生物素的方法，属于生物传感领域。
背景技术
生物素作为b族类维生素，参与机体的多种新陈代谢活动，被广泛应用于食品、医药、饲料、发酵等领域，对工农业生产和人们的日常生活产生了重要的影响。通过检测生物素的含量可以对有关生物素的工农业生产加以指导，实现产品的最优化，维护人们的健康。目前，国内外关于生物素的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法、酶联免疫分析法、光谱法和电化学法等。然而，微生物法准确度差且整个操作流程费时、费力；高效液相色谱法所需仪器和试剂昂贵且样品处理过程较为复杂，对研究人员的技术要求较高；基于生物素和亲和素特异性结合的酶联免疫法和光谱法虽然操作简单、分析速度快且准确度高，但是这类方法所用的试剂亲和素或链霉亲和素市场造价较高，难以在生产上进行推广应用。因此，研发一种便宜、简单、快速、准确、灵敏的生物素检测方法具有重要的意义。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明提供了一种快速、准确、灵敏且成本低的生物素的检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种生物素的检测方法，包括以下步骤：
一种生物素的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.取0.1～2ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，再加入标准生物素形成不同浓度的标准生物素溶液，混合均匀后加入比色皿中，记录不同浓度的标准生物素溶液在267nm波长处的吸光度值，以267nm波长处吸光度a的变化值和生物素的浓度绘制标准曲线；
b.取0.1～2ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，再加入待检测的生物素样品，混合均匀后加入比色皿中，记录267nm波长处的吸光度，通过标准工作曲线，计算得到待检测的生物素样品的浓度。
或者：包括以下步骤：
a.取0.1～2ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，混合均匀后加入比色皿中，得到500～200nm波长范围的吸收光谱，作为基线；
b.取0.1～2ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，再加入标准生物素形成不同浓度的标准生物素溶液，混合均匀后加入比色皿中，得到不同浓度的生物素的吸收光谱；
c.记录不同浓度的标准生物素溶液在267nm波长处的吸光度值，以267nm波长处吸光度a的变化值和生物素的浓度绘制标准曲线；
d.取0.1～2ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，再加入待检测的生物素样品，混合均匀后加入比色皿中，得到500～200nm波长范围的吸收光谱，记录267nm波长处的吸光度，通过标准工作曲线，常规方法计算得到待检测的生物素样品的浓度。
所述的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，是由氯金酸和阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(ctab)反应得到的：取10～1000mg的ctab，加水50ml，加热搅拌溶解后，室温条件下加入浓度为0.01～5mg/l的氯金酸溶液，搅拌0.5～10小时，即可得到橘黄色的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物。
本发明的生物素的检测方法，其检测原理为：氯金酸与十六烷基三甲基溴化铵可形成ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入生物素样品可替代aucl4-的结合，形成ch3(ch2)15(ch3)3n-生物素，从而导致吸光光谱发生改变，吸光度发生改变。利用紫外可见分光光度计测定加入不同浓度生物素后吸光度的变化值(267nm波长处的吸光度值)，以267nm波长处的吸光度a的变化值对生物素的浓度c绘制标准工作曲线，对照标准工作曲线即得未知样品中生物素的浓度。
本发明的生物素的检测方法，具有以下优点：
1.本发明直接利用氯金酸和ctab的复合物，无需复杂的合成工艺，因此操作简单，误差较小。
2.本发明无需借助亲和素或链霉亲和素等价格昂贵的试剂，大大节约了检测成本。
3.本发明不需要昂贵的分析仪器，方法简单，检测速度快，灵敏度高，线性范围宽。
4.本发明利用紫外区间的光谱进行分析，避免了因发酵液本身颜色而产生的干扰。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：含有不同量ctab的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物的吸收光谱。
图2：不同浓度生物素的响应曲线。
图3：生物素的标准工作曲线(左图为低浓度范围的，右图为高浓度范围的)。
图4：本发明的检测方法的选择性测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1测试缓冲溶液中生物素的浓度
测定步骤如下：
a.以ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物为识别分子，0.01m的pbs为缓冲溶液，紫外可见分光光度计记录吸收光谱。取0.5ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，混合均匀后加入比色皿中，得到500～200nm波长范围的吸收光谱(如图1所示)，记录267nm波长处的吸光度，作为基线。
ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物的制备过程：取50mg的ctab，加水50ml，加热搅拌溶解后，室温条件下加入0.1mg/l的氯金酸溶液，搅拌1小时，即可得到橘黄色的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物。
b.取0.5ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，再加入生物素得到不同浓度的标准生物素溶液(5～400μg/l)，混合均匀后加入比色皿中，得到不同浓度生物素的吸收光谱，如图2所示。
c.分别记录267nm波长处的吸光度值，以267nm波长处吸光度a的变化值和生物素的浓度绘制标准曲线，如图3所示。标准曲线也可以根据步骤a和步骤b的曲线的计算出来。
性能测试：测定该方法对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、钠离子、钾离子、镁离子、氯离子等的干扰。
取0.5ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，再分别加入生物素、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、钠离子、钾离子、镁离子、氯离子，使其最终浓度均为100μg/l，混合均匀后分别加入比色皿中，得到这些待测物的吸收光谱，如图4所示。从图4可以看出100μg/l的生物素在267nm处的吸光度较大，而葡萄糖、乳糖、麦芽糖等在267nm处的吸光度很小，可以忽略，因此这些离子不会对生物素检测产生影响，说明该方法具有较好的选择性，因此本法有望应用于发酵液或细胞液中生物素的检测。
实施例2
采用标准加入法测定一低浓度未知样品中生物素的量。取0.01mpbs缓冲溶液配置了两个加标试样，浓度分别为20μg/l和200μg/l，依照实施例1的测定方法，记录267nm波长处的吸光度值a，对照标准工作曲线(如图3)，计算出相应的浓度。
实施例3测试饲料中生物素的含量
测定步骤如下：
a.取1g某饲料，溶于100ml0.01m的pbs缓冲溶液中，过滤除去不溶物。
b.取0.5ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，再加入含有生物素的饲料样品，混合均匀后加入比色皿中，得到500～200nm波长范围的吸收光谱，记录267nm波长处的吸光度，通过样品溶液267nm波长处的吸光度a，对照标准工作曲线，得到待测饲料中生物素的含量。
实施例4测试发酵液中生物素的含量
测定步骤如下：
a.取某发酵液，加0.01m的pbs缓冲溶液稀释10倍，过滤除去不溶物，放置待测。
b.取0.5ml的ch3(ch2)15(ch3)3n-aucl4复合物，加入到3ml0.01m的pbs缓冲溶液中，再加入含有生物素的样品，混合均匀后加入比色皿中，得到500～200nm波长范围的吸收光谱，记录267nm波长处的吸光度，通过样品溶液267nm波长处的吸光度a和背景溶液267nm波长处吸光度a的差值与标准工作曲线对照，得到发酵液中生物素的含量。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。