本发明涉及食品检测领域，具体关于一种应用琼脂基重金属吸附剂的甲硝唑测定方法。
背景技术
鸡蛋是一种廉价的优质动物性食品，已经成为大众的生活必需品。一方面说明我国蛋鸡饲养业的发展速度快，在蛋鸡养殖和鸡蛋产品监控中，甲硝唑是一个重要的监控项目。
cn106483183a提供一种甲硝唑的检测方法，属于甲硝唑的检测技术领域。本发明是将氨基功能化mcm-41采用滴涂到玻碳电极的方式制备成氨基功能化mcm-41修饰电极，利用三电极系统,采用方波伏安法检测甲硝唑。结果表明，氨基功能化mcm-41修饰电极差分脉冲伏安法检测不同浓度甲硝唑，峰电流随甲硝唑溶液浓度的增加而不断增大，甲硝唑的峰电流与甲硝唑浓度呈现良好的线性关系。
102645501a涉及一种加压毛细管电色谱仪检测对虾中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑残留的方法，步骤：样品制备；配制氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑标准溶液；采用加压毛细管电色谱进行分析：以反相键和c18为填料的毛细管电色谱柱作为检测柱；流动相采用11～13mmol/l，ph＝4～6的磷酸盐氢二胺缓冲液与乙腈的混合液，其体积比为90～70∶10～30；所加电压为-3～-5kv，柱压为9.6～9.8mp，柱温为常温，流动相的流速：40～60μl/min；进样量：0.9～1.1μl的工艺条件下，用紫外检测器在波长275nm处进行检测，同时绘制标准曲线；将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。本发明高效、准确，有机试剂消耗少，有较高的灵敏度，可以满足日常检测氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑药物的需求。
cn101571526b涉及蜂王浆中硝基咪唑类药物残留量的方法，尤其涉及采用液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑、二甲硝咪唑、洛硝哒唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑和异丙硝唑等硝基咪唑类药物残留量的方法。同时测定蜂王浆中多种硝基咪唑类药物残留量的检测方法，本发明采用甲醇沉淀蛋白，提取，再采用hlb固相萃取小柱和c18固相萃取小柱净化，采用色谱-质谱/质谱仪测定。本发明具有专属性强、灵敏度高、结果准确的特点，不仅测定硝基咪唑原药还包括一些代谢产物，方法的测定低限10μg/kg，测定低限满足目前国内外对蜂王浆中硝基咪唑类药物残留量的要求。回收率范围为70.7％～105.0％；相对标准偏差小于12.7％。
现在标准方法是质谱法，但投资较大，不便于推广；在食品安全觉检测领域中，酶联免疫（elisa）是一种重要的快速检测方法，它是利用特征反应来检测食品中的药物残留，它比试纸法可以达到更高的灵敏度，又无需质谱那样购置昂贵的检测仪器。市埸上推出众多的专业测试的试剂盒。但市埸上的试剂盒考虑商业推广的问题，是针对多种原料的，非专用性的。而实际不同食品原料因成分和结构上的差异，经过针对性改良后才能达到理想效果。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种应用琼脂基重金属吸附剂的甲硝唑测定方法。
一种应用琼脂基重金属吸附剂的甲硝唑测定方法，其技术方案如下：
步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1ml1x样品提取液，然后加入0.1-0.5ml中性蛋白酶酶液(1.0%-1.5%)，先在40-50℃水浴30-50min，然后在85-95℃水浴处理5-10min；
步骤二、向处理好的样品加入3.5-5.5ml的乙腈和0.15-0.35g的重金属吸附材料，初步混匀，然后用高速匀浆机，于9000-10000rpm下匀浆40-60s；然后在20-25℃，使用3500-4000r/min的转速离心250-300s；
步骤三、移取2ml上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.3-0.7ml样品稀释液和0.8-1.2ml正己烷溶解干燥物，最大速涡流40-60s，溶解均匀；然后在20-25℃，使用3500-4000r/min的转速离心250-300s；弃去上层正己烷，取50μl下层液作检测；
步骤四、分别加入50μl的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μl1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀40-60s；然后在20-25℃避光孵育45min；
步骤五、洗板3次，每次加入250μl1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入tmb底物100μl，轻敲微孔板边缘混匀40-60s，在20-25℃避光孵育30min，加入100μl的终止液终止反应；
步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读od值。
步骤二所述的初步混匀的方法为使用最大速涡流2-6min或者用振荡器振荡8-15min；
步骤三所述的除去样品溶剂的方法为在60-70℃水浴减压旋转蒸发干燥或60-70℃水浴氮气吹干；
所述的琼脂基重金属吸附剂按照以下方案制备：
所述重金属吸附材料的制备方法为：
按重量份计，在搅拌釜中加入硼酸琼脂糖层析介质100份，0.5-2份椰油酰水解玉米蛋白钾，0.5-2份菜油酰胺丙基环氧丙基二甲基氯化铵，0.5-2份蓖麻醇酸酰胺丙基甜菜碱，200-300份米糠酸，50-100份红花油酸，50-100份大豆油酸，0.5-2份膦酰基-吡哆亚基绕丹宁钠，1000-4000份水；升温至50-80℃进行反应；保温15-40h，再加入0.5-2份聚氧亚甲基蜜胺脲，0.5-2份硬脂基羟乙基咪唑啉氮鎓氯化物，50-80℃保温3-7h，再经过滤，水洗，干燥，得到琼脂基重金属吸附剂。
所述的ph值调节剂为10%-20%的甲酸溶液。
本发明方法公开的一种应用琼脂基重金属吸附剂的甲硝唑测定方法，本发明是针对鸡蛋这个体系，利用市售的试剂盒检测鸡蛋的甲硝唑含量，其特征在于：本方法增加酶解操作和匀浆机一个装置，并使用一种琼脂基重金属吸附剂对残留的重金属进行吸附，减小重金属对检测的影响。在对操作修改后，可以在鸡蛋检测时实现超出原测试灵敏度的结果，实现与质谱相近的检测限，通过样品处理过程的针对性改变，可以提高测试的灵敏度和重现性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对该发明作进一步说明：
实施例1
一种应用琼脂基重金属吸附剂的甲硝唑测定方法，其技术方案如下：
步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1ml1x样品提取液，然后加入0.3ml中性蛋白酶酶液(1.3%)，先在45℃水浴40min，然后在90℃水浴处理8min；
步骤二、向处理好的样品加入4.5ml的乙腈和0.25g的琼脂基重金属吸附剂，初步混匀，然后用高速匀浆机，于9500rpm下匀浆50s；然后在23℃，使用3800r/min的转速离心280s；
步骤三、移取2ml上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.5ml样品稀释液和1ml正己烷溶解干燥物，最大速涡流50s，溶解均匀；然后在23℃，使用3800r/min的转速离心280s；弃去上层正己烷，取50μl下层液作检测；
步骤四、分别加入50μl的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μl1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀50s；然后在23℃避光孵育45min；
步骤五、洗板3次，每次加入250μl1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入tmb底物100μl，轻敲微孔板边缘混匀50s，在23℃避光孵育30min，加入100μl的终止液终止反应；
步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读od值。
步骤二所述的初步混匀的方法为使用最大速涡流4min；
步骤三所述的除去样品溶剂的方法为在65℃水浴减压旋转蒸发干燥；
所述的琼脂基重金属吸附剂按照以下方案制备：
按重量份计，在搅拌釜中加入硼酸琼脂糖层析介质100份，1份椰油酰水解玉米蛋白钾，1份菜油酰胺丙基环氧丙基二甲基氯化铵，1份蓖麻醇酸酰胺丙基甜菜碱，229份米糠酸，78份红花油酸，65份大豆油酸，1份膦酰基-吡哆亚基绕丹宁钠，3000份水；升温至60℃进行反应；保温20h，再加入1份聚氧亚甲基蜜胺脲，1份硬脂基羟乙基咪唑啉氮鎓氯化物，60℃保温4h，再经过滤，水洗，干燥，得到琼脂基重金属吸附剂。
所述的ph值调节剂为15%的甲酸溶液。
实施例2
一种应用琼脂基重金属吸附剂的甲硝唑测定方法，其技术方案如下：
步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1ml1x样品提取液，然后加入0.1ml中性蛋白酶酶液(1.0%)，先在40℃水浴30min，然后在85℃水浴处理5min；
步骤二、向处理好的样品加入3.5ml的乙腈和0.15g的琼脂基重金属吸附剂，初步混匀，然后用高速匀浆机，于9000rpm下匀浆40s；然后在20℃，使用3500r/min的转速离心250s；
步骤三、移取2ml上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.3ml样品稀释液和0.8ml正己烷溶解干燥物，最大速涡流40s，溶解均匀；然后在20℃，使用3500r/min的转速离心250s；弃去上层正己烷，取50μl下层液作检测；
步骤四、分别加入50μl的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μl1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀40s；然后在20℃避光孵育45min；
步骤五、洗板3次，每次加入250μl1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入tmb底物100μl，轻敲微孔板边缘混匀40s，在20℃避光孵育30min，加入100μl的终止液终止反应；
步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读od值。
步骤二所述的初步混匀的方法为使用最大速涡流2min；
步骤三所述的除去样品溶剂的方法为在60℃水浴氮气吹干；
所述的琼脂基重金属吸附剂按照以下方案制备：
按重量份计，在搅拌釜中加入硼酸琼脂糖层析介质100份，0.5份椰油酰水解玉米蛋白钾，0.5份菜油酰胺丙基环氧丙基二甲基氯化铵，0.5份蓖麻醇酸酰胺丙基甜菜碱，200份米糠酸，50份红花油酸，50份大豆油酸，0.5份膦酰基-吡哆亚基绕丹宁钠，1000份水；升温至50℃进行反应；保温15h，再加入0.5份聚氧亚甲基蜜胺脲，0.5份硬脂基羟乙基咪唑啉氮鎓氯化物，50℃保温3h，再经过滤，水洗，干燥，得到琼脂基重金属吸附剂。
所述的ph值调节剂为10%的甲酸溶液。
实施例3
一种应用琼脂基重金属吸附剂的甲硝唑测定方法，其技术方案如下：
步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1ml1x样品提取液，然后加入0.5ml中性蛋白酶酶液(1.0%-1.5%)，先在50℃水浴30-50min，然后在95℃水浴处理10min；
步骤二、向处理好的样品加入5.5ml的乙腈和0.35g的琼脂基重金属吸附剂，初步混匀，然后用高速匀浆机，于10000rpm下匀浆60s；然后在25℃，使用4000r/min的转速离心300s；
步骤三、移取2ml上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.7ml样品稀释液和0.8-1.2ml正己烷溶解干燥物，最大速涡流60s，溶解均匀；然后在25℃，使用4000r/min的转速离心300s；弃去上层正己烷，取50μl下层液作检测；
步骤四、分别加入50μl的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μl1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀60s；然后在25℃避光孵育45min；
步骤五、洗板3次，每次加入250μl1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入tmb底物100μl，轻敲微孔板边缘混匀60s，在25℃避光孵育30min，加入100μl的终止液终止反应；
步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读od值。
步骤二所述的初步混匀的方法为使用振荡器振荡15min；
步骤三所述的除去样品溶剂的方法为在70℃水浴氮气吹干；
所述的琼脂基重金属吸附剂按照以下方案制备：
按重量份计，在搅拌釜中加入硼酸琼脂糖层析介质100份，2份椰油酰水解玉米蛋白钾，2份菜油酰胺丙基环氧丙基二甲基氯化铵，2份蓖麻醇酸酰胺丙基甜菜碱，300份米糠酸，100份红花油酸，100份大豆油酸，2份膦酰基-吡哆亚基绕丹宁钠，4000份水；升温至80℃进行反应；保温40h，再加入2份聚氧亚甲基蜜胺脲，2份硬脂基羟乙基咪唑啉氮鎓氯化物，80℃保温7h，再经过滤，水洗，干燥，得到重金属吸附材料。
所述的ph值调节剂为20%的甲酸溶液。
对比例1
不加琼脂基重金属吸附剂，其它同实施例1。
对比例2
不加椰油酰水解玉米蛋白钾，其它同实施例1。
对比例3
不加菜油酰胺丙基环氧丙基二甲基氯化铵，其它同实施例1。
对比例4
不加蓖麻醇酸酰胺丙基甜菜碱，其它同实施例1。
对比例5
不加膦酰基-吡哆亚基绕丹宁钠，其它同实施例1。
对比例6
不加硬脂基羟乙基咪唑啉氮鎓氯化物，其它同实施例1。
表：不同工艺的检测方法的效果比较。