一种掺杂石墨烯的酶生物传感器及其制备与在检测苯酚中的应用的制作方法

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种掺杂石墨烯的酶生物传感器及其制备方法与在检测苯酚中的应用。

背景技术

酚类化合物是指芳香烃中苯环上的h被-oh取代的化合物。苯酚属于一种单元酚，具有特殊气味的无色针状晶体，有毒，熔点43℃，常温下微溶于水，易溶于有机溶剂，当温度高于65℃时，能跟水以任意比例互溶。苯酚有腐蚀性，接触后会使局部蛋白质变性。苯酚难挥发，可长期存在于在土壤及水环境中而对环境造成严重污染。当水中酚类物质含量达到0.1002mg/l时，在水体加氯处理过程中会产生酚臭，影响引用水源水质问题；浓度大于0.1005mg/l时，就不可以作为饮用水；浓度大于0.11mg/l时，水中的鱼肉就会有臭味而不能食用；浓度大于lmg/l时，会对鱼类的生殖等项活动造成严重影响；而当水中酚类含量大于10mg/l时，鱼类等水生生物不能生存。另外，酚的毒性能大大抑制水中微生物(如藻类、细菌、软体动物等)的生长速度，影响水的生态平衡。含酚高于100mg/l的废水直接灌溉农田，会造成农作物枯死和减产。

由于酚类污染物对土壤及水环境具有极大的危害作用，因此，不断探索简便、快速、精确的检测方法的需求也变得日益迫切。目前，环境中酚类污染物的检测方法主要有色谱法，光谱法，免疫法，电化学检测法。但是这些检测方法中的选择性大多依赖于对苯酚特异性识别的酶或抗体，并具有损坏性和成本相当昂贵。因此，针对水及土壤酚类的污染，设计出简单、高选择性、低成本、快速和高灵敏的苯酚检测方法仍然极具临床意义。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的掺杂石墨烯的酶生物传感器。

本发明的另一目的在于提供上述掺杂石墨烯的酶生物传感器的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述掺杂石墨烯的酶生物传感器在苯酚检测中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种掺杂石墨烯的酶生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由掺杂石墨烯复合材料、多酚氧化酶、牛血清白蛋白以及戊二醛制备而成。

所述掺杂石墨烯复合材料：多酚氧化酶：牛血清白蛋白：戊二醛的质量比为(2.5～12.5)mg：(15～35)mg：(2.5～7.5)mg：(0.005～0.018)mg。

所述掺杂石墨烯复合材料通过以下方法制备得到：

(a)在水中，将氧化石墨烯与苯胺混匀；在氧化剂的作用下酸性介质中，苯胺在氧化石墨烯表面发生聚合反应，得到聚苯胺-氧化石墨烯复合物；

(b)将聚苯胺-氧化石墨烯复合物进行煅烧，获得氮掺杂石墨烯复合材料即掺杂石墨烯复合材料。

所述氧化石墨烯与苯胺的质量体积比为(50～200)mg：0.5ml；

所述氧化剂为过硫酸铵，所述酸性介质为盐酸，所述氧化剂与酸性介质的摩尔比为(2～2.5)：1，苯胺与酸性介质的体积比为1:(10～20)；酸性介质以水溶液的形式加入，酸性介质的浓度为0.5mol/l；所述聚合反应的温度为4～10℃，聚合反应的时间为6～12h；

所述煅烧的氛围为保护性氛围，所述保护性氛围为氮气或惰性气氛，所述煅烧是指先在400～500℃下煅烧，后在700～800℃继续煅烧；所述煅烧的时间为1.5～2.5小时，所述继续煅烧的时间为0.5～1.5小时。

步骤(a)的具体步骤为将氧化石墨烯在水中超声剥离，加入苯胺超声分散均匀；然后低温下，加入氧化剂与酸性介质的混合物，反应，获得聚苯胺-氧化石墨烯复合物。所述氧化石墨烯与水的质量体积比为50～200mg：50ml，超声剥离的时间为1～4h，反应的时间为6～12小时。

反应完成后，去除水分，真空干燥，研磨，得到聚苯胺-氧化石墨烯复合物。

上述掺杂石墨烯的酶生物传感器的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)对基底电极进行表面预处理；

(2)将掺杂石墨烯复合材料分散在水中，获得掺杂石墨烯复合材料分散液；将掺杂石墨烯复合材料分散液滴加到基底电极的表面，晾干或烘干；

(3)采用pbs溶液将多酚氧化酶配置成溶液，获得多酚氧化酶溶液；然后滴加到步骤(2)的电极表面，室温晾干；

(4)采用pbs溶液将牛血清白蛋白配置成溶液，获得牛血清白蛋白溶液；将牛血清白蛋白溶液与戊二醛水溶液混匀，获得混合溶液；然后滴加到步骤(3)的电极表面，室温晾干，得到掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(5)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到掺杂石墨烯的酶生物传感器。

步骤(2)中烘干的温度为60～80℃；

步骤(1)中所述的表面预处理过程如下：将基底电极的表面依次用直径为0.3μm和0.05μm的al2o3粉末抛光成镜面，再用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中超声清洗，取出用水洗净，晾干，然后置于铁氰化钾溶液中(5mmol/lk3fe(cn)6+0.2mol/lkcl)进行电极活化处理。

步骤(2)中所述掺杂石墨烯复合材料分散液的浓度为2.5～12.5mg/ml。

步骤(3)中所述多酚氧化酶溶液的浓度为15～35mg/ml；酶溶液是采用pbs溶液配制，pbs溶液的ph为6.5，浓度为0.1m。

步骤(4)中所述牛血清蛋白溶液的浓度5～15mg/ml，牛血清蛋白溶液是采用pbs溶液配制的，pbs溶液的ph为6.5，浓度为0.1m。

步骤(4)中所述戊二醛水溶液的浓度1.0～3.5wt％；戊二醛溶液是经过25wt％戊二醛溶液用水稀释得到的。

步骤(4)中所述掺杂牛血清蛋白溶液和戊二醛水溶液的体积比为1:1。

步骤(2)(3)(4)中所述掺杂石墨烯复合材料分散液：多酚氧化酶溶液：混合溶液滴加量的体积比为1:1:1。

上述掺杂石墨烯的酶生物传感器在苯酚检测中的应用，特别是定量检测。

本发明的原理：

本发明制备的掺杂石墨烯复合材料借助不同组分的协同作用克服了石墨烯本身卷曲、层间堆叠和溶剂中分散性差的不足，然后，利用全戊二醛对酶的交联，以及牛血清蛋白对酶的稳定性作用，并利用掺杂石墨烯的载体特性，有利于增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，利于对底物的催化；本发明将各材料一步一步滴于已表面预处理的工作电极上，得到修饰后的工作电极；再利用所述的修饰后的工作电极，配合参比电极与对电极组成三电极体系，制得检测苯酚的酶生物传感器。

本发明将掺杂石墨烯复合材料应用于酶生物传感器，制备得到的检测苯酚的传感器检测性能良好，检测范围为2×10^-5～7.7×10^-4mol/l，线性方程为i(μa)＝-1.3-36.7c(mmol/l)，相关系数为r²＝0.993。检测限为1.21×10^-6mol/l(s/n＝3)，灵敏度为524.285mamol^-1cm^-2。

本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：

(1)本发明所述的检测苯酚的生物传感器具有良好的电子传递性，能将反应产生的电子进行良好的转移，能实现生物分子的选择性检测，提高所述生物传感器的反应速度。

(2)本发明所述的检测苯酚的生物传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性，可对苯酚进行准确检测，抗干扰能力强。

(3)本发明所述的检测苯酚的生物传感器可用于水中苯酚或水产品以及土壤中苯酚的检测，制备简单，具有较宽的检测范围，较低的检测限，反应在室温中性环境下进行，性能稳定，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例2中不同修饰工作电极在苯酚溶液中的循环伏安图；曲线a：掺杂石墨烯及牛血清蛋白-戊二醛混合溶液修饰的玻碳电极的循环伏安图(n-gn+bsa-ga)，曲线b为多酚氧化酶及牛血清蛋白-戊二醛混合溶液修饰的玻碳电极的循环伏安图(ppo+bsa-ga)，曲线c为掺杂石墨烯、多酚氧化酶及牛血清蛋白-戊二醛混合溶液的玻碳电极的循环伏安图(n-gn+ppo+bsa-ga)；

图2为实施例2中制备的掺杂石墨烯的酶生物传感器在滴加不同量苯酚后在磷酸缓冲溶液中的差示脉冲伏安图，图中方框内为磷酸缓冲溶液中苯酚的添加浓度；

图3为实施例2中制备的掺杂石墨烯的酶生物传感器对不同浓度苯酚的响应电流的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种基于掺杂石墨烯的苯酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的al2o3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10ml铁氰化钾溶液中(5mmol/lk3fe(cn)6+0.2mol/lkcl)在0～0.8v下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50ml去离子水后超声剥离4h(超声功率为100w)，加入0.5ml苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃)加入5ml含1.25g过硫酸铵(aps)的0.5mhcl，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分转入80℃真空干燥10h后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料(n-gn)；

(3)将掺杂石墨烯复合材料用水分散为浓度为2.5mg/ml的掺杂石墨烯复合材料溶液；采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为25mg/ml的多酚氧化酶(ppo))溶液(870u/mg，worthington)；采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为10mg/ml的牛血清蛋白(bsa)溶液，采用水稀释25wt％戊二醛溶液得到2.5wt％戊二醛(ga)溶液，将10mg/ml的牛血清蛋白溶液与2.5wt％戊二醛溶液等体积混合得到牛血清蛋白-戊二醛混合溶液；将10μl掺杂石墨烯复合材料溶液滴加到玻碳电极表面，60℃烘箱烘干，再滴加10μl多酚氧化酶溶液，在室温下晾干，最后滴加10μl牛血清蛋白-戊二醛混合溶液，在室温下晾干，得到掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(4)将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测苯酚的酶生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10ml磷酸缓冲溶液(0.1mol/l、ph6.5)中进行，测试之前通o2，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加苯酚溶液，测试稳定后加入250μl苯酚溶液。

本实施例的酶生物传感器在苯酚浓度为0.5mmol/l时，测试的还原化峰催化电流为14.99μa。

实施例2

一种掺杂石墨烯的苯酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的al2o3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10ml铁氰化钾溶液中(5mmol/lk3fe(cn)6+0.2mol/lkcl)在0～0.8v下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50ml去离子水后超声剥离4h(超声功率为100w)，加入0.5ml苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃左右)加入5ml含1.25g过硫酸铵(aps)的0.5mhcl，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分转入80℃真空干燥10h后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料用水分散为浓度为5mg/ml的掺杂石墨烯复合材料溶液，采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为25mg/ml的多酚氧化酶溶液，采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为10mg/ml的牛血清蛋白溶液，采用水稀释25wt％戊二醛溶液得到2.5wt％戊二醛溶液，将10mg/ml的牛血清蛋白溶液与2.5wt％戊二醛溶液等体积混合得到牛血清蛋白-戊二醛混合溶液；将10μl掺杂石墨烯复合材料溶液滴加到玻碳电极表面，60℃烘箱烘干，再滴加10μl多酚氧化酶溶液，在室温下晾干，最后滴加10μl牛血清蛋白-戊二醛混合溶液，在室温下晾干，得到掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(4)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测苯酚的酶生物传感器(即掺杂石墨烯的酶生物传感器)。

在室温下进行电化学试验，均在10ml磷酸缓冲溶液(0.1mol/l、ph6.5)中进行，测试之前通o2，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加苯酚溶液，测试稳定后滴加250μl苯酚溶液。

本实施例的酶生物传感器在苯酚浓度为0.5mmol/l时，测试的还原化峰催化电流为17.18μa。

将不同修饰工作电极在含苯酚的溶液中进行电化学测试，不同修饰工作电极在含苯酚的溶液中循环伏安图如图1所示。曲线a为掺杂石墨烯及牛血清蛋白-戊二醛混合溶液修饰的玻碳电极的循环伏安图(n-gn+bsa-ga)，曲线b为多酚氧化酶及牛血清蛋白-戊二醛混合溶液修饰的玻碳电极的循环伏安图(ppo+bsa-ga)，曲线c为掺杂石墨烯、多酚氧化酶及牛血清蛋白-戊二醛混合溶液的玻碳电极的循环伏安图(n-gn+ppo+bsa-ga)。从图1可知，电极修饰掺杂石墨烯对苯酚没有任何的催化作用，当电极修饰多酚氧化酶后出现了一个很明显的还原峰，当多酚氧化酶与掺杂石墨烯共同修饰电极时，还原电流明显提高。

本实施例制备的掺杂石墨烯的酶生物传感器在滴加不同浓度苯酚后在磷酸缓冲溶液(0.1mol/l、ph6.5)中的差示脉冲伏安图如图2所示。苯酚浓度为0.02mmo1/l、0.1mmo1/l、0.237mmo1/l、0.354mmo1/l、0.431mmo1/l、0.583mmo1/l、0.677mmo1/l、0.77mmo1/l。利用了掺杂石墨烯的载体特性，有利于增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，利于对底物的催化。

本实施例制备的掺杂石墨烯的酶生物传感器对不同浓度苯酚的响应电流的标准曲线图如图3所示。酶生物传感器中修饰电极对底物检测范围为2×10^-5～7.7×10^-4mol/l，线性方程为i(μa)＝-1.3-36.7c(mmol/l)(即-i(μa)＝1.3+36.7c(mmol/l))，相关系数为r²＝0.993。检测限为1.21×10^-6mol/l(s/n＝3)，灵敏度为524.285mamol^-1cm^-2。

实施例3

一种掺杂石墨烯的苯酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的al2o3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10ml铁氰化钾溶液中(5mmol/lk3fe(cn)6+0.2mol/lkcl)在0～0.8v下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50ml去离子水后超声剥离4h(超声功率为100w)，加入0.5ml苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃左右)加入5ml含1.25g过硫酸铵(aps)的0.5mhcl，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分转入80℃真空干燥10h后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料用水分散为浓度为7.5mg/ml的掺杂石墨烯复合材料溶液，采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为25mg/ml的多酚氧化酶溶液，采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为10mg/ml的牛血清蛋白溶液，采用水稀释25％戊二醛溶液得到2.5wt％戊二醛溶液，将10mg/ml的牛血清蛋白溶液与2.5wt％戊二醛溶液等体积混合得到牛血清蛋白-戊二醛混合溶液；将10μl掺杂石墨烯复合材料溶液滴加到玻碳电极表面，60℃烘箱烘干，再滴加10μl多酚氧化酶溶液，在室温下晾干，最后滴加10μl牛血清蛋白-戊二醛混合溶液，在室温下晾干，得到掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(4)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测苯酚的酶生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10ml磷酸缓冲溶液(0.1mol/l、ph6.5)中进行，测试之前通o2，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加苯酚溶液，测试稳定后滴加250μl苯酚溶液。

本实施例的酶生物传感器在苯酚浓度为0.5mmol/l时，测试的还原化峰催化电流为12.71μa。

实施例4

一种基于掺杂石墨烯的苯酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的al2o3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10ml铁氰化钾溶液中(5mmol/lk3fe(cn)6+0.2mol/lkcl)在0～0.8v下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50ml去离子水后超声剥离4h(超声功率为100w)，加入0.5ml苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃左右)加入5ml含1.25g过硫酸铵(aps)的0.5mhcl，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分转入80℃真空干燥10h后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料用水分散为浓度为10mg/ml的掺杂石墨烯复合材料溶液，采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为25mg/ml的多酚氧化酶溶液，采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为10mg/ml的牛血清蛋白溶液，采用水稀释25wt％戊二醛溶液得到2.5wt％戊二醛溶液，将10mg/ml的牛血清蛋白溶液与2.5wt％戊二醛溶液等体积混合得到牛血清蛋白-戊二醛混合溶液；将10μl掺杂石墨烯复合材料溶液滴加到玻碳电极表面，60℃烘箱烘干，再滴加10μl多酚氧化酶溶液，在室温下晾干，最后滴加10μl牛血清蛋白-戊二醛混合溶液，在室温下晾干，得到掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(4)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测苯酚的酶生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10ml磷酸缓冲溶液(0.1mol/l、ph6.5)中进行，测试之前通o2，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加苯酚溶液，测试稳定后滴加250μl苯酚溶液。

本实施例的酶生物传感器在苯酚浓度为0.5mmol/l时，测试的还原化峰催化电流为9.772μa。

实施例5

一种基于掺杂石墨烯的苯酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的al2o3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10ml铁氰化钾溶液中(5mmol/lk3fe(cn)6+0.2mol/lkcl)在0～0.8v下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50ml去离子水后超声剥离4h(超声功率为100w)，加入0.5ml苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃左右)加入5ml含1.25g过硫酸铵(aps)的0.5mhcl，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分转入80℃真空干燥10h后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料用水分散为浓度为12.5mg/ml的掺杂石墨烯复合材料溶液，采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为25mg/ml的多酚氧化酶溶液，采用pbs溶液(0.1mol/l、ph6.5)配制浓度为10mg/ml的牛血清蛋白溶液，采用水稀释25wt％戊二醛溶液得到2.5wt％戊二醛溶液，将10mg/ml的牛血清蛋白溶液与2.5wt％戊二醛溶液等体积混合得到牛血清蛋白-戊二醛混合溶液。将10μl掺杂石墨烯复合材料溶液滴加到电极表面，60℃烘箱烘干，再滴加10μl多酚氧化酶溶液，在室温下晾干，最后滴加10μl牛血清蛋白-戊二醛混合溶液，在室温下晾干，得到掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(4)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测苯酚的酶生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10ml磷酸缓冲溶液(0.1mol/l、ph6.5)中进行，测试之前通o2，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加苯酚溶液，测试稳定后滴加250μl苯酚溶液。

本实施例的酶生物传感器在苯酚浓度为0.5mmol/l时，测试的还原化峰催化电流为8.409μa。

本发明中氧化石墨烯通过以下方法得到：

(a)清洗石墨粉：称取2.5～10g石墨粉于容器中，加入100ml蒸馏水，加入100ml浓盐酸，在60～80℃水浴中加热并搅拌2h，真空抽滤后，依次用蒸馏水、丙酮、乙醇清洗，清洗完毕后，放入真空干燥箱中100℃烘干，研磨成粉状备用；

(b)取清洗后的石墨粉，采用修正的hummers方法制备氧化石墨烯：

(b1)低温反应(0～4℃)：在冰水浴中，将110ml浓h2so4放入容器中，同时搅拌使其温度降至低温反应区间，然后依次加入已清洗好的2.5～10g石墨粉，2.5gnano3，15gkmno4，加完后计时，搅拌反应90min，溶液呈紫绿色；

(b2)中温反应(30～40℃)：将温度升高，在搅拌下使其温度保持在35℃左右，计时反应90min，溶液依然呈紫绿色；

(b3)高温反应(70～100℃)：中温反应后，向烧杯中缓慢加入220ml去离子水，然后加热将温度控制在85℃，随后缓慢加入一定量双氧水(5％约13ml)至溶液逐渐变成金黄色即可；

(b4)待该制备反应完毕后，趁反应液温热之时，将反应后的溶液用去离子水洗涤并过滤，并用转速为4000rpm的离心机反复离心再清洗过滤，直到滤液中检测不到so4^2-为止(用bacl2检验)；此时将所得到的黑色产物用去离子水超声清洗40min后，在40℃下干燥24h，即可得到黑棕色的氧化石墨烯。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。