全自动多肽提取飞行时间质谱检测仪的制作方法

本发明涉及体液蛋白提取以及质谱点样的自动化系统，结合磁珠法提取体液中的蛋白，实现质谱芯片点样的自动化操作，从而用来制备生物芯片，并通过质谱仪的激光采样，得到蛋白的质谱图以及相关信息，可用来制备生物芯片，因此属于蛋白检测领域。

背景技术：

随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(serialanalysisofgeneexpression，sage)等，都是从细胞中mrna的角度来考虑的，其前提是细胞中mrna的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从dnamrna蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(transcriptionalcontrol)，翻译水平调控(translationalcontrol)，翻译后水平调控(post-translationalcontrol)。从mrna角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mrna丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mrna水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。

传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1)生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2)多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3)在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学(proteomics)，它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。当前在国际蛋白质组研究技术中，通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。

质谱分析法主要是通过对样品的离子的质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。基本原理是将样品转化为运动的带电气态离子，于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录。质谱法是应用最为广泛的分析方法，它可以提供包括样品元素组成，无机、有机及生物分析的结构，复杂混合物的定量分析，固体表面结构和组成分析，样品中原子的同位素比。最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范围也在不断扩大，到20世纪50年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。现今，质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用，更为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。

近年来，以电喷雾质谱技术(eleetrosprayionization，esi)和基质辅助激光解吸附质谱技术(matrixassistedlaserdesortion/onizatio,maldi)为基础的生物质谱技术，它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使准确分析分子量高达几万到几十万的生物大分子(蛋白分子)成为可能，从而使大量的蛋白分子的快速分析成为现实。

电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol(10-12)甚至fmol(10-15)的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。

电喷雾质谱技术(esi)是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用(lc－ms)是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。

基质辅助激光解吸附质谱技术(maldi-tof)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。maldai所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有—一对应关系。maldi产生的离子常用飞行时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，tof检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此maldi-tof质谱很适合对蛋白质、多肽的研究。

然而，传统的体液全蛋白纯化提取是将样品加入到含有磁珠和化学试剂的管中，通过人工的混合以及洗涤、洗脱来制备。这种方法存在耗时长、效率低、通量低、一致性差，有可能有交叉污染等诸多缺点，无法有效的进行大规模，大批量的蛋白提取与纯化分析工作，逐渐难以满足快速、准确、大批量的蛋白提取和质谱的要求。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种大批量样本同时提取，且耗时少、效率高、一致性好、避免交叉污染的蛋白自动化提取系统。本发明的原理在于：采用电磁棒+磁棒套的模式，利用自动化机械臂完成蛋白提取动作，然后通过自动导轨分别将提取的核酸通过分液器分装到样品板上、以及通过移液器将样品板转移到芯片点样仪上，通过点样仪制备基因芯片，通过质谱仪的激光采样，得到蛋白的质谱图以及相关信息。

因此，出于实现快速、直接、连续的蛋白分析的研究目的，综合了磁珠法和电磁棒法提取分离蛋白、dna芯片的优点，本发明第一个目的是提供一种用于蛋白质谱分析样品的提取和质谱点样芯片的连续操作过程的自动化质谱仪，包括：

(1)蛋白提取纯化装置，包括：步进履带10，升降架--履带连接装置101，三维步进电机102，升降架移动滑杆103，磁棒升降架104，磁棒105，磁棒套升降架106，磁棒套107，样品板108，样品板固定台110，样品板固定台移动滑杆111；

其中，三维步进电机102安装在升降架—履带连接装置101上；磁棒升降架104及磁棒105安装在磁棒套升降架106及磁棒套107的正上方，以使得磁棒105能准确插入磁棒套108中；升降架移动滑杆103采用套管方式，磁棒升降架104安装在外管上，磁棒套升降架106安装在内管上，以使得磁棒105和磁棒套107在三维步进电机102的作用下能够前后左右上下运动并准确插入样品板固定台110上的样品板108样品孔中，以避免磁棒被样品污染和便于随时抽出磁棒，从而实现磁珠瞬间吸附和脱离磁棒套。

在一个实施方案中，所述样品板固定台还设有样品板固定夹109、样品板左卡位挡板113。其中，样品板固定台110的四个角上分别安装4个样品板固定夹109，用于把样品板108固定在样品板固定台110上；样品板卡位板113用于确定样品板固定台109的位置；样品板固定台左右移动滑杆111安装在三维步进履带10的正下方，且与样品板固定台110连接；样品板固定台左右移动电机112安装在样品板固定台卡位挡板113的左侧，用于将含有提取好的样品的样品板108移动到右侧通过移液分液设备进行分装。

在另一实施方案中，磁棒105采用电磁铁，断电后就失去磁性，更容易分离磁棒套107与磁珠。在具体实施方案中，磁棒105以及磁棒套107采用3行8列模式或6行12列模式(间距由样品板108孔间距确定)，可以同时最多处理24个样品；样品板108安装在样品板固定台110上，且在磁棒套108的正下方，以便磁棒套108准确地插入样品板108中。在优选的实施方案中，还可在滑杆111的最左边单独安装一个电机112，用于把含有提取好的样品的样品板108移动到右边移液分液装置2下方，以便移液分装。

(2)移液分液装置，包括移液器--履带连接装置201，三维步进电机202，升降架滑杆203，移液器204，样品收集板206；

其中，即三维步进电机202安装在移液器--履带连接装置201上，以带动升降滑杆203上下移动；移液器204安装在升降滑杆203上，样品板108通过样品板移动滑杆，在三维步进电机112的带动下，移动到移液器204的正下方，使得移液针头205准确插入样品板108中；样品收集架206固定在步进履带的正下方，以接受移液器204转移过来的样品。

在一个实施方案中，所述三维步进履带可以与蛋白提取装置(1)为相同的三维步进履带10。

在另一实施方案中，还设有用于固定收集板的样品收集板固定夹207。在一个具体实施方案中，其中所述移液针头205采用八连排模式，同时最多可以转移分装8个样品，且移液体积可以根据实际需要自由调节，并且步进履带10的正下方设有针头清洗槽32，其位于样品收集架的右侧，可通过超声进行清洗。在具体实施方案中，移液器204采用8行12列通道加样器，移液枪头205采用金属式滴液头。

(3)自动点样装置，包括三维步进履带301，三维步进履带10--三维步进履带301连接装置302，三维步进电机303，升降架滑杆304，升降架305，点样针306，

其中，三维步进履带301与三维步进履带10垂直固定安装在装置302上，升降架滑杆304安装在三维步进履带301上；升降架305安装在升降架滑杆304上；点样针306安装在升降架上，并且蛋白芯片307安装在三维步进履带10的正下方。

在一个实施方案中，在水平方向即x轴方向移动由步进电机303带动，并在步进履带10上已移动实现，前后方向即y轴方向移动由步进电机303控制实现，在竖直方向即z轴方向移动，由步进电机303带动实现。

在另一实施方案中，蛋白芯片307位于蛋白芯片固定槽308中，并通过蛋白芯片缺角卡位309及卡位槽308进行精确定位；点样针306采用4行3列形式排列(3*4排列)，并可通过清洗槽32进行清洗。

在上述任一实施方案中，所述质谱仪中的蛋白提取装置1、移液分液装置2和点样装置3分布在同一水平线上，且共用一套步进履带10，从而顺序完成样品分离、取样、点样以及点样针的清洗和干燥的自动化操作。

还在上述任一实施方案中，针头清洗装置与移液分液装置合用一套，即清洗槽32，包括酒精瓶321、用于容纳酒精的超声波清洗槽322、超纯水清洗槽323、废液槽324、干燥槽325。

还在上述任一实施方案中，样品板108采用96孔深孔板，样品收集板(206)优先选用384微孔板，磁棒套107、磁棒105规格与样品板108相配套，步进电机102带动磁棒升降架104和磁棒套升降架106，实现磁棒105与磁棒套107的结合与分离，并且产生震动，使样品混合均匀。

在一个具体实施方案中，三维步进电机(x、y、z方向)，带动磁棒升降架104以及磁棒套升降架106在x、y、z三个方向移动，从而实现样品的提取过程。在更具体的实施方案中，样品板108被固定在样品板固定架109上，且样品板固定架109下方连接在一个左右推进器110上，在步进电机112的带动下，将含有提取好的样品的样品板108移动到右侧移液分液装置2的下方。

另外在上述任一实施方案中，移液器204在步进电机(x、z方向两个电机)的带动下，将提取好的样品从样品板108转移分装到样品收集板206中，移液枪头205采用8道排枪，且与样品板108、样品收集板206相配套。在具体的实施方案中，清洗槽32包括两个酒精瓶321(浓度分别为100％和50％)，用于容纳酒精的超声波清洗槽322、超纯水清洗槽322，干燥室325，废液缸324。在更具体的实施方案中，清洗槽35还包括酒精泵，超纯水泵，排液泵等。

在上述任一实施方案中，点样针306采用3行4列方式排列或1行12列方式排列，优先选用金属式滴液头。步进电机(x、y、z方向3个)用于控制点样针306在x、y、z方向上移动，以准确定位并实现点样过程。

样品提取装置1、移液分液装置2和点样装置3，都由一个电脑主机控制，可以通过电脑上安装的管理软件，来编辑，设置若干个程序，配合样品的提取、分装与点样工作。

本发明第二个目的是提供使用上述自动化质谱仪，完成自动化提取蛋白、移液分配以及质谱检测的方法，步骤包括：

(1)蛋白提取纯化：将样品加到样品板孔中，并将磁棒105插入磁棒套107中，然而一起孔中搅动样品液，随后加入磁珠以结合蛋白，收集磁珠后，经过盐洗、三次洗涤、洗脱后，获得纯化的蛋白样品；

(2)蛋白移液分配：样品板108通过样品板移动滑杆，在三维步进电机112的带动下，移动到移液器204的正下方，使得移液针头205准确插入样品板108中吸取蛋白溶液，然后移液器204将蛋白溶液转移至固定在步进履带的正下方的样品收集架206中；

(3)质谱芯片点样：将点样针306进行清洗和干燥后，吸取样品收集架206上的样品液滴，而后在蛋白芯片307上进行点样，并进行质谱检测。

在另一个实施方案中，在不必进行提取纯化的情况下，将由其他方式提取出来的样本，如核酸、微生物蛋白多肽等，加入到样品收集板206中，再由点样装置3完成芯片点样，进而实现质谱检测。

还在一个实施方案中，为了均匀分装液体，将待分装液体预先加到样品板108中，通过外接电脑主机控制分装体积等参数，由移液分液装置2完成液体分装工作。

附图说明：

图1：蛋白提取纯化装置、移液分液装置和自动点样装置侧视图；

图2：蛋白提取纯化装置、移液分液装置和自动点样装置立体图；

图3：蛋白提取纯化装置、移液分液装置和自动点样装置俯视图；

图4：蛋白提取纯化装置；

图5：磁棒、磁棒套及其升降架与样品板的实践操作图。

图6：移液分液装置；

图7：自动点样装置。

图8：清洗槽的内部结构放大图。

图9：点样针安装图。

图10：本发明自动化质谱仪检测结果图。

图11：已有质谱仪检测对照结果图。

技术效果

1、仪器中的蛋白提取纯化装置是在封闭环境中，从样品溶液中游离的蛋白分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，核酸等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(磁珠--蛋白质混合物)，再用洗脱液洗脱即得到纯净的蛋白质。该装置能减少蛋白质的感染和污染机率，降低耗材的浪费，提高效率，减少人工操作，提高提纯度，准确完成蛋白质提取，杜绝人为操作可能引起的污染，防止人员受到样品感染。

2、仪器中的蛋白质提取装置，可通过外部电脑主机的指令，在预设程序的控制下，对样品进行混合、磁珠转移、清洗，洗脱等操作，可得到纯净的蛋白质样品溶液且一次性处理大量样本大大提高了工作效率。

3、仪器中的蛋白质提取装置，在提取蛋白质的过程中每层96深孔板都有盖子覆盖且工作完全在玻璃罩中，这样防止了药品的交叉污染。运动装置完全采用螺线定位机制定位准确，使仪器的微小定量运动成为可能。

4、仪器中的移液分液装置，可通过外部电脑主机的指令，在预设程序的控制下，准确对样品进行转移和分装，还对移液枪头进行清洗干燥，既可减少操作人员的劳动强度，还避免了样品的交叉污染和人为操作带来的误差和外来污染。

5、仪器中的质谱点样装置，能够实现高精度控制点液体积，高净度控制点液质量，高效完成大批量的样品点样需求；同时，通过在电脑程序控制下完成样品的均匀分配，避免手工操作引起的体积误差和可能的外来污染，同时提高了点样的速度和效率。

6、本仪器通过合理的工程设计，将蛋白质提取纯化、样品分配和点样质谱三个独立实验过程巧妙地整合到一个操纵仪器中，实现无交叉感染，无菌的操作过程，整合后的仪器大大减轻了操作人员的劳动强度，减少了人工操作过程中的失误和感染，增强了蛋白芯片制备过程的安全性，有效性，加快了合适检测与分析的自动化进程，为分子生物学的研究提供了一种现代化的工具。

7、另外，整合后的仪器，各个装置安置合理，空间利用率高，且所有操作过程由软件控制，智能化设计，自动完成蛋白质的提取纯化过程，节省了实验人员的时间和精力，使蛋白质提取和质谱检测工作变得轻松、简便。

具体实施方式

下面结合附图和实施案例对本发明进一步说明。但以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

实施例一：体液中蛋白质样品的提取和移动分配过程(参见图4-6)

1、加试剂和样品

在1块96式深孔板中，依次加入样品--磁珠--结合液，样品--磁珠--结合液，样品--磁珠--结合液，洗涤液，洗涤液，洗涤液，洗涤液，洗涤液，洗涤液，洗脱液，洗脱液，洗脱液，并用封口膜将96式深孔板封好，并置于适度的环境中。其中所述磁珠、结合液、洗涤液、洗脱液均可使用已知的磁珠—蛋白质提取试剂盒中的试剂。

将已加好试剂的样品板按正确方位，固定在样品板固定台110上。

2、设置方法和参数

利用外置的电脑，设置好方法，取一个操作名称，如“提取--分液--点样”，设置好磁棒套插入深度，样品--磁珠--结合液混合时间，洗涤、洗脱时间和磁棒位置以及移动路径等，都设置好后保存方法，操作中选择该方法即可。

3、自动提取与纯化

待设置好所有参数，开始自动提取蛋白质。此时磁棒套升降架106开始向下移动，并插入样品中，产生震动以混合样品，然后磁棒升降架104上升，并离开液体，使混合的样品--磁珠静置、充分结合。然后，磁棒架104、磁棒套架106向下移动，磁棒105插入磁棒套107中，并同时插入样品中，收集磁珠--蛋白质颗粒。然后在水平步进电机112的带动下，依次在洗涤液1和洗涤液2中洗涤。洗涤过程中，磁棒105和磁棒套107分离，磁棒套107留在液体中，且微微震动，然后静置，使洗涤液与磁珠--蛋白质充分结合，进行第二次洗涤。待两次洗涤结束，磁棒105与磁棒套107结合，插入第二管洗涤液中，收集磁珠--蛋白质颗粒，并转移到洗脱液中，将蛋白质从磁珠上洗脱下来，在洗脱过程中，磁棒105先和磁棒套107分离，磁珠--蛋白质即和磁棒套107分离，磁棒套107在洗脱液中微微震动，使磁珠和蛋白质充分分离，之后磁棒105再插入磁棒套107中，一起插入洗脱液中，收集磁珠，提取过程完成。

4、提取液分装

在外置电脑程序的控制下，含有提取好的样品的样品板108在水平推进器114的推动下，移动到右侧移液器204的正下方，移液器204先在清洗装置32中，酒精槽321依次将100％酒精、50％酒精注入到超声波清洗槽中，以完成两次清晰过程，接着在干燥室325中干燥，然后移液器204移动到样品板108的上方，准确吸取预设好的样品及体积量，再移动到样品收集板206上方，准确打入预设好的孔中。完成一次移液分液循环。如此，将所有提取液转移分装到样品收集板206中。

实施例二：样品分装

1、准备工作

将待分装的样品加入样品收集板206中，安装在样品板固定台110上，并在步进电机112的带动下，移动到右侧卡位槽113位置。把样品收集板206固定在对应位置。

2、方法参数设置

在外置电脑程序中，取一个操作名称，如“样品分装”，然后设置所需分装样品所在孔位及对应在样品收集板中的孔位，分装体积，移液速度等参数，待设置好所有参数后，保存该方法，操作中选择该方法即可。

3、分装样品

选择对应的方法，开始分装样品。在外部计算机的控制下，移液器204移动到清洗装置32正上方，依次经过100％酒精、50％酒精以及超纯水的清洗，再在干燥室325中干燥(参见图8)，然后移动到样品板108的正上方，准确吸取样品后再移动到样品收集板206正上方，将样品打到相应的孔位中。完成一次分装循环，待分装完成后，用专用塑封膜封住样品收集板206。

实施例三：芯片样品点样(参看图7-9)

点样装置在外接电脑程序的控制下，先进行点样针306的清洗。点样仪3或点样装置3移动到清洗装置32正上方，先后经过100％酒精、50％酒精以及超纯水清洗，然后在干燥室325中干燥，之后移动到样品收集板206的正上方，准确吸取提取液及体积量，然后移动到芯片307正上方，将提取液准确点到设定靶位上。完成一次点样循环。如此，将所有需要点的提取液点到相应的靶位上。在室温条件下自然干燥，然后接着点基质。

将配置好的基质溶液，加入到基质板中，卸下样品收集板206，把基质板固定在样品收集板206的位置上。按照点样的步骤，把对应体积的基质覆盖到芯片上。完成点基质工作后，芯片307在室温条件下自然干燥，之后直接用于上机做质谱采集。

实施例四：质谱分析

经过点样装置的点样操作，经过处理的样本，按照预定的体积，滴定到质谱芯片上，此时，将芯片放置到质谱仪的进样口中，设置点样程序，开始点样。经过质谱仪分析，质谱结果如图10所示。

使用德国布鲁克公司的串联质谱系统(autoflexiiitof/tof)，进行质谱分析，检测结果如图11所示。此仪器主要是手动点样，操作耗费时间、并且易于污染。

由图10和对照图11所示，本发明的自动化仪器，所获得的质谱峰单一，无杂峰，与对照结果图相比，无明显差异，表明本发明的自动化质谱仪，能获得或超过手动操作的现有质谱仪的技术效果。