一种血细胞计数-血细胞分型同时检测仪及其制备方法与流程

本发明涉及生化检测仪器，特别涉及一种血细胞计数-血细胞分型同时检测仪及其制备方法。

背景技术：

血细胞的数量在临床疾病诊断具有重要意义；由于各种原因造成的血细胞生成与破坏的失常，都会引起血细胞在数量上或质量上的改变，从而导致疾病的发生。现存血细胞计数方法主要为血球计数板计数法和流式细胞仪计数法。血球计数板计数法须人眼计数，操作繁琐，耗时长，且可能由于血细胞分布不均造成读数误差；流式细胞仪计数法速度快，结果准确，但仪器昂贵。因此，急需开发出一种便捷的、准确度高的血细胞计数方法。

除血细胞计数外，血细胞分型鉴定在临床检测上也具有重要的意义；在输血反应、器官移植和某些疾病中起重要的作用。常见的血细胞主要含有三个种类，红细胞、白细胞和血小板；同类的血细胞表面具备不同分型的表面抗原，如红细胞表面的凝集素、白细胞表面的多种人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen,hla）和血小板表面的多种人类血小板抗原（humanplateletantigen,hpa）等。如果供血者与受血者血细胞表面抗原不相符，会产生很多不良后果，如溶血反应、免疫排斥、输血后紫癜等等。因此血细胞分型检测至关重要。目前临床血细胞分型鉴定一般通过血清学反应来检测，需要人工判断程度，操作繁琐，可能会误判，而且会对血细胞造成不可逆的损伤。此外，血液检测设备正向小型化、自动化方向发展，而现有方法无法很好地与微型检测设备结合，因此急需开发出一种血细胞分型的新型鉴定方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种血细胞计数-血细胞分型同时检测仪。该血细胞计数-血细胞分型同时检测仪通过设定有多通道可同时检测不同种类血细胞（包括红细胞、白细胞与血小板）上可能含有的多种分型表面抗原，包括红细胞表面的凝集原a与凝集原b，白细胞表面的hla-a、hla-b和hla-c，血小板表面的hpa-1b与hpa-5b；通过优选能够识别独特抗原决定簇的抗体，可以实现对对应的分型表面抗原的特异性结合，具有强特异性的特点；并根据抗原-抗体反应引起的特定波长下的吸光度变化实现不同种类血细胞的计数和同种血细胞的不同分型检测，提高了检测效率，实现多通道同时检测的高效性；此外，采用该血细胞计数-血细胞分型同时检测仪对血细胞进行计数-分型检测时，整个检测过程操作简单，只需要跟踪测试特定波长下吸光度值即可，一旦血液样本中血细胞上的抗原与共价连接于纳米结构上的抗体发生抗原-抗体反应，吸光度值就会发生变化，此时只需通过检测吸光度值就可以测出样本血细胞分型与血细胞数量。

本发明的目的还在于提供制备上述所述的一种血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种血细胞计数-血细胞分型同时检测仪，包括光源发生器、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片、光电模拟传感器、单片机和显示屏；所述光源发生器、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片以及光电模拟传感器按照检测光束路径固定；所述单片机与所述光电模拟传感器连接；所述单片机与所述显示屏连接。

优选的，所述具有金属纳米结构的生化传感检测芯片上含有抗血细胞表面抗原的抗体。

更优选的，所述抗血细胞表面抗原的抗体包括抗a凝集素抗体、抗b凝集素抗体、hla-a抗体、hla-b抗体、hla-c抗体、hpa-1b抗体与hpa-5b抗体中的一种以上。

更优选的，所述具有金属纳米结构的生化传感检测芯片包括芯片基底、金属纳米结构以及通道模具；所述金属纳米结构及通道模具均固定在芯片基底上；所述通道模具具有一个以上底部开通的凹槽，每一个凹槽对应一个光束通道，所述金属纳米结构位于所述通道模具的凹槽内；且位于所述通道模具的凹槽内的金属纳米结构的表面修饰附着有抗血细胞表面抗原的抗体。

具有金属纳米结构的生化传感检测芯片由带底部开通的凹槽的通道模具固定在具有金属纳米结构的芯片基底上形成，且通道模具的每一个凹槽对应一个光束通道，则每一个凹槽对应为一个微流控通道；位于凹槽内的金属纳米结构表面修饰附着有抗血细胞表面抗原的抗体，具体的，通道模具的各凹槽内可选择加入单一的一种或多种抗血细胞表面抗原的抗体，对位于通道模具的凹槽内的金属纳米结构进行抗体修饰，根据修饰附着的抗体种类形成不同的功能分区，捕获不同血细胞的分型，形成含有多个微流控通道的微流控芯片。

更进一步优选的，所述芯片基底选自包括石英玻片或透明塑料片。

更进一步优选的，所述金属纳米结构包括金属纳米颗粒沉积体或金属纳米阵列。

更进一步优选的，所述通道模具的材料选自包括聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)或聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate,pmma）。

优选的，所述金属纳米结构的材料选自包括金、镍、银、铜和铝中的一种以上。

优选的，所述光源发生器选自包括发光二极管（light-emittingdiode,led）、有机发光二极管（organiclight-emittingdiode,oled）或激光光源。

优选的，所述光电模拟传感器为检测光信号-输出电压信号的光电模拟传感器。

上述所述的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪可采用集成组装的方式进行组装，实现仪器集成度高、体积小的特点。

制备上述任一项所述的一种血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的方法，包括如下步骤：

s1金属纳米结构及通道模具的组装

在芯片基底的表面生成固定金属纳米结构，再将带底部开通的凹槽的通道模具固定在具有金属纳米结构的芯片基底上；

s2具有金属纳米结构的生化传感检测芯片的制备

在通道模具的凹槽内加入抗血细胞表面抗原的抗体溶液，对位于凹槽内的金属纳米结构的表面进行抗体修饰，静置孵育后，清洗整个基底；用牛血清白蛋白溶液(bovineserumalbumin,bsa)封闭孵育后，再次清洗整个基底，氮气吹干，得到所述具有金属纳米结构的生化传感检测芯片；

s3检测仪的组装

将光源发生器、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片及光电模拟传感器按照检测光束路径固定，同时将光电模拟传感器通过线路与单片机连接，再将单片机通过线路与显示屏连接。

优选的，s1中，在芯片基底的表面生成固定金属纳米结构，具体包括：采用包括光刻方法、电化学刻蚀或模板分离的物理方法在芯片基底的表面生成金属纳米阵列，或者采用包括种子生长法的化学方法在芯片基底的表面生成金属纳米颗粒沉积基底。

更优选的，s1中，所述光刻方法包括电子束光刻或弹性软光刻。

更具体优选的，s1中，采用电子束光刻的方法在芯片基底的表面生成金属纳米阵列，具体包括如下步骤：

（1）采用旋涂法在芯片基底表面旋涂制备pmma液，并蒸发干燥去除氯苯，成膜；

（2）在蒸发干燥后的pmma薄膜上旋涂获得正性光刻胶薄膜，并加热干燥；

（3）在两个连续激光束的干涉下，正性光刻胶薄膜受到双重曝光；而后置在显影剂中浸泡，使得正性光刻胶薄膜的阵列序列呈现出方点阵的模式；

（4）再将金属棒在正性光刻胶薄膜曝光得到的阵列上连续热蒸发后，获得纳米金阵列。

更进一步优选的，所述正性光刻胶薄膜的阵列序列包括柱状纳米序列、梯形纳米序列和倒梯形纳米序列。

更具体优选的，s1中，采用种子生长法在芯片基底的表面生成金属纳米颗粒沉积体，具体包括如下步骤：

（1）配置种子悬浮液并经生长反应形成纳米金属颗粒液，离心，沉淀备用；

（2）依次用王水、丙酮、乙醇和去离子水清洗芯片基底，并用氮气烘干；

（3）用移液枪向清洗并烘干后的芯片基底中分别加入离心后得到的纳米金属颗粒液，静置沉淀，清洗基底，得到金属纳米颗粒沉积体。

更进一步优选的，其中，采用包括种子生长法在芯片基底的表面生成金属纳米颗粒沉积体的生成固定金属纳米结构的方式，可先将通道模具固定在芯片基底上，再将纳米金属颗粒液移入通道模具的凹槽内，静置沉积，生成金属纳米颗粒沉积体。

优选的，s2中，所述抗血细胞表面抗原的抗体溶液浓度为10~100μm。

优选的，s2中，加入所述抗血细胞表面抗原的抗体溶液的体积占通道模具的凹槽体积100%。

优选的，s2中，所述静置孵育的时间为1~2h。

优选的，s2中，所述用牛血清白蛋白溶液封闭孵育是采用3~5wt%的bsa溶液孵育1~2h。

优选的，s3中，光源发生器、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片、光电模拟传感器、单片机及显示屏采用集成组装的方式组装。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）本发明的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪集成度高，可实现自动化，受外界干扰因素较少，利于提高测试数据的准确率；其中的生化传感检测芯片能对血细胞可能含有的不同抗原的对应抗体进行分区，使抗体与对应抗原通过氢键结合力、电荷引力等多种分子间引力相互作用实现特异性结合，使该检测仪具有强特异性及高效性等特点；

（2）本发明的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪检测器件集成度高、分析操作简单、样品用量少、可实现自动化和连续监测，具有高效的血细胞计数-分型功能，有利于实现样品的自动化测量，具有比较广泛的应用价值，可适用于包括临床上血细胞计数、血细胞分型检测、生化检测和疾病标志物筛选等领域；

（3）本发明的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的制备方法简单，易于实现，其中的光电模拟传感器、单片机和检测芯片可进行低成本制造，集成后的仪器体积小，有利于工业化生产和商用推广。

附图说明

图1为具体实施例中本发明的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的结构示意图；

图2为具体实施例中本发明的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的具有金属纳米结构的芯片基底的结构示意图；

图3为具体实施例中本发明的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的具有金属纳米结构的生化传感检测芯片的结构示意图；

附图标注：1-光源发生器，2-具有金属纳米结构的生化传感检测芯片，21-芯片基底，22-金属纳米结构，23-通道模具，3-光电模拟传感器，4-单片机，5-显示屏。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征更易被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚的界定。

具体实施例中，本发明的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的结构示意图如图1所示，包括光源发生器1、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片2、光电模拟传感器3、单片机4及显示屏5；其中，光源发生器1、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片2以及光电模拟传感器3按照检测光束路径固定；单片机4与光电模拟传感器3连接；单片机4与显示屏5连接。

具体的，具有金属纳米结构的生化传感检测芯片2包括芯片基底21、金属纳米结构22以及通道模具23；其中，芯片基底21选自包括石英玻片或透明塑料片；金属纳米结构22包括金属纳米颗粒沉积体或金属纳米阵列，而金属纳米结构22的材料选自包括金、镍、银、铜和铝中的一种以上；通道模具23的材料选自包括pdms或pmma。

参见图2所示，金属纳米结构22固定在芯片基底21上；参见图3所示，通道模具23固定在具有金属纳米结构22的芯片基底21上；通道模具23具有一个以上底部开通的凹槽，每一个凹槽对应一个光束通道，而金属纳米结构22位于通道模具23的凹槽内；且位于通道模具23的凹槽内的金属纳米结构22的表面修饰附着有抗血细胞表面抗原的抗体，包括抗a凝集素抗体、抗b凝集素抗体、hla-a抗体、hla-b抗体、hla-c抗体、hpa-1b抗体与hpa-5b抗体中的一种以上。更具体的，具有金属纳米结构的生化传感检测芯片2的通道模具23的各凹槽内可选择加入单一的一种或多种抗血细胞表面抗原的抗体，对通道模具23的凹槽的金属纳米结构22进行修饰，根据修饰附着的抗体种类形成不同的功能分区，捕获不同血细胞的分型，形成含有多个微流控通道的微流控芯片。

具体的，光源发生器1选自包括发光二极管、有机发光二极管或激光光源；光电模拟传感器3为检测光信号-输出电压信号的光电模拟传感器。

具体的，上述所述的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪采用集成组装的方式进行组装。

利用上述血细胞计数-血细胞分型同时检测仪进行血液样本检测时，首先需要将待测血液样本加入至具有金属纳米结构的生化传感检测芯片2的通道模具23的凹槽内，同时开启光源发生器1、光电模拟传感器3、单片机4以及显示屏5，由光电模拟传感器3实时检测穿过具有金属纳米结构的生化传感检测芯片2的光强度，单片机4根据光电模拟传感器3接收到的光强度变化，测算出吸光度值，进而测算出血液样本血细胞分型与血细胞数量，并将数字信号传送给显示屏5进行显示。该检测仪设定多通道可同时检测红细胞上可能含有的凝集素抗原a和凝集素抗原b，白细胞上可能含有的hla-a、hla-b、hla-c以及血小板细胞上可能含有的hpa-1b与hpa-5b。同时根据抗原-抗体反应引起的吸光度值的变化检测血细胞数量，实现对血液样本血细胞分型和血细胞数量等多个指标的同时检测，提高了检测效率，且只需要跟踪测试吸光度值即可，一旦血液样本中血细胞上的抗原与共价连接于纳米结构上的抗体发生抗原-抗体反应，吸光度值就会发生变化，通过检测吸光度值就可以测出样本血细胞分型与血细胞数量，操作过程简单，受外界干扰因素较少，灵敏度较高，无污染，利于改善测试数据的准确率。

实施例1

本实施提供了一种血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的制备方法，基于实施例1的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪，其中，金属纳米结构为金属纳米阵列，具体包括如下步骤：

s1、金属纳米结构的制备

s11、采用旋涂法在石英基片表面以4000rpm的效率工作30s制备pmma薄膜，并在180℃下对pmma薄膜干燥5min以蒸发氯苯。

s12、在干燥后额pmma薄膜上使正性光刻胶以2000rpm的效率旋转35s获得正性光刻胶薄膜，而后在95℃下放置2min。

s13、在两个连续激光束(457.9nm)的干涉下（两束激光线是互相正交的，每次曝光持续18s），正性光刻胶薄膜受到双重曝光；在21℃下，置于显影剂中浸泡35s，使得正性光刻胶薄膜的柱状序列呈现出方点阵的模式。

s14、将5nm的镍和110nm的金连续热蒸发后修饰附着在正性光刻胶薄膜的柱状阵列上，即可获得纳米金-镍复合阵列，结构示意图如图1所示。

s2、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片的制备

s21、将含有七个底部开通的凹槽的pdms通道模具吸附固定在具有纳米金-镍复合阵列上；

s22、向pdms通道模具的七个凹槽中分别加入100μl100μm的抗a凝集素、抗b凝集素、hla-a抗体、hla-b抗体、hla-c抗体、hpa-1b抗体与hpa-5b抗体的pbs溶液（终溶液ph=7.4），孵育2h；用pbs溶液（磷酸缓冲盐溶液）洗两次基底；

s23、用3wt%的bsa溶液孵育2h后，用pbs溶液洗两次基底，用氮气烘干，制得具有纳米金-镍复合阵列的生化传感检测芯片，结构示意图如图2所示，其中，添加抗a凝集素及抗b凝集素的两个凹槽共同对应形成红细胞检测区，添加hla-a抗体、hla-b抗体及hla-c抗体的三个凹槽共同对应形成白细胞检测区，添加hpa-1b抗体与hpa-5b抗体的两个凹槽共同对应形成血小板检测区。

s3、光源发生器、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片、光电模拟传感器、单片机及显示屏的集成

s31、将led光源发生器、具有纳米金-镍复合阵列的生化传感检测芯片以及光电模拟传感器按光路顺序固定在装置中；

s32、使光电模拟传感器实现光信号向电信号的转换，并与单片机通过线路连接；

s33、使单片机实现模拟信号向数字信号的转换，并通过线路与显示屏连接，并均将各器件集成在装置壳体内，得到集成的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪。

s4、实验测试

s41、将采集到的新鲜血液样本置入上述制备的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的样品架中；

s42、直流电源驱动led光源，光源发出的光经过生化传感检测芯片后被光电模拟传感器接收，光电模拟传感器将光信号的测量转化为电信号的测量；

s43、根据单片机所显示的电压变化可判断生物传感检测芯片各区域是否发生抗原抗体结合，进而判断血液样本中血细胞表面所含抗体类型以及各种血细胞浓度。检测血细胞浓度时，先加入浓度梯度的已知浓度和血型的血细胞悬浮液作为目标物标准液进行标准曲线的测定，得到标准曲线和拟合公式；再进行检测待检测目标物，并将检测结果对比标准曲线和拟合公式计算出目标物的浓度。

实施例2

本实施提供了另一种血细胞计数-血细胞分型同时检测仪制备方法，基于实施例1的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪，其中，金属纳米结构为金属纳米颗粒沉积体，具体包括如下步骤：

s1、金属纳米结构的制备

s11、制备金种子悬浮液。使用王水浸泡玻璃器皿30min：合成实验中所有玻璃器皿都必须用王水浸泡30min；用纯水充分冲洗玻璃器，而后用超声清洗机清洗90min；将36ml去离子水加入150ml烧杯中，然后分别加入1ml0.01mol/l柠檬酸三钠和1ml0.1mol/lhaucl4，振荡使其充分混合均匀；用冰水配置0.1mol/l硼氢化钠溶液，取1ml迅速加入混合溶液，快速搅拌2min；然后将混合溶液避光在室温下保存4h。

s12、制备三种生长溶液a、b、c。溶液a和溶液b是相同的，均为由9ml0.05mol/l的ctab（十六烷基三甲基溴化铵）、4.5μl0.1mol/l的ki、0.05ml0.1mol/l的naoh溶液、0.05ml0.1mol/l抗坏血酸和0.25ml10mmol/l的haucl4混合制成；溶液c是由45ml0.05mol/lctab、0.023ml0.1mol/l的ki、0.25ml0.1mol/l的naoh溶液、0.25ml0.1mol/l的抗坏血酸和1.25ml10mmol/l的haucl4混合制成的。

s13、向生长溶液a中加入1.0ml金种子悬浮液并轻微振荡，再将混合种子悬浮液后的5.0ml生长溶液a迅速加入生长溶液b中并轻微振荡，然后将混合溶液a后的2.5ml生长溶液b加入生长溶液c中，得到混合液；将混合液倒置15s并放置1h，即可得到纳米金三角颗粒液。

s14、先后用王水、丙酮、乙醇和去离子水清洗石英玻片，并用氮气烘干；

s15、用移液枪向清洗并干燥后的石英玻片中分别加入100μl离心后得到的纳米金三角颗粒液，静置8h后，用pbs溶液洗两次基底，得到纳米金三角颗粒沉积体。

s2、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片的制备

s21、将含有七个底部开通的凹槽的pdms通道模具吸附固定在纳米金三角颗粒沉积体上；

s22、向通道模具的七个凹槽中分别加入100μl10μm的抗a凝集素、抗b凝集素、hla-a抗体、hla-b抗体、hla-c抗体、hpa-1b抗体与hpa-5b抗体的pbs溶液（ph=7.4），孵育2h；抽出残余抗体，用pbs溶液洗两次基底；

s23、用3wt%的bsa溶液孵育2h后，用pbs溶液洗两次基底，用氮气烘干，制得具有纳米金三角颗粒沉积体的生化传感检测芯片。

s3、光源发生器、具有金属纳米结构的生化传感检测芯片、光电模拟传感器、单片机及显示屏的集成。

s31、将led光源发生器、具有纳米金三角颗粒沉积体的生化传感检测芯片以及光电模拟传感器按光路顺序固定在装置中；

s32、使光电模拟传感器实现光信号向电信号的转换，并与单片机通过线路连接；

s33、使单片机实现模拟信号向数字信号的转换，并通过线路与显示屏连接，并均将各器件集成在装置壳体内，得到集成的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪。

s4、实验测试

s41、将采集到的新鲜血液样本置入上述制备的血细胞计数-血细胞分型同时检测仪的样品架中；

s42、直流电源驱动led光源，光源发出的光经过生化传感检测芯片后被光电模拟传感器接收，光电模拟传感器将光信号的测量转化为电信号的测量；

s43、根据单片机所显示的电压变化可判断生物传感检测芯片各区域是否发生抗原抗体结合，进而判断血液样本中血细胞表面所含抗体类型以及各种血细胞浓度。检测血细胞浓度时，先加入浓度梯度的已知浓度和血型的血细胞悬浮液作为目标物标准液进行标准曲线的测定，得到标准曲线和拟合公式；再进行检测待检测目标物，并将检测结果对比标准曲线和拟合公式计算出目标物的浓度。

上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。