一种基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极及其制备方法与流程

本发明属于传感器技术领域，特别涉及一种基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极及其制备方法。

背景技术

重金属污染对大气、土壤、食品、水资源带来严重影响。其中pb²⁺就是其中一种带来严重污染的重金属。pb²⁺在人体中含量超标会导致中枢神经系统损伤、高血压、肾毒病等疾病；儿童体内pb²⁺含量超标会导致儿童认知缺陷。因此，对pb²⁺的快速灵敏度检测，在环境保护、医疗研究等方面有重要意义。

适配体是一段经体外筛选的寡核苷酸序列，能与相应的配体进行强特异性和亲和性的结合。由于其制备过程较简单，易修饰与标记，因此在生物传感器中得以广泛应用。本研究适配体与目标pb²⁺特异性结合，形成“g-四联体”结构，从而特异检测pb²⁺。

在文献(1)中国发明专利公开号cn105758922a中，梁刚等人设计了一种基于光电化学dna测定pb²⁺的生物传感器。其设计原理如下：将含有部分能够特异性识别pb²⁺的dna序列组装于氧化铟锡(ito)电极表面，并以ru(bpy)2(dppz)²⁺作为光电化学信号探针，当pb²⁺与电极表面dna作用后，探针从dna链中脱离，导致光化学信号的降低，实现了对pb²⁺的检测。

在文献(2)中国发明专利公开号cn104237361a中，周元斌等人设计了一种基于l-半胱氨酸/石墨烯修饰电极同时检测cd²⁺、pb²⁺的电化学方法。其设计原理如下：首先选取氧化石墨烯为原料，通过控制氧化石墨与肼反应温度与反应时间，利用化学还原法制得纳米级片层结构的石墨烯制得石墨烯修饰电极；接着在所制得的石墨烯修饰电极表面进一步电聚合上l-半胱氨酸，制得l-半胱氨酸/石墨烯修饰电极；最后，选取l-半胱氨酸/石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的银/氯化银电极及作为对电极的铂丝电极组成三电极系统，利用差示脉冲阳极溶出伏安法对pb²⁺和cd²⁺同时进行电化学测定。

技术实现要素：

本发明提出了一种基于pb²⁺适配体检测pb²⁺的修饰电极的新设计原理。如图1所示。在玻碳电极表面修饰的氮掺杂碳量子点(ncqds)，当在含有共反应试剂k2s2o8的磷酸缓冲液(pbs)中，产生较强的光电致化学(ecl)信号，ncqds表面羧基活化与适配体的氨基共价连接，使得适配体修饰在ncqds表面，使得ncqds与k2s2o8接触面积降低，引起ecl信号下降，当pb²⁺存在时，由于适配体与pb²⁺特异性结合，形成“g-四联体”结构，进一步阻碍ncqds与k2s2o8接触，使得ecl信号进一步下降，并且在一定范围内，随着pb²⁺的浓度的增加，ecl信号不断下降。

本发明的目的在于提供一种利用上述原理且基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极，其特征在于，该修饰电极以玻碳电极为基础电极，负载有ncqds和修饰氨基的pb²⁺适配体；其中ncqds负载量为3.54×10^-2～7.08×10^-1g/m²，pb²⁺适配体负载量为7.08×10^-3～7.08×10^-1g/m²。该修饰电极仅由ncqds碳量子点和pb²⁺适配体构成，ncqds碳量子点粒径仅为2～3nm，比表面积大，与电极表面有很强的吸附作用，而且pb²⁺适配体与ncqds碳量子点为化学连接，所以在不使用萘酚、壳聚糖等成膜剂等条件下pb²⁺适配体仍能牢固修饰在电极表面，避免过度成分引入对传感器检测的准确性造成干扰，具有结构简单、稳定等优势。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极的制备方法，其工艺步骤如下：

(1)ncqds悬浊液的制备：取二乙烯三胺五乙酸(dtpa)白色粉末置于去离子水中，配制成质量为0.1～0.5g/ml的悬浊液；将悬浊液在180～230℃反应6～10.h，直至悬浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中混匀，以6000×g～10000×g的离心力离心，以去除未反应的dtpa，重复上述离心步骤，直到无沉淀，则获得ncqds悬浊液，冻干，将冻干ncqds粉末配成浓度为0.05～0.5mg/ml的ncqds悬浊液，4℃保存备用；

(2)pb²⁺适配体溶液的配制：将pb²⁺适配体用去离子水充分溶解，配制成浓度为0.01～0.5mg/ml的pb²⁺适配体溶液。

(3)羧基活化溶液配制：将碳二酰亚胺盐酸盐(edc)用去离子水充分溶解，配制成浓度为1～50mg/mledc溶液；将n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)用去离子水充分溶解，配制成浓度为1～50mg/ml的nhs溶液；将2-吗啉乙磺酸(mes)用去离子水充分溶解，配制成浓度为0.01～0.5mol/l的mes缓冲液。将上述步骤配制好的edc溶液、nhs溶液、mes缓存液混合均匀，备用。

(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗1min；

(5)修饰电极的制备：取5～10μl步骤(1)中配制的ncqds悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到3.54×10^-2～7.08×10^-1g/m^2，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液溶液中，孵育30～120min，将电极取出后用去离子水冲洗晾至微干，然后在电极表面滴加5～10μl步骤(2)中制备的pb²⁺适配体溶液，使其负载量达到7.08×10^-3～7.08×10^-1g/m²，晾干，即为基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极，备用。

将上述制备的修饰电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，构成三电极体系，将三电极体系插入到ph为6～8，含有浓度为0.8～1.2mol/l的k2s2o8的pbs底液中。采用ecl进行检测，扫描电位范围为0～-1.8v，扫描速率为100mv/s，光电倍增管高压为800v。待ecl信号稳定后，向反应底液中加入不同浓度的pb²⁺溶液，继续进行ecl检测，根据检测结果，以pb²⁺溶液浓度的对数值即log(cpb²⁺)为横坐标，ecl强度为纵坐标作图，建立标准工作曲线。本发明修饰电极用于pb²⁺检测，检测限较低，且线性检测范围较宽，检测性能高于大多数基于pb²⁺适配体检测pb²⁺的文献。

电极的修饰及对pb²⁺的识别结合，可以通过阻抗谱(eis)进行检测，如图2所示：随着电极的每一步修饰和pb²⁺的加入与适配体特异性结合，都引起了eis的增加。同样，如图3所示：将电极的每一步修饰和识别pb²⁺的过程进行ecl测试，可以看出；裸玻碳电极基本没有ecl信号，修饰了ncqds，ecl信号达到17000，进一步修饰pb²⁺适配体，ecl信号下降至15000左右，当pb²⁺加入到反应底液中，因pb²⁺与适配体特异性结合，导致ecl信号进一步下降。

本发明的优点在于：制备过程仅使用ncqds和pb²⁺适配体修饰电极，没有使用成膜剂，修饰过程方便、简单、快捷；并且可以高效快速灵敏地检测pb²⁺、检测范围较宽、检测限低，无干扰。该修饰电极将ncqds、pb²⁺适配体与电致化学发光技术结合，提出了一种检测pb²⁺修饰电极的制备新策略，实现了pb²⁺简便、高效、快速的检测。

附图说明

图1为本发明基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极设计原理图。

图2为本发明基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极的修饰过程及其检测80nmol/l的pb²⁺的阻抗表征。横坐标为阻抗谱z实部，单位：欧姆(ohm)，纵坐标为阻抗谱-z虚部，单位：欧姆(ohm)。其中曲线a表示裸电极阻抗谱曲线；曲线b是修饰有ncqds的电极阻抗谱曲线；曲线c是基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极阻抗谱曲线；曲线d是基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极在含有80nmol/lpb²⁺的阻抗谱曲线，上述检测底液为5mmol/lk3fe(cn)6/k4fe(cn)6和0.1mol/lkcl。

图3为裸电极(a)、ncqds电极(b)、基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极(c)及基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极在含有80nmol/lpb²⁺的ecl强度-时间(ecl-t)响应图。横坐标为时间(t)，单位：秒(s)，纵坐标为ecl强度，单位：绝对单位(a.u.)。其中曲线a、b、c检测底液为1.0mol/l的k2s2o8的pbs溶液，曲线d检测底液为除上述溶液外含有80nmol/lpb²⁺。

图4为实施例1中基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极在不同pb²⁺浓度条件下ecl强度-时间(ecl-t)图。其中标注数字为pb²⁺浓度，单位：纳摩尔/升(nmol/l)，横坐标为时间(t)，单位：秒(s)，纵坐标为ecl强度，单位：绝对单位(a.u.)。

图5为实施例1中基于碳量子点检测pb²⁺的修饰电极检测pb²⁺的标准曲线图。其中，横坐标为pb²⁺浓度的对数(log(cpb²⁺))，单位：无量刚，纵坐标为ecl强度，单位：绝对单位(a.u.)。

具体实施方式

实施例1：

(1)ncqds悬浊液的制备：取2gdtpa置于20ml去离子水中，配制成质量0.1g/ml的浊液；将悬浊液置于烘箱中，230℃反应8.h，直至浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中，以10000×g的离心力离心，以去除未反应的dtpa沉淀，则上层液为ncqds悬浊液，将ncqds悬浊液冻干成ncqds粉末，将ncqds粉末配成浓度为0.2mg/ml的ncqds悬浊液，4℃保存。

(2)pb²⁺适配体溶液的配制：取0.8mgpb²⁺适配体用8ml去离子水充分溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的pb²⁺适配体溶液。

(3)羧基活化溶液配制：将0.1gedc用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为10mg/mledc溶液；将0.1gnhs用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为10mg/ml的nhs溶液；将0.2132gmes用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为0.1mol/lmes缓存液。将上述步骤配制好的edc溶液、nhs溶液、mes缓存液各取1ml混合均匀，备用。

(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗1min。

(5)修饰电极的制备：取6μl步骤(1)中配制的ncqds悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到1.70×10^-1g/m²，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液中，孵育30min，将电极取出后用去离子水冲洗后4℃晾至微干，然后在电极表面滴加6μl步骤(2)中制备的pb²⁺适配体溶液，使其负载量达到8.49×10^-2g/m^2，晾干，备用。

将上述制备的修饰电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，构成三电极体系，将三电极体系插入到ph为7，含有浓度为1.0mol/l的k2s2o8的磷酸盐缓冲液pbs底液中。采用ecl进行检测，扫描电位范围为0～-1.8v，扫描速率为100mv/s，光电倍增管高压为800v。待ecl信号稳定后，向反应底液中加入不同浓度的pb²⁺溶液，继续进行ecl检测，结果如图4所示。根据检测结果，以pb²⁺溶液浓度的对数值(log(cpb²⁺))作为横坐标，ecl强度作为纵坐标作图，建立标准工作曲线如图5所示，pb²⁺检测范围为0.05～387.9nmol/l，ecl强度与pb²⁺浓度的对数呈现良好的线性关系(r²＝0.998)，检测限为：18.9pmol/l。

实施例2：

(1)ncqds悬浊液的制备：取2gdtpa置于20ml去离子水中，配制成质量0.1g/ml的浊液；将悬浊液置于烘箱中，200℃反应10.h，直至浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中，以8000×g的离心力离心，以去除未反应的dtpa沉淀，则上层液为ncqds悬浊液，将ncqds悬浊液冻干成ncqds粉末，将ncqds粉末配成浓度为0.2mg/ml的ncqds悬浊液，4℃保存。

(2)pb²⁺适配体溶液的配制：取0.4mgpb²⁺适配体用8ml去离子水充分溶解，配制成浓度为0.05mg/ml的pb²⁺适配体溶液。

(3)羧基活化溶液配制：将0.2gedc用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为20mg/mledc溶液；将0.2gnhs用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为20mg/ml的nhs溶液；将0.4264gmes用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为0.2mol/lmes缓存液。将上述步骤配制好的edc溶液、nhs溶液、mes缓存液各取1ml混合均匀，备用。

(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗1min。

(5)修饰电极的制备：取8μl步骤(1)中配制的ncqds悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到2.26×10^-1g/m²，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液中，孵育60min，将电极取出后用去离子水冲洗后4℃晾至微干，然后在电极表面滴加8μl步骤(2)中制备的pb²⁺适配体溶液，使其负载量达到5.66×10^-2g/m²晾干，备用。

将上述制备的修饰电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，构成三电极体系，将三电极体系插入到ph为6，含有浓度为1.2mol/l的k2s2o8的磷酸盐缓冲液pbs底液中。采用ecl进行检测，扫描电位范围为0～1.8v，扫描速率为100mv/s，光电倍增管高压为800v。待ecl信号稳定后，向反应底液中加入不同浓度的pb²⁺溶液，继续进行ecl检测，结果如图4所示。根据检测结果，以pb²⁺溶液浓度的对数值(log(cpb²⁺))作为横坐标，ecl强度作为纵坐标作图，建立标准工作曲线如图5所示，pb²⁺检测范围为6～196.7nmol/l，ecl强度与pb²⁺浓度的对数呈现良好的线性关系(r²＝0.998)，检测限为：2.06nmol/l。

实施例3：

(1)ncqds悬浊液的制备：取10gdtpa置于20ml去离子水中，配制成质量0.5g/ml的浊液；将悬浊液置于烘箱中，180℃反应6.h，直至浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中，以6000×g的离心力离心，以去除未反应的dtpa沉淀，则上层液为ncqds悬浊液，将ncqds悬浊液冻干成ncqds粉末，将ncqds粉末配成浓度为0.075mg/ml的ncqds悬浊液，4℃保存。

(2)pb²⁺适配体溶液的配制：取0.4mgpb²⁺适配体用8ml去离子水充分溶解，配制成浓度为0.05mg/ml的pb²⁺适配体溶液。

(3)羧基活化溶液配制：将0.5gedc用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为50mg/mledc溶液；将0.5gnhs用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为50mg/ml的nhs溶液；将1.066gmes用10ml去离子水充分溶解，配制成浓度为0.5mol/lmes缓存液。将上述步骤配制好的edc溶液、nhs溶液、mes缓存液各取1ml混合均匀，备用。

(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗1min。

(5)修饰电极的制备：取10μl步骤(1)中配制的ncqds悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到1.06×10^-1g/m²，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液中，孵育120min，将电极取出后用去离子水冲洗后4℃晾至微干，然后在电极表面滴加10μl步骤(2)中制备的pb²⁺适配体溶液，使其负载量达到7.07×10^-2g/m^2，晾干，备用。

将上述制备的修饰电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，构成三电极体系，将三电极体系插入到ph为8，含有浓度为0.8mol/l的k2s2o8的磷酸盐缓冲液pbs底液中。采用ecl进行检测，扫描电位范围为0～-1.8v，扫描速率为100mv/s，光电倍增管高压为800v。待ecl信号稳定后，向反应底液中加入不同浓度的pb²⁺溶液，继续进行ecl检测，结果如图4所示。根据检测结果，以pb²⁺溶液浓度的对数值(log(cpb²⁺))作为横坐标，ecl强度作为纵坐标作图，建立标准工作曲线如图5所示，pb²⁺检测范围为20～98.2nmol/l，ecl强度与pb²⁺浓度的对数呈现良好的线性关系(r²＝0.998)，检测限为6.0nmol/l。