液相反应动力学光谱及电化学谱同步测量装置和方法与流程

本发明属于液相混合反应动力学测试技术领域，特别涉及一种在毫/微秒量级，实现液相反应动力学光谱及电化学谱同步测量的装置和方法。

技术背景

以蛋白质折叠过程、酶促反应动力学、抗体与抗原结合过程和药物分子的作用机理研究为代表的复杂高分子体系的反应动力学，对了解化学反应的机理，控制化学反应的快慢以及设计新型化学反应具有重要意义。复杂高分子体系反应的特点主要有反应条件较为复杂，影响因素繁多以及反应速率较慢等特性。人体内各种生化过程的完成离不开各种生物酶的催化，很多酶需要适宜的溶剂化条件或者激活剂激活才能具有较高的活性，而目前广泛应用的研究酶活性的手段就是抑制剂的抑制效应，这都意味着需要在特定的溶剂条件下实现两种或三种溶液的快速混合，而酶促反应的速率可以通过观测反应物和产物的吸收光谱、荧光光谱或者电化学谱的变化而计算得到。大多数酶的催化常数约为每秒1到10000s^-1，例如碱性磷酸酶和胰凝乳蛋白酶的催化反速率常数约为14s^-1和100s^-1，毫\微秒分辨的液相混合反应动力学光谱及电化学谱测量技术是分析该过程最有力的手段(文献1：kleniewska,p.,etal.,thenadphoxidasefamilyanditsinhibitors.archivumimmunologiaeettherapiaeexperimentalis,2012.60(4),277-294.)。蛋白质的折叠和去折叠过程，通常需要适宜的温度、离子类型和离子强度等条件，但是由于光谱展宽效应，很多情况下蛋白质的折叠过程难以观测到光谱的改变，而电化学参数的改变可能就比较显著。这些电化学参数对描述光诱导的金属离子和酶活性中心的结合，光催化反应中小分子或ph值的改变有着重要的意义。例如在不同温度、不同酸碱度条件下，叶绿素卟啉环中金属离子和质子的取代反应中，单一的检测手段难以准确的描述反应过程，只有通过同步的光谱和电化学谱相结合，才能建立清晰的物理图像。(文献2：ke,z.g.,etal.,afluorescenceapproachtotheunfoldingthermodynamicsofhorseradishperoxidasebasedonhemedegradationbyhydrogenperoxide.chemicalphysicsletters,2016.657,49-52.文献3：qian,y.d.,etal.,electrochemicalprobingofthesolutionph-inducedstructuralalterationsaroundthehemegroupinmyoglobin.physicalchemistrychemicalphysics,2013.15(39)，16941-16948.文献4：zhao,x.j.,etal.,electrochemicallymonitoringtheacidandacidicurea-inducedunfoldingofhemoglobinanditselectrocatalyticability.electroanalysis,2010.22(19),2277-2283.文献5：fedurco,m.,etal.,electrochemistryofunfoldedcytochromecinneutralandacidicureasolutions.journaloftheamericanchemicalsociety,2005.127(20),7638-7646.)。因此毫\微秒分辨的液相混合反应动力学光谱及电化学谱测量装置将是解析复杂高分子体系动力学过程的有效手段。

现有成熟的毫\微秒时间分辨液相混合反应动力学测试装置主要集中在光谱学的测量上，生产该型号的两家代表公司分别为英国的appliedphotophysics公司(文献6：https://www.photophysics.com)和法国的bio-logic公司(文献7：http://www.bio-logic.net/en)。英国的appliedphotophysics公司的装置以高压气体作为动力输出，由于气压受温度影响较大以及不同的溶液粘度导致流动阻力而改变，因此难以精确控制溶液的流速和混合比，并且混合过程无法形成有效的反馈；法国的bio-logic公司以步进电机作为进样动力，步进电机本身具有较低的扭矩，较低的过载能力和较慢的响应等缺点，容易导致丢步和进样的不准确，并且由于只有进样电机提供进样动力，容易导致过压效应，导致测量的不准确性；同时两家公司的样品池功能都比较单一，一个样品池只能测量光谱参数或者电化学参数，而无法实现反应过程中两个或多个参数的同步测量。

技术实现要素：

针对现有技术的不足和复杂高分子体系反应动力学多参数同步测量的需求，本发明的目的在于提供一种液相反应动力学光谱及电化学谱同步测量装置和方法，可以在毫\微秒分辨，200nm到800nm波长范围内，实现两种或多种溶液快速混合并使其流动停止，进而同步测量化学反应过程中反应液吸收光谱、荧光光谱以及电化学谱等参数。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种液相反应动力学光谱及电化学谱同步测量装置，其特征在于，包括计算机及时序控制系统、探测光入射系统、样品池、化学液进样系统、废液存储系统、液相反应动力学光谱测量系统、电化学测量仪及数据采集器，其中，所述样品池用于反应液的存储和流通，所述化学液进样系统和所述废液存储系统分别与所述样品池的混合液入口和混合液出口连通；所述探测光入射系统设置于所述样品池的外侧，用于沿所述样品池内反应液的流动方向发射探测光；所述液相反应动力学光谱测量系统设置于所述样品池的外侧，用于测量反应液的吸收光谱和荧光光谱；所述电化学测量仪设置于所述样品池内，用于测量反应液的电化学谱；所述数据采集器与所述液相反应动力学光谱测量系统和电化学测量仪连接，用于采集光谱信号和电化学谱信号；所述探测光入射系统、化学液进样系统、废液存储系统、液相反应动力学光谱测量系统、电化学测量仪及数据采集器均与计算机及时序控制系统连接。

所述液相反应动力学光谱测量系统包括吸收光强探测器、荧光单色仪及荧光光强探测器，其中吸收光强探测器与所述探测光入射系统相对地设置于所述样品池的相对两侧，所述吸收光强探测器用于测量反应液的吸收光谱，所述荧光单色仪和荧光光强探测器沿垂直于所述样品池内反应液的流动方向依次设置，所述荧光单色仪用于输出荧光的单波长或全谱至荧光光强探测器上，所述荧光光强探测器用于测量反应液的荧光光谱，所述荧光光强探测器和吸收光强探测器均与所述数据采集器连接。

所述探测光入射系统包括探测光源和入射单色仪，所述入射单色仪沿所述探测光源的光路方向设置，用于输出所述探测光源的单波长或全谱。

所述样品池内设有用于反应液流通的流通池，所述电化学测量仪包括设置于所述流通池内部两侧的电极及分别与两个电极连接的第一电极数据线和第二电极数据线。

所述化学液进样系统包括两组或两组以上的单管路供液系统；

当具有两组单管路供液系统时，两组单管路供液系统并联为一路混合液供液管线后与所述样品池的混合液入口连通；

当具有两组以上单管路供液系统时，其中两组单管路供液系统并联为第一路混合液供液管线，第一路混合液供液管线再与第三组单管路供液系统并联为第二路混合液供液管线，依次类推，多个单管路供液系统并联后的最后一路混合液供液管线与所述样品池的混合液入口连通。

所述单管路供液系统包括液体管线、进样注射器、储液注射器、两位三通阀及与进样注射器连接的进样伺服电机，其中进样注射器、储液注射器及液体管线均与两位三通阀连接，所述进样伺服电机用于驱动所述进样注射器进行吸液或排液，所述进样伺服电机通过伺服电机控制系统控制。

所述废液存储系统包括废液注射器、废液伺服电机、废液瓶及排液管线，其中废液注射器、废液瓶及排液管线均与两位三通阀连接，所述排液管线与所述样品池的混合液出口连通；所述废液伺服电机与废液注射器连接，用于驱动所述废液注射器吸液或排液，所述废液伺服电机通过伺服电机控制系统控制。

所述化学液进样系统的供液管路容置于管线恒温槽内，所述样品池和管线恒温槽的温度通过温度控制器控制。

一种液相反应动力学光谱及电化学谱同步测量装置的测量方法，所述方法包括以下步骤：

1)测量背景谱：所述化学液进样系统和废液存储系统协同工作，将缓冲溶液注入样品池内，探测光入射系统发射设定波长的探测光至样品池内，通过液相反应动力学光谱测量系统和电化学测量仪同步测量缓冲溶液的光谱和电化学谱作为背景信号；

2)测量实验谱：所述化学液进样系统和废液存储系统协同工作，将待测样注入样品池内，通过液相反应动力学光谱测量系统和电化学测量仪进行光谱信号和电化学谱信号的同步采集；

3)通过计算机及时序控制系统进行数据处理，可得到同步光谱和电化学谱。

所述液相反应动力学光谱测量系统包括沿反应液流动方向设置的吸收光强探测器和沿垂直于反应液流动方向设置的荧光光强探测器，吸收光强探测器测量反应液的吸收光谱，荧光光强探测器测量反应液荧光光谱，所述化学液进样系统和所述废液存储系统的停止工作的时间相对于所述吸收光强探测器、荧光光强探测器和电化学测量仪的测量时间有延时。

本发明具有以下的有益效果和优点：

1.本发明可以实现吸收光谱、发射光谱和电化学谱三个参数同步测量。

2.本发明中废液伺服电机的引入可有效缩短装置测量的死时间，降低反应过程中过压和湍流效应的产生，使测得的实验结果更加准确。

3.本发明采用独立控制管线恒温槽温度和样品池温度，可以确保反应液的存储温度和化学反应发生的温度独立控制，更真实的模拟生化反应进行的条件。

附图说明

图1是本发明的结构原理图；

图2是本发明的样品池的轴测图；

图3是本发明的样品池的主视图；

图4是本发明的温控单元示意图；

图5是本发明所测量到的同步光谱和电化学谱图。

其中：1-1为第一进样伺服电机，1-2为第二进样伺服电机，1-3为第三进样伺服电机，1-4为废液伺服电机，2-1为第一进样注射器，2-2为第二进样注射器，2-3为第三进样注射器，2-4为废液注射器，3-1为第一储液注射器，3-2为第二储液注射器，3-3为第三储液注射器，3-4为废液瓶，4-1为第一两位三通阀，4-2为第二两位三通阀，4-3为第三两位三通阀，4-4为第四两位三通阀两位三通阀，5-1为第一混合器，5-2为第二混合器，6为样品池，7-1、7-2、7-4、7-5、7-6为液体管线，7-6为排液管线，7-3为预混合管线，8-1为入射单色仪，8-2为荧光单色仪，9-1为吸收光强探测器，9-2为荧光光强探测器，10-1为电化学测量仪，11为数据采集器，12为计算机及控制系统，13为伺服电机控制系统，14为温度控制器，15为管线恒温槽，16为半导体制冷片，17为样品池温度传感器，18为管线恒温槽温度传感器，19为探测光源，a1为混合液入口，a2为混合液出口，b1为探测光入射面，b2为探测光出射面，c1为前侧荧光探测面，c2为后侧荧光探测面，d1为上表面电极，d2为下表面电极，e1为左第一透光密封石英片，e2为第二透光密封石英片，f1为第一电极数据线，f2为第二电极数据线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。

如图1-3所示，本发明提供的一种液相反应动力学光谱及电化学谱同步测量装置，包括计算机及时序控制系统12、探测光入射系统、样品池6、化学液进样系统、废液存储系统、液相反应动力学光谱测量系统、电化学测量仪10-1及数据采集器11，其中样品池6用于反应液的存储和流通，化学液进样系统和废液存储系统分别与样品池6的混合液入口a1和混合液出口a2连通；探测光入射系统设置于样品池6的外侧，用于沿样品池6内反应液的流动方向发射探测光；液相反应动力学光谱测量系统设置于样品池6的外侧，用于测量反应液的吸收光谱和荧光光谱；电化学测量仪10-1设置于样品池6内，用于测量反应液的电化学谱；数据采集器11与液相反应动力学光谱测量系统和电化学测量仪10-1连接，用于采集光谱信号和电化学谱信号；探测光入射系统、化学液进样系统、废液存储系统、液相反应动力学光谱测量系统、电化学测量仪10-1及数据采集器11均与计算机及时序控制系统12连接。

液相反应动力学光谱测量系统包括吸收光强探测器9-1、荧光单色仪8-2及荧光光强探测器9-2，其中吸收光强探测器9-1与探测光入射系统相对地设置于样品池6的相对两侧，吸收光强探测器9-1用于测量反应液的吸收光谱，荧光单色仪8-2和荧光光强探测器9-2沿垂直于样品池6内反应液的流动方向依次设置，荧光单色仪8-2用于输出荧光的单波长或全谱至荧光光强探测器9-2上，荧光光强探测器9-2用于测量反应液的荧光光谱，荧光光强探测器9-2和吸收光强探测器9-1均与数据采集器11连接。

探测光入射系统包括探测光源19和入射单色仪8-1，入射单色仪8-1沿探测光源19的光路方向设置，用于探测光源19的单波长或全谱输出。

入射单色仪单色仪8-1可以输出探测光源中的单波长，也可以输出其全谱，荧光单色仪8-2可以输出荧光的单波长，也可以输出其全谱。入射单色仪单色仪8-1和荧光单色仪8-2还可以以一定的速率进行波长扫描，通过调节狭缝宽度，可以输出不同的光谱带宽。入射单色仪8-1出来的探测光经过样品池6的长轴，沿着混合液流动方向，同时吸收光强探测器9-1也在同一方向上。

样品池6内设有用于反应液流通的流通池，电化学测量仪10-1包括设置于流通池内部两侧的电极及分别与两个电极连接的第一电极数据线f1和第二电极数据线f2。

如图2-3所示，样品池6采用四面透光材质，如透光密封石英片，可以实现四面透光，同时保证样品池6的密封。样品池6内的流通池的水平方向两端分别为探测光入射面b1和探测光出射面b2，流通池的前后侧分别为前侧荧光探测面c1和后侧荧光探测面c2。在与反应液流动方向垂直的竖直方向有两片惰性电极，即上表面电极d1和下表面电极d2，可以监测反应过程反应液中电化学参数的变化，第一电极数据线f1和第二电极数据线f2可以用于电极的控制和信号采集。流通池的两面安装有电极片，同时较低的样品池容积可以进一步提高时间分辨率。

本发明的实施例中，在流通池上下两面安装有铂、银、钯或是石墨等惰性材质的电极片，电极表面经过电镀和沉积等表面预处理形成微结构。电极片内嵌于样品池6的内表面，并使其上表面与样品池6齐平和密封。样品池6的透光区域为平面结构，非透光区域通过表面黑化来抑制杂散光，提高光谱分辨率；大角度的内壁之间为倒角结构，可有效地减少湍流的产生。

化学液进样系统包括两组或两组以上的单管路供液系统；当具有两组单管路供液系统时，两组单管路供液系统并联为一路混合液供液管线后与样品池6的混合液入口a1连通；当具有两组以上单管路供液系统时，其中两组单管路供液系统并联为第一路混合液供液管线，第一路混合液供液管线再与第三组单管路供液系统并联为第二路混合液供液管线，依次类推，多个单管路供液系统并联后的最后一路混合液供液管线与样品池6的混合液入口a1连通。

单管路供液系统包括液体管线、进样注射器、储液注射器、两位三通阀及与进样注射器连接的进样伺服电机，其中进样注射器、储液注射器及液体管线均与两位三通阀连接，进样伺服电机用于驱动进样注射器进行吸液或排液，进样伺服电机通过伺服电机控制系统13控制。

本发明的实施例中，化学液进样系统包括三组单管路供液系统，第一组单管路供液系统包括第一进样伺服电机1-1、第一进样注射器2-1、第一储液注射器3-1、第一两位三通阀4-1及液体管线7-1，第一进样伺服电机1-1与第一进样注射器2-1连接，第一进样注射器2-1、第一储液注射器3-1及液体管线7-1均与第一两位三通阀4-1连接，液体管线7-1和第二组单管路供液系统与第一混合器5-1连接，第一混合器5-1与预混合管线7-3连接，预混合管线7-3和第三路供液管路均与第二混合器5-2连接，第二混合器5-2通过液体管线7-5与样品池6的混合液入口a1连通。

第二混合器5-2混合之后的反应液通过液体管线7-5在混合液入口a1处注入样品池6内，之后经过入射单色仪8-1分光之后的探测光通过探测光入射面b1照入反应液中，吸收光强探测器9-1在探测光出射面b2可以进行紫外可见吸收光谱的测量。反应液发出的荧光可以沿垂直于反应液流动方向穿过前侧荧光探测面c1或后侧荧光探测面c2，经过荧光单色仪8-2分光之后，再通过荧光光强探测器9-2进行荧光发射谱的测量。

第一两位三通阀4-1到第三两位三通阀4-3可以控制反应液从储液注射器流入进样注射器，或者从进样注射器流入样品池6。

第一进样注射器2-1和第一储液注射器3-1内装缓冲溶液，用于管路的冲洗、背景光谱或电化学谱的测量以及不同比例的混合稀释。

废液存储系统包括废液注射器2-4、废液伺服电机1-4、废液瓶3-4、第四两位三通阀4-4及排液管线7-6，其中废液注射器2-4、废液瓶3-4及排液管线7-6均与第四两位三通阀4-4连接，排液管线7-6与样品池6的混合液出口a2连通；废液伺服电机1-4与废液注射器2-4连接，用于驱动废液注射器2-4吸液或排液，废液伺服电机1-4通过伺服电机控制系统13控制。第四两位三通阀4-4可以控制废液从样品池6流入废液注射器2-4，或者从废液注射器2-4流入废液瓶3-4中。

进样注射器和废液注射器为惰性材质，且内径均一，可以通过伺服电机的转速和转动时间精确地控制反应液的流速、混合体积和混合比例。废液伺服电机1-4协同进样伺服电机工作，在保证更快的进样速度的同时，也可以保证混合液流动稳定性，同时降低液体管线中过压效应的产生。

液体管线7-1、7-2、7-4、7-5及排液管线7-6在保证功能的前提下尽可能短，预混合管线7-3可以根据不同的实验要求调节其容积，可用于酶的激活。进样伺服电机和废液伺服电机停止工作的时间相对于吸收光强探测器9-1、荧光光强探测器9-2和电化学测量仪10-1的测量时间有延时，这样可以保证信号采集的完整性。通过在光路系统中加偏振片，可以实现吸光度、圆二色光谱、荧光发射和荧光偏振的测量；电化学测量仪10-1可以实现ph值、电导率和离子强度的测量。

如图4所示，化学液进样系统的供液管路容置于管线恒温槽15内，样品池6和管线恒温槽15的温度通过温度控制器14控制。管线恒温槽15的温度通过液体循环进行控制，样品池6的温度通过半导体制冷片16进行控制。样品池6和管线恒温槽15内分别设有样品池温度传感器17和管线恒温槽温度传感器18。

本发明的测量过程是：

首先，将三个储液注射器的溶液注入到进样注射器中并冲洗管路，之后切换两位三通阀使进样注射器和样品池6连通。将管线恒温槽和样品池半导体制冷片的温度设定好，入射单色仪8-1和荧光单色仪8-2设定好波长。根据设备中使用预混合管线和进样注射器等配件的类型，设定好进样的顺序，进样延时和进样量。之后伺服电机按照按照设定好的工作程序进样，并快速停止，同时吸收光强探测器9-1、荧光光强探测器9-2和电化学测量仪10-1开始工作，测量背景谱。之后伺服电机继续工作，在多次冲洗了管线和样品池之后，再次按照设定好的程序进样，并快速停止，同时吸收光强探测器9-1、荧光光强探测器9-2和电化学测量仪10-1开始工作，测量实验谱，通过数据处理软件进行数据处理，便可得到同步光谱和电化学谱，如图5所示。可以看出随着反应的进行，待测反应底物浓度的降低，吸收光谱和发射光谱的强度而逐渐减小，而由此产物是一种酸性物质，混合液的ph值逐渐降低。

本发明中的装置可以在200nm-800nm波长，毫\微到小时的时间尺度内，通过伺服电机的快速进样和停止，测量溶液混合之后的反应动力学过程，通过紫外吸收、荧光光谱和电化学谱同步测量得到的参数计算得到反应速率常数，从而推断反应机理和涉及到的中间体。

本发明中的装置可直接用于稳态光谱及电化学谱的测量，温控系统可独立的控制样品池和管线恒温槽的温度，从而可以实现实验条件的精确控制。

终上所述，本发明的装置可以实现毫\微秒分辨下，液相反应动力学光谱及电化学谱的同步测量，其中探测光源19与光路系统、入射单色仪8-1、样品池6、荧光单色仪8-2和荧光光强探测器9-2连接；探测光源19与光路系统、入射单色仪8-1、样品池6和吸收光强探测器9-1连接；计算机及时序控制系统分别与吸收光强探测器9-1、荧光光强探测器9-2、电化学测量仪10-1、数据采集器11、入射单色仪8-1、荧光单色仪8-2、伺服电机控制系统13连接。其测量方法为：将储液注射器中的溶液注入进样注射器，将入射单色仪8-1的输出波长设定好，先同步测量缓冲溶液的光谱和电化学谱作为背景信号，之后按照设定好的程序，注入待测样，同时精确控制时间进行光谱信号和电化学谱信号的同步采集。通过控制进样伺服电机和废液伺服电机的协同工作，实现快速进样以及抑制过压和湍流现象的产生。本装置是目前可以实现毫\微秒分辨液相反应动力学光谱及电化学谱同步测量的装置，相比较现有商品化仪器可以对混合液的流动实现更精确地控制，可以在一次测量中得到更全面的关键动力学参数，对不同的复杂体系反应动力学具有更大的普适性。

一种同步测量液相反应动力学光谱及电化学谱的方法，方法包括以下步骤：

1)测量背景谱：化学液进样系统和废液存储系统协同工作，将缓冲溶液注入样品池6内，探测光入射系统发射设定波长的探测光至样品池6内，通过液相反应动力学光谱测量系统和电化学测量仪10-1同步测量缓冲溶液的光谱和电化学谱作为背景信号；

2)测量实验谱：化学液进样系统和废液存储系统协同工作，将待测样注入样品池6内，通过液相反应动力学光谱测量系统和电化学测量仪10-1进行光谱信号和电化学谱信号的同步采集；

3)通过计算机及时序控制系统12进行数据处理，可得到同步光谱和电化学谱图。

液相反应动力学光谱测量系统包括沿反应液流动方向设置的吸收光强探测器9-1和沿垂直于反应液流动方向设置的荧光光强探测器9-2，吸收光强探测器9-1测量反应液的吸收光谱，荧光光强探测器9-2测量反应液荧光光谱，化学液进样系统和废液存储系统的停止工作的时间相对于吸收光强探测器9-1、荧光光强探测器9-2和电化学测量仪10-1的测量时间有延时，这样可以保证信号采集的完整性。

本发明通过自主设计的样品池，可以实现吸收光谱、荧光光谱和电化学谱的同步测量，具有更加广泛应用前景，例如光催化反应中离子浓度或ph值的改变；进样伺服电机和废液伺服电机通过协同工作，搭配我们自主设计的样品池，可以有效防止过压和湍流效应的产生，从而可以实现更加快速的溶液进样和进样停止操作，从而测得更加准确的动力学参数；独立控制的管线恒温槽温度和样品池温度，一方面确保反应液的存储温度和化学反应发生的温度独立控制，另一方面半导体制冷片可以更加快速的改变样品池中反应液的温度，可应用于需要温度突变的反应中，更真实的模拟生化反应进行的条件。

以上所述仅为本发明的实施方式，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进、扩展等，均包含在本发明的保护范围内。