通过二维液相对单抗类产品细胞株进行高通量筛选的方法与流程

本发明涉及一种通过二维液相对单抗类产品细胞株进行高通量筛选的方法，属于抗体类产品包括单克隆抗体与融合蛋白分析技术领域。

背景技术：

现如今，单克隆抗体(简称“单抗”)得到了大规模生产与广泛应用，尤其是治疗性单抗，而如何在抗体工艺开发之前筛选出能够分泌物理化学性质均足够稳定的单克隆抗体的细胞株，成为工艺开发的关键起始点。现阶段，在抗体类产品研发及生产企业中，想要得到某细胞株所分泌的单抗的多聚物含量数据，必须依次手工先后完成两步实验：首先收集捕获细胞培养液中的单抗，其次再将捕获到的单抗作为样品，使用其它色谱分析，得出反应单抗理化性质的分析结果，整个过程耗时数天的时间，并伴随着大量人力与组织内协调的需求，费时费力，且由于冗长的样品处理与储存步骤，加大了样品发生降解的概率，降低了分析结果的准确性。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种通过二维液相对单抗类产品细胞株进行高通量筛选的方法，提高了筛选的效率，节省了人力，且由于避免了冗长的样品处理与储存步骤，避免了样品发生降解的可能，提高了分析结果的准确性。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：通过二维液相对单抗类产品细胞株进行高通量筛选的方法，包括通过二维液相对单抗类产品进行检测，所述单抗类产品是贝伐珠单抗，具体包括以下步骤:

(1)第一维液相色谱进行分离：

色谱条件为：采用亲和色谱柱，以添加有洗脱剂的ph值为6.3-7.3的缓冲溶液为流动相a，以ph值为2.5-3.5的缓冲溶液为流动相b，流速为0.3-0.5ml/min，检测波长为280nm，梯度洗脱条件为：0～3min，0％b；3～3.1min，0％～100％b；3.1～6min，100％b；6～6.1min，100％～0％b；6.1～10min，0％b。

(2)第二维液相色谱进行检测：将第一维液相色谱按照保留时间切割所得的馏分引流到第二维液相色谱，进行检测：

色谱条件为：采用尺寸排阻色谱柱，以有添加剂的ph值为5.5-6.5的缓冲溶液为流动相，流速为0.5-1.0ml/min，检测波长为280nm，等度洗脱。

进一步地，所述步骤(2)中，所述尺寸排阻色谱柱的规格为2.1×150mm，填充粒径为1.7μm。使样品具有好的分离效果。

进一步地，所述步骤(2)中，所述尺寸排阻色谱柱的规格为4.6×250mm，填充粒径为2.0μm。使样品分离效果较好。

进一步地，所述步骤(2)中，所述添加剂为90-110mmol/l的nacl。提高样品的分离效果。

进一步地，所述步骤(2)中，所述流动相的缓冲溶液为ph＝6.0、浓度为50mmol/l的na2hpo4缓冲溶液。使样品的峰形较好。

进一步地，所述步骤(1)中，所述亲和色谱柱的规格为2.1×50mm，填充粒径为1.7-12μm。使抗体分离效果较好。

进一步地，所述步骤(1)中，所述流动相a的缓冲溶液为ph＝6.8、浓度为50mmol/l的tris-hcl缓冲溶液。使峰形较佳，从而具有好的分离效果。

进一步地，所述步骤(1)中，所述洗脱剂为40-60mmol/l的nacl。

进一步地，所述步骤(1)中，所述流动相b的缓冲溶液为ph＝3.0的缓冲溶液，其由0.1mol/l的甘氨酸加入hcl制得。使抗体具有好的分离效果。

本发明的有益效果在于:通过二维液相对单抗类产品进行检测的方法，使整个检测过程缩短至数十分钟，显著提高了分析检测的效率，节省了大量人力，且由于避免了冗长的样品处理与储存步骤，避免了样品发生降解的可能，提高了分析结果的准确性，进而提高了后续单抗类产品细胞株筛选的效率，实现了对单抗类产品细胞株进行高通量筛选的目的。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为实施例三中二维液相对贝伐珠单抗进行检测的第一维液相色谱图；

图2为实施例三中二维液相对贝伐珠单抗进行检测的第二维液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

贝伐珠单抗的细胞株于添加了4mmol/l的谷氨酸的sfmⅰⅰ培养基中，将培养基用0.2μm的过滤膜过滤掉细胞及其它较大的颗粒，制得待测样品。

通过二维液相对贝伐珠单抗进行检测，以对贝伐珠单抗细胞株进行高通量筛选，第一维液相色谱进行分离的条件为：采用亲和色谱柱，以添加有40mmol/lnacl洗脱剂的ph值为6.3的tris-hcl缓冲溶液为流动相a，以ph值为2.5的缓冲溶液为流动相b，流速为0.3ml/min，柱温为25℃，检测波长为280nm，梯度洗脱条件为：0～3min，0％b；3～3.1min，0％～100％b；3.1～6min，100％b；6～6.1min，100％～0％b；6.1～10min，0％b；第二维液相色谱进行检测的条件为：采用尺寸排阻色谱柱，以有添加剂的ph值为5.5的na2hpo4缓冲溶液为流动相，流速为0.5ml/min，检测波长为280nm，柱温为25℃，等度洗脱。由第一维液相色谱的进样阀进样，进样量为10μg，当第一维液相色谱保留时间达到6.00min时，通过切换阀，将馏分引流到第二维液相色谱进行检测，当第一维液相色谱保留时间达到9.00min时，将切换阀重新切回至第一维液相色谱。

尺寸排阻色谱柱的规格为2.1×150mm，填充粒径为1.7μm。

添加剂为90mmol/l的nacl。

亲和色谱柱的规格为2.1×50mm，填充粒径为1.7μm。

第一维液相色谱分离的条件中，流动相b的缓冲溶液为0.1mol/l的甘氨酸加入hcl制得。

实验结果表明：贝伐珠单抗在第二维尺寸排阻色谱柱上分离效果较好。

实施例二

贝伐珠单抗的细胞株于添加了4mmol/l的谷氨酸的sfmⅰⅰ培养基中，将培养基用0.2μm的过滤膜过滤掉细胞及其它较大的颗粒，制得待测样品。

通过二维液相对贝伐珠单抗进行检测，以对贝伐珠单抗细胞株进行高通量筛选，第一维液相色谱进行分离的条件为：采用亲和色谱柱，以添加有60mmol/lnacl洗脱剂的ph值为7.3的tris-hcl缓冲溶液为流动相a，以ph值为3.5的缓冲溶液为流动相b，流速为0.5ml/min，检测波长为280nm，柱温为25℃，梯度洗脱条件为：0～3min，0％b；3～3.1min，0％～100％b；3.1～6min，100％b；6～6.1min，100％～0％b；6.1～10min，0％b；第二维液相色谱进行检测的条件为：采用尺寸排阻色谱柱，以有添加剂的ph值为6.5的na2hpo4缓冲溶液为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温为25℃，等度洗脱。由第一维液相色谱的进样阀进样，进样量为20μg，当第一维液相色谱保留时间达到6.00min时，通过切换阀，将馏分引流到第二维液相色谱进行检测，当第一维液相色谱保留时间达到9.00min时，将切换阀重新切回至第一维液相色谱。

尺寸排阻色谱柱的规格为4.6×250mm，填充粒径为2.0μm。

添加剂为110mmol/l的nacl。

亲和色谱柱的规格为2.1×50mm，填充粒径为5μm。

第一维液相色谱分离的条件中，流动相b的缓冲溶液为0.1mol/l的甘氨酸加入hcl制得。

实验结果表明：贝伐珠单抗在第二维尺寸排阻色谱柱上分离效果较好。

实施例三

贝伐珠单抗的细胞株于添加了4mmol/l的谷氨酸的sfmⅰⅰ培养基中，将培养基用0.2μm的过滤膜过滤掉细胞及其它较大的颗粒，制得待测样品。

通过二维液相对贝伐珠单抗进行检测，以对贝伐珠单抗细胞株进行高通量筛选，第一维液相色谱进行分离的条件为：采用亲和色谱柱，以添加有50mmol/lnacl洗脱剂的ph值为6.8的tris-hcl缓冲溶液为流动相a，以ph值为3.0的缓冲溶液为流动相b，流速为0.5ml/min，检测波长为280nm，柱温为25℃，梯度洗脱条件为：0～3min，0％b；3～3.1min，0％～100％b；3.1～6min，100％b；6～6.1min，100％～0％b；6.1～10min，0％b；第二维液相色谱进行检测的条件为：采用尺寸排阻色谱柱，以有添加剂的ph值为6.0的na2hpo4缓冲溶液为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温为25℃，等度洗脱。

尺寸排阻色谱柱的规格为4.6×250mm，填充粒径为2.0μm。

添加剂为100mmol/l的nacl。

第二维液相色谱进行检测的条件中，na2hpo4缓冲溶液的浓度为50mmol/l。

亲和色谱柱的规格为2.1×50mm，填充粒径为12μm。

第一维液相色谱分离的条件中，流动相a的缓冲溶液为浓度为50mmol/l的tris-hcl缓冲溶液，流动相b的缓冲溶液为0.1mol/l的甘氨酸加入hcl制得。

由第一维液相色谱的进样阀进样，进样量为20μg，当第一维液相色谱保留时间达到7.00min时，通过切换阀，将馏分引流到第二维液相色谱进行检测，当第一维液相色谱保留时间达到8.50min时，将切换阀重新切回至第一维液相色谱，第一维液相色谱谱图和第二维液相色谱谱图分别见图1和图2.

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。