一种贝类水产品表面孔雀石绿的现场快速检测方法与流程

本发明涉及食品安全分析检测领域，尤其涉及一种贝类水产品表面残留孔雀石绿的现场快速检测方法。

背景技术：

孔雀石绿，作为一种三氯甲烷类染料，常用于水产养殖和运输中的杀菌剂使用。然而，由于其具有致癌、致畸变的副作用，我国农业部将其放入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，明确规定孔雀石绿在水产养殖和运输中禁止使用。然而由于孔雀石绿能够有效的防止水产品获病而死亡，因此不良商家为了追求经济效益仍然在养殖和运输过程中使用孔雀石绿。目前，水产品中孔雀石绿的检测方法主要包括高效液相色谱法、色谱联用质谱法以及表面增强拉曼光谱法等。上述方法具有样品前处理步骤繁琐、需要大型仪器设备以及耗时等缺点。水产品具有快速运输和销售的市场特点，上述方法显然无法满足对水产品的孔雀石绿的现场快速检测需求。

表面增强光谱(surfaceenhancedramanspectroscopy,sers)技术作为一种新兴的光谱分析技术，具有灵敏度高、特异性好、检测时间短，无需复杂样品预处理等优点。目前已广泛应用于多种食品中违禁添加剂的快速分析和检测。目已有研究人员使用多种sers基底对水体中和水产品养殖水中的孔雀石绿进行了检测。然而对于贝类水产品这种具有复杂形状的水产品，采用现有技术的方法检测其表面残留的孔雀石存在技术难度。目前尚未见使用sers技术对其表面残留的孔雀石绿进行检测的研究。

技术实现要素：

为弥补现有技术的空白，本发明提供一种贝类水产品表面孔雀石绿的现场快速检测方法。本发明利用界面自组装技术将金纳米立方组装在滤纸上得到具有样品提取功能的滤纸sers基底，然后使用该基底对贝类水产品表面的孔雀石绿进行了原位提取和检测。本发明为贝壳类水产品表面污染物的快速检测提供了一种简便实用的分析方法。

为达到这一技术目的，本发明采用的技术方案是：一种贝类水产品表面孔雀石绿的现场快速检测方法，首先，利用种子生长法制备尺寸均一、形貌规则的金纳米立方。其次，将水中分散的金纳米立方转移到乙醇中。然后，使用液/液界面自组装技术构筑金纳米立方单层膜并将其转移到滤纸上制备得到滤纸sers基底。最后将该基底用于贝类表面孔雀石绿的采集和检测。

本发明首要目的是请求保护一种表面增强光谱基底的制备方法，包括以下步骤：

s1.1在阳离子表面活性剂体系下，使用三步种子生长法制备得到不同尺寸的金纳米立方；所述的阳离子表面活性剂体系为：在5单位体积浓度为0.2m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中加入5单位体积浓度为0.5mm的氯金酸溶液混合，然后加入0.6单位体积浓度为10mm的硼氢化钠水溶液，得到种子溶液；将该种子溶液加入到含有0.25mm氯金酸、50mm十六烷基三甲基氯化铵(ctac)和0.325mm抗坏血酸(aa)混合液中继续生长，得到金纳米立方；

s1.2使用多步离心和分散的方法将金纳米立方表面的阳离子表面活性剂替换为聚乙烯比咯烷酮(pvp)，并将水中分散的金纳米立方替换到乙醇中分散。

s1.3将步骤s1.2得到的金纳米立方乙醇溶液与二氯甲烷混合，依次加入水和正己烷，使液液界面上得到金立方单层膜；将正己烷抽走，取滤纸浸入金立方单层膜下面，随后缓慢将滤纸抽出，金立方单层膜便组装在滤纸上，得到滤纸sers基底。

本发明另一个目的是请求保护采用上述方法制备的滤纸sers基底对贝类水产品表面孔雀石绿的现场快速检测方法，包括以下步骤：

s1.首先使用滤纸sers基底的边缘蘸取待测贝类水产品的表面和沟壑处，进行样品的提取，然后，使用拉曼光谱仪照射在滤纸sers基底上进行拉曼光谱采集；

s2.以孔雀石绿1617cm^-1处的特征峰作为研究对象，拟合特征峰强度和孔雀石绿浓度之间的依赖关系，获得拟合曲线；

s3.进行实际检测时，首先获得待测样品的滤纸sers光谱，然后根据步骤s2中得到的拟合曲线计算出实际样品中孔雀石绿的含量；

所述的拟合曲线为y＝261.62x-446.09r²＝0.99459其中x为孔雀石绿的浓度，y为光谱强度。

进一步的，所述步骤s1.2具体为：首先取10ml制备得到的金纳米立方溶液离心并分散到10ml，1mm的ctac水溶液中；然后将其再次离心并分散在1ml，质量分数1％的pvp乙醇溶液中；最后，对其再次离心并将金纳米立方分散于乙醇中。

进一步的，所述步骤s1.3具体为：首先在离心管中将金纳米立方乙醇溶液与二氯甲烷按体积比1:4混合，向其中加入水并缓慢震荡，静置片刻，然后向其中加入正己烷，金纳米立方移动到水/正己烷的界面上得到金立方单层膜；将正己烷抽走并静置30秒后，取滤纸浸入金立方单层膜下面，随后缓慢将滤纸抽出，金立方单层膜便组装在滤纸上得到滤纸sers基底。

进一步的，上述方法中所述的贝类水产品包括腹足纲、瓣鳃纲及头足纲等不同种类。例如海螺、扇贝、花蛤、蛏子、牡蛎、海虹等。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明制备的金纳米立方形状规则、尺寸均一，能够为高均匀性sers基底的构筑提供组装单元。

2.本发明制备的滤纸sers基底具有优异的液体传导和样品提取功能，对样品进行实际检测时，无需额外的样品提取步骤，大大简化检测流程。

3.本发明方法提供了一种简便快捷的贝类水产品表面孔雀石绿的检测技术。

附图说明

图1为制备的不同尺寸金纳米立方的扫描电镜图；图1a为23nm金立方的sem图，图1b为39nm金立方的sem图，图1c为63nm金立方的sem图，图1d为23nm、39nm、63nm三个尺寸金立方的吸收光谱图；

图2为金纳米立方滤纸sers基底的扫描电镜图；图2a为低倍的sem图，图2b为高倍的sem图；

图3为扇贝表面孔雀石绿检测的实物图；

图4为检测不同浓度孔雀石绿掺杂样品的sers光谱图；

图5为孔雀石绿浓度与sers特征峰强度之间的拟合曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。

实施例1

使用三步种子生长法制备金纳米立方，包含如下步骤：

第一步，向5ml，0.2m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)水溶液中加入与5ml，0.5mm的氯金酸。用冰水浴制备浓度为0.01m的硼氢化钠水溶液，取600μl加入ctab和氯金酸的混合溶液中并剧烈搅拌两分钟，将该种子溶液于室温下静置三小时用于下一步的生长。

第二步，将0.5mm，6ml的氯金酸、0.2m，6ml的十六烷基三甲基氯化铵(ctac)以及4.5ml，0.1m的抗坏血酸混合并均匀搅拌得到生长液。向生长液中加入0.15ml第一步制备的种子溶液，温和搅拌15分钟后，将所得种子溶液(约16.5ml)以15500rpm的转速离心30分钟，抽走上清液并将种子分散到3ml的水中得到10nm的种子溶液。

第三步，将0.1m，20ml的ctac、10mm，0.13ml的aa以及0.5mm，20ml的氯金酸均匀混合得到生长液，向其中分别加入50～1000μl的10nm种子溶液得到不同尺寸的金纳米立方。图1中a～c分别为加入1000μl、100μl和50μl的10nm种子制备得到的金纳米立方，图1d分别为三个尺寸金立方的消光光谱图。

实施例2

使用界面自组装方法制备滤纸sers基底包含如下步骤：

a)取10ml实施例1制备得到的金纳米立方溶液离心并分散到10ml，1mm的ctac水溶液中，然后将其再次离心并分散在1ml，质量分数1％的pvp乙醇溶液中。最后，对其再次离心并将金纳米立方分散于乙醇中。

b)在5ml离心管中将200μl金纳米立方乙醇溶液与800μl二氯甲烷混合，然后向其中加入2ml水并缓慢震荡10次。静置片刻，向其中加入正己烷，金纳米立方便自发移动到水/正己烷的界面上得到金立方单层膜。将正己烷抽走并静置30秒后，用镊子夹住滤纸浸入金立方单层膜下面，随后缓慢将滤纸抽出，金立方单层膜便组装在滤纸上，晾干后便得到滤纸sers基底。图2为滤纸sers基底的扫描电镜图。

实施例3

a)模拟已残留一定浓度的贝类水产品样品，制备掺杂确定浓度孔雀石绿的贝类水产品样品，将扇贝浸泡在浓度为1×10^-7～1×10^-5m的孔雀石绿水溶液中30分钟后捞出。

b)使用滤纸sers基底的边缘蘸取扇贝的表面和沟壑处进行样品的提取，样品提取示意图如图3所示。然后使用拉曼光谱仪照射在滤纸上组装了金纳米立方的区域进行光谱采集，获得不同浓度掺杂样品的sers光谱，如图4所示。以1617cm^-1处的特征峰作为研究对象，拟合特征峰强度和孔雀石绿浓度之间的依赖关系，获得拟合曲线如图5所示。

y＝261.62x-446.09r²＝0.99459其中x为孔雀石绿的浓度，y为光谱强度。

进行实际检测时，首先获得待测样品的sers光谱，然后对比拟合曲线进一步计算出待测样品中孔雀石绿的含量。

应用例

从大连某海域采集扇贝、花蛤、蛏子、牡蛎等样品，共100件，使用浓度分别为2.5×10^-7m，2.5×10^-6m和2.5×10^-5m的结晶紫水溶液浸泡贝类得到掺杂样品。按照实施例2提供的方法制备滤纸sers基底。

使用滤纸sers基底的边缘蘸取扇贝的表面和沟壑处进行样品的提取。然后使用拉曼光谱仪照射在滤纸上组装了金纳米立方的区域进行光谱采集，获得不同浓度掺杂样品的sers光谱，将测得特征峰强度带入线性方程y＝261.62x-446.09中计算出测量浓度值，计算浸泡在2.5×10^-7m结晶紫溶液中的样品上结晶紫的浓度为2.522×10^-7m，2.488×10^-7m和2.484×10^-7m，对应回收率分别为100.88％,99.56％,和99.36％。计算浸泡在2.5×10^-6m结晶紫溶液中的样品上结晶紫的浓度为2.566×10^-6m，2.531×10^-6m和2.517×10^-6m，对应回收率分别为102.64％，101.24％和100.68％。计算浸泡在2.5×10^-5m结晶紫溶液中的样品上结晶紫的浓度为2.512×10^-5m，2.493×10^-5m和2.486×10^-5m，对应回收率分别为102.64％，99.72％和99.88％。

综上述实施例可以看出，本发明提到的sers基底制备方法和孔雀石绿的检测方法操作简单，可行性高，利于推广，为贝类水产品表面孔雀石绿的现场快速检测提供了一种领先技术。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。