一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及检测试剂盒与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及检测试剂盒。

背景技术：

高密度脂蛋白胆固醇(以下简称hdl-c)是指高密度脂蛋白分子所携的胆固醇，是逆向转运的内源性胆固醇酯，将其运入肝脏，再清除出血液。因此，hdl-c能够抗动脉粥样硬化，可减少患冠状动脉心脏病的危险。

现有技术中，hdl-c的测定方法主要包括免疫分离法、多聚阴离子遮蔽法和酶修饰法等，这些方法均采用终点法测定，终点法测定易受血清本底干扰，而且反应时间长，至少需要5min，大大影响了结果的准确性和测定效率。

综上可知，现有技术在实际应用中显然存在不足之处，有必要加以改进。

技术实现要素：

针对上述技术缺陷，本发明的目的在于提供一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及检测试剂盒，其采用速率测定法，能够排除血清本底的干扰，提高检测准确度，同时缩短反应时间，提高反应效率。

为了实现上述目的，本发明提供一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，所述检测方法采用速率测定法，设置主波长500～546nm，在主波长500～546nm处，反应体系中吸光度的的升高速率与样本中高密度脂蛋白胆固醇的活性成正比，延迟60～90s，然后测定60～150s的吸光度升高速率，得到高密度脂蛋白胆固醇的浓度；

检测步骤如下：

a取空白管、标准管及样本管，三种管中都分别加入酶试剂1，然后在空白管、标准管及样本管内对应加入相同体积的蒸馏水、标准液及样本，混匀后孵育3～5min；再向三种管中都分别加入酶试剂2，混匀，得到反应液；

b所述反应液延迟60～90s后，在主波长500～546nm处读取吸光度，反应60s后再读取吸光度，计算平均吸光度变化率，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率；

c计算高密度脂蛋白胆固醇的浓度。

根据本发明的一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，所述酶试剂1包括胆固醇氧化酶和过氧化物酶，所述胆固醇氧化酶的酶活力为1.4～1.8ku/l，所述过氧化物酶的酶活力为1.8～2.2ku/l。

根据本发明的一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，所述酶试剂2包括胆固醇脂酶，所述胆固醇脂酶的酶活力为1.8～2.2ku/l。

根据本发明的一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，所述酶试剂1与所述酶试剂2的体积比为2.8～3.3:1。

根据本发明的一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，所述酶试剂1和酶试剂2的总体积与所述样本的体积比为100～120：1。

根据本发明的一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，所述检测方法还设置副波长700～800nm。

根据本发明的一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，所述标准液的浓度为2～4mmol/l。

根据本发明的一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，本发明还提供一种用于所述检测方法的检测试剂盒。

根据本发明的一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括酶试剂1和酶试剂2，所述酶试剂1与所述酶试剂2的体积比为2.8～3.3:1。

根据本发明的一种检测试剂盒，所述酶试剂1包括胆固醇氧化酶和过氧化物酶，所述胆固醇氧化酶的酶活力为1.4～1.8ku/l，所述过氧化物酶的酶活力为1.8～2.2ku/l。

根据本发明的一种检测试剂盒，所述酶试剂2包括胆固醇脂酶，所述胆固醇脂酶的酶活力为1.8～2.2ku/l。

本发明的有益效果为：

1、本发明采用速率测定法，测定的是反应的速率，在反应过程中的线性期进行读数，不同于终点测定法，可以排除样本本底的干扰，提高了结果的准确度。

2、本发明采用速率测定法，延迟时间短，读数时间也很短，使整个反应时间由原来的5～10min缩短为2～3min，提高了试验效率。

3、本发明操作简便，仪器参数设置简单，降低了高密度脂蛋白胆固醇的检测技术难度。

4、本发明除主波长外还设置副波长，在副波长700～800nm处测定高密度脂蛋白胆固醇的浓度；使用双波长进行检测，即能够消除样本本底的噪音等物理干扰，也能够消除其他特异性干扰和非特异性干扰。

5、本发明的检测试剂盒能够用于全自动生化分析仪、半自动生化分析仪等，适用范围广；同时可直接上机使用，无需再经过稀释等其他操作。

附图说明

图1是现有技术测定的反应曲线；

图2为本发明实施例1测定的反应曲线；

图3为本发明实施例2测定的反应曲线；

图4为本发明实施例3测定的反应曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法，采用速率测定法，设置主波长500～546nm，在主波长500～546nm处，反应体系中吸光度的的升高速率与样本中高密度脂蛋白胆固醇的活性成正比，延迟60～90s，然后测定60～150s的吸光度升高速率，得到样本中高密度脂蛋白胆固醇的浓度。

使用速率测定法测定的是反应的速率，在反应过程中的线性期进行读数，可以排除样本本底的干扰，提高了结果的准确度；延迟时间短，读数时间也很短，这样就使整个反应时间大大缩短，由原来的5～10min缩短为2～3min，提高了试验效率；操作简便，仪器参数设置简单，降低高密度脂蛋白胆固醇的检测技术难度；能够适用于各种全自动、半自动生化分析仪及分光光度计，适用范围广。

检测步骤如下：

a取空白管、标准管及样本管，三种管中都分别加入酶试剂1，然后在空白管、标准管及样本管内对应加入相同体积的蒸馏水、标准液及样本，混匀，37℃条件下孵育3～5min；再向三种管中都分别加入酶试剂2，混匀，得到反应液。

b反应液在37℃条件下延迟60～90s后，在主波长500～546nm处读取吸光度a1，再反应60s后读取吸光度a2，计算平均吸光度变化率δa/min，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率。

c计算高密度脂蛋白胆固醇的浓度

酶试剂1包括胆固醇氧化酶和过氧化物酶，胆固醇氧化酶的酶活力为1.4～1.8ku/l、过氧化物酶的酶活力为1.8～2.2ku/l，胆固醇氧化酶和过氧化物酶的体积比为0.8～1.2:1；酶试剂2包括胆固醇脂酶，胆固醇脂酶的酶活力为1.8～2.2ku/l；酶试剂1与酶试剂2的体积比为2.8～3.3:1。

标准液为高密度脂蛋白胆固醇溶液，浓度为2～4mmol/l。

样本为新鲜不溶血血清或者血浆；样本在2～8℃条件下可稳定存放6～8天，-20℃条件下可稳定存放30～35天。

酶试剂1和酶试剂2的总体积与样本的体积比为100～120：1。

反应方向为正反应。

本发明除了在主波长500～546nm处测定高密度脂蛋白胆固醇的浓度，还在副波长700～800nm处测定高密度脂蛋白胆固醇的浓度；使用双波长进行检测，主要读取主波长-副波长的反应线的吸光度变化率，即能够消除样本本底的噪音等物理干扰，也能够消除其他特异性干扰和非特异性干扰。

本发明还提供了一种用于上述检测方法的检测试剂盒，包括酶试剂1和酶试剂2；酶试剂1包括胆固醇氧化酶和过氧化物酶，胆固醇氧化酶的酶活力为1.4～1.8ku/l、过氧化物酶的酶活力为1.8～2.2ku/l，胆固醇氧化酶和过氧化物酶的体积比为0.8～1.2:1；酶试剂2包括胆固醇脂酶，胆固醇脂酶的酶活力为1.8～2.2ku/l；酶试剂1与酶试剂2的体积比为2.8～3.3:1。

使用方法：可用于全自动生化分析仪、半自动生化分析仪等；可直接上机使用，无需再经过稀释等其他操作。

储存条件及有效期为：保存条件为2～8℃，有效期为12个月。

为获取最佳实施方式，本发明设置如下若干实施例；以下实施例仅列出与上述步骤中不同的部分，相同内容不再列出。

实施例1

a取空白管、标准管及样本管，三种管中都分别加入酶试剂1，然后在空白管、标准管及样本管内对应加入相同体积的蒸馏水、标准液及样本，混匀后孵育3～5min；再向三种管中都分别加入酶试剂2，混匀，得到反应液；

b所述反应液延迟60～90s后，在主波长500～546nm处读取吸光度，反应60s后再读取吸光度，计算平均吸光度变化率，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率；

c计算高密度脂蛋白胆固醇的浓度。

胆固醇氧化酶的酶活力为1.58ku/l，过氧化物酶的酶活力为1.84ku/l，胆固醇脂酶的酶活力为1.92ku/l，酶试剂1与酶试剂2的体积比为3.12：1，酶试剂1和酶试剂2的总体积与样本的体积比为109:1。

以上述方法测定高密度脂蛋白胆固醇的反应曲线见图2。

实施例2

a取空白管、标准管及样本管，三种管中都分别加入酶试剂1，然后在空白管、标准管及样本管内对应加入相同体积的蒸馏水、标准液及样本，混匀后孵育3～5min；再向三种管中都分别加入酶试剂2，混匀，得到反应液；

b所述反应液延迟60～90s后，在主波长500～546nm处读取吸光度，反应60s后再读取吸光度，计算平均吸光度变化率，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率；

c计算高密度脂蛋白胆固醇的浓度。

胆固醇氧化酶的酶活力为1.6ku/l，过氧化物酶的酶活力为1.95ku/l，胆固醇脂酶的酶活力为1.87ku/l，酶试剂1与酶试剂2的体积比为2.89：1，酶试剂1和酶试剂2的总体积与样本的体积比为113:1。

以上述方法测定高密度脂蛋白胆固醇的反应曲线见图3。

实施例3

a取空白管、标准管及样本管，三种管中都分别加入酶试剂1，然后在空白管、标准管及样本管内对应加入相同体积的蒸馏水、标准液及样本，混匀后孵育3～5min；再向三种管中都分别加入酶试剂2，混匀，得到反应液；

b所述反应液延迟60～90s后，在主波长500～546nm处读取吸光度，反应60s后再读取吸光度，计算平均吸光度变化率，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率；

c计算高密度脂蛋白胆固醇的浓度。

胆固醇氧化酶的酶活力为1.66ku/l，过氧化物酶的酶活力为2.03ku/l，胆固醇脂酶的酶活力为2.12ku/l，酶试剂1与酶试剂2的体积比为3.04：1，酶试剂1和酶试剂2的总体积与样本的体积比为116:1。

以上述方法测定高密度脂蛋白胆固醇的反应曲线见图4。

其它实施例的执行过程不再赘述，得到的反应曲线也不再逐一列出，各实施例其它未示出部分的数据见表一。

表一各实施例的数据

以上述方法测定高密度脂蛋白胆固醇，得到了反应曲线，从本发明列出的图2、图3和图4的反应曲线中可以看出，在60s以内，主波长、副波长均出现波动，延迟60s以后线性关系良好，60s～90s以后即可取吸光度，再反应60s后读取下一个吸光度，计算平均吸光度变化率后可以计算出高密度脂蛋白胆固醇的浓度，总共耗时2～3min。

从图2、图3和图4中还可以看出，在60s以内，主波长、副波长均出现波动，但是主波长-副波长在整个反应时间段内的线性关系良好，说明在700～800nm处设置副波长具有消除血清本底干扰的作用，提高检测的准确度。

从图1中看出，现有技术采用终点法测定高密度脂蛋白胆固醇，得到的反应曲线中显示，在5min时反应依然没有完全达到终点，线性关系不好，检测时间需大于5min；本发明与现有技术相比较，缩短了试验时间，提高了试验效率和检测结果的准确度。

综上所述，本发明采用速率测定法，测定的是反应的速率，在反应过程中的线性期进行读数，不同于终点测定法，可以排除样本本底的干扰，提高了结果的准确度；本发明采用速率测定法，延迟时间短，读数时间也很短，使整个反应时间由原来的5～10min缩短为2～3min，提高了试验效率；本发明操作简便，仪器参数设置简单，降低了高密度脂蛋白胆固醇的检测技术难度；本发明除主波长外还设置副波长，在副波长700～800nm处测定高密度脂蛋白胆固醇的浓度，使用双波长进行检测，即能够消除样本本底的噪音等物理干扰，也能够消除其他特异性干扰和非特异性干扰；本发明的检测试剂盒能够用于全自动生化分析仪、半自动生化分析仪等，适用范围广，同时可直接上机使用，无需再经过稀释等其他操作。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。