一种负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒及其制备方法和应用与流程

本发明属于高分子材料及生物医药领域，具体涉及一种负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒及其制备方法和应用。

背景技术：

痕量序列特异性dna的灵敏、高效检测在临床诊断、食品分析、生物恐怖主义和环境监测中均具有重要意义。常用的dna检测技术包括荧光比色检测法、分子印迹法、聚合酶链式扩增反应(pcr)和dna微阵列，然而这些方法的应用往往受限于复杂的实验步骤、昂贵的仪器设备以及有限的灵敏度，有些方法难以对低丰度核酸样品进行高灵敏、低成本检测。

近些年来，提出了许多代替pcr技术以实现dna灵敏检测的方法，例如荧光标记、电化学免疫传感器、有机电化学晶体管免疫传感器、表面等离子体共振和电化学发光适体传感器，使用与光学、电化学技术结合的酶、指示剂、纳米材料作为信号放大标记。这些方法中，电化学生物传感器是公认的快速、低廉、小型化的检测装置。尽管这些方法具有较高的灵敏度，但是这些方法通常需要额外的探针修饰或缀合步骤。因此，设计一种更为简单便捷、成本低廉、高灵敏、高特异性的dna检测方法，仍是目前的研究热点。

dna纳米自组装是通过目标-探针杂交进行信号增强的简单而有效的方法。2004年，dirks和pierce首次提出了具有类似pcr灵敏度的dna检测概念：杂交链式反应(hcr)。hcr是一种无酶方法，杂交过程由引发剂(目标dna)引发，使寡核苷酸聚合成长链的dsdna分子。hcr是引发剂引发的反应，极大地降低了背景信号的干扰。另外，hcr可以在温和条件下进行，这些优势使hcr成为dna传感应用中一个优先选择的方法。

本申请制备的fe3o4@c-ni是一种具有类辣根过氧化物酶活性的纳米模拟酶，在其上包被链霉亲和素(sa，streptavidin)之后，与修饰有生物素(biotin)的dna紧密连接，催化tmb底物液，产生电化学信号。

因此，本申请将hcr与电化学生物检测技术相结合，通过fe3o4@c-ni实现hcr与电化学信号之间的转换，hcr增强电化学信号，提高检测灵敏度和特异性。

技术实现要素：

本发明提供一种负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒，该核壳纳米棒具有类过氧化物酶活性，可催化tmb底物液发生氧化还原反应产生电化学信号；该核壳纳米棒包被链霉亲和素后，与修饰有生物素的dna结合，基于该核壳纳米棒的类过氧化物酶活性，将dna的定性与定量检测转换为电化学信号的定性和定量检测，使得dna的检测无需额外的探针修饰或缀合，简单快捷，成本低廉，灵敏度高，特异性好。

本发明还提供一种负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒的制备方法，该方法简便易操作，成本低廉，适合工业化生产。

一种负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒，包括四氧化三铁纳米棒内核与包裹四氧化三铁纳米棒的负镍碳化层外壳，形成棒状核壳纳米材料。

负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒的长度为1～10μm，宽度为80～100nm。

一种负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒的制备方法，步骤包括：

(1)溶有fe-nta络合物、镍盐、多巴胺和碱性化合物的ph＝8～9醇水液螯合生成负镍聚多巴胺层包覆fe-nta络合物的核壳纳米棒(fe-nta@pda-ni²⁺)；

(2)惰性气氛下，负镍聚多巴胺层包覆fe-nta络合物的核壳纳米棒煅烧制得负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒(fe3o4@c-ni)。

步骤(1)的螯合体系中，fe-nta络合物浓度为0.8～2mg/ml，优选为1mg/ml；fe-nta络合物与镍元素的质量比为4.5～6：1，优选为5～5.5：1，更优选为5.3～5.4：1；多巴胺与镍元素的质量比为1～2.5：1，优选为1.5～2：1，更优选为1.6：1。

步骤(1)，螯合的同时搅拌处理，螯合生成的负镍聚多巴胺层包覆fe-nta络合物的核壳纳米棒还进行洗涤处理，具体操作为，无水乙醇和蒸馏水交替洗涤。

步骤(1)，碱性化合物包括三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐，优选为三羟甲基氨基甲烷。

步骤(1)，向溶有fe-nta络合物的醇水液中加入溶有镍盐和多巴胺的醇水液与碱性化合物或溶有碱性化合物的溶液，同时搅拌处理。具体为，先向溶有fe-nta络合物的醇水液中加入碱性化合物或溶有碱性化合物的溶液，再加入溶有镍盐和多巴胺的醇水液；或者先向溶有fe-nta络合物的醇水液中加入溶有镍盐和多巴胺的醇水液，再加入碱性化合物或溶有碱性化合物的溶液；螯合生成负镍聚多巴胺层包覆fe-nta络合物的核壳纳米棒。溶有镍盐和多巴胺的醇水液与碱性化合物或溶有碱性化合物的溶液选择缓慢滴加。

步骤(1)，fe-nta络合物的制备方法包括：将硫酸亚铁铵与次氮基三乙酸溶于水中，水热反应，生成fe-nta络合物。

水热反应体系中，铁元素的浓度为0.15～0.2mol/l，优选为0.16～0.17mol/l；铁元素与次氮基三乙酸的摩尔比为1.5～5：1，优选为2～2.5：1，更优选为2：1。

于150℃～250℃水热反应5～20小时。水热反应温度优选为180℃～200℃，水热反应时间优选为10～15小时，更优选为12小时。

步骤(2)，惰性气氛下，负镍聚多巴胺层包覆fe-nta络合物的核壳纳米棒于500℃～800℃进行煅烧。惰性气氛包括氮气、氦气、氖气或二氧化碳中任意一种或组合。

本申请制备的负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒具有与过氧化物酶相似的催化活性，可用于制备类过氧化物酶或过氧化酶模拟酶，催化过氧化物(尤其是过氧化氢)作为电子受体底物、显色指示剂(如3,3',5,5'-四甲基联苯胺，tmb)作为电子供体的氧化还原反应，通过测定显色指示剂的恒比例氧化产物的紫外吸收光谱，实现过氧化物的定性和/或定量检测。负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒催化tmb底液的氧化还原反应路线如下所示：

负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒基于与过氧化物酶相似的氧化还原活性，还可用于产生过氧化氢的生物活性物质的定性和/或定量检测，生物活性物质包括胆固醇、葡萄糖、抗坏血酸、甘氨酸或组氨酸。生物活性物质氧化生成的过氧化氢，在负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒的催化作用下，与显色指示剂(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，tmb)进行氧化还原反应，通过定性和/或定量测定过氧化氢，进而实现生物活性物质的定性和/或定量测定。

检测过氧化氢时，步骤包括：将含过氧化氢的样品、负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒、显色指示剂和缓冲液混合均匀，在ph＝2～10、25℃～65℃条件下反应5～30分钟；分离负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒，检测反应液的吸收光谱，进行过氧化氢定性和/或定量测定。

优选的，ph＝2～5；较优选的，ph＝3～4，更优选为ph＝4；所述缓冲液为醋酸-醋酸钠、磷酸-磷酸钠或磷酸-磷酸氢钠等，优选为醋酸-醋酸钠。

所述显色指示剂有3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)、邻苯二胺(opd)、2,2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)、发光氨或荧光试剂amplexred，优选为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。所述显色指示剂在检测体系中的含量为0.05～0.2mmol/l，优选为0.1～0.2mmol/l，更优选为0.1mmol/l。

所述负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒在检测体系中的含量为5～100μg/ml，优选为50～100μg/ml，更优选为100μg/ml。

反应温度优选为50℃～60℃，更优选为60℃。

在本发明的一个优选方案中，使用0.2mol/lph＝4的醋酸-醋酸钠缓冲液，显色指示剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，吸收光谱的检测波长为652nm，检测体系中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的含量为0.1mmol/l，负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒的含量为100μg/ml。

电化学生物传感器主要由识别系统和与其密切配合的信号转换系统组成，特异性的待测物与识别系统结合，进行生化反应，生成或放大生化信号；生化信号接着被信号转换系统转换成可定性和/或定量的电学或光学信号。

本申请电化学生物传感器先基于选择性良好、特异性较强的杂交链式反应(hcr)选择性扩增目标dna(targetdna)，完成目标dna的信号放大。再基于生物素-亲和素系统(biotin-avidinsystem，bas)的桥梁作用，在扩增的目标dna上标记过氧化物酶。最后基于过氧化物酶的氧化还原活性，催化过氧化物(尤其是过氧化氢)作为电子受体底物、显色指示剂(如3,3',5,5'-四甲基联苯胺，tmb)作为电子供体的氧化还原反应，形成电流信号，将生化信号转换成直观的、可准确统计的定性和/或定量的电学信号，完成目标dna的定性和/或定量测定。

负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒基于与过氧化物酶相似的氧化还原活性，作为类过氧化物酶或者过氧化酶模拟酶，通过生物素-亲和素系统的桥梁作用，可用于制备电化学生物传感器，将生物信号转换成电学信号，电学信号的产生基于负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒催化的以过氧化物(尤其是过氧化氢)作为电子受体底物、显色指示剂(如3,3',5,5'-四甲基联苯胺，tmb)作为电子供体的氧化还原反应。

一种电化学生物传感器，包括金属电极、附着于金属电极的dna探针(capturedna)、基于dna探针捕获的目标dna(targetdna)扩增形成的扩增目标dna及基于生物素-亲和素系统标记于扩增目标dna上的负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒。dna探针修饰有巯基，通过金属(au)-s键固定附着于金属(au)电极表面，扩增目标dna上修饰生物素(biotin)，负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒上修饰链霉亲和素(streptavidin，sa)。

所述金属电极为金电极。

所述dna探针的dna序列为：5’-ctttaggccaagaattctgctacc-3’，巯基(sh)修饰于5’端。

所述目标dna的dna序列为：5’-atttgctcaacccacataccctgaggtagcagaattcttggcctaaag-3’；为前列腺癌dna。

所述扩增目标dna中含有生物素修饰的发夹结构h1(biotin-h1)和生物素修饰的发夹结构h2(biotin-h2)，生物素修饰的biotin-h1的dna序列为5’-biotin-tttttttcagggtatgtgggttgagcaaatcaaagtatttgctcaacccacata-3’，生物素修饰的biotin-h2的dna序列为5’-atttgctcaacccacataccctgatatgtgggttgagcaaatactttgtttttt-biotin-3’。

该电化学生物传感器基于以过氧化物(尤其是过氧化氢)作为电子受体底物的氧化还原反应产生可供检测的电流信号，例如用于电化学生物检测的含有过氧化氢的tmb底物液，将待检目标dna的检测转换成电流信号的检测，结果更直观、灵敏度更高、选择性和特异性更好。

一种电化学生物传感器的制备方法，步骤包括：(1)将金属电极置于溶有巯基修饰的dna探针和还原剂的pbs溶液中，基于金属-硫元素键固定巯基修饰的dna探针，制备修饰dna探针的金属电极；

(2)将修饰dna探针的金属电极用封闭剂封闭后，再置于目标dna溶液中，制备捕获目标dna的金属电极；

(3)将捕获目标dna的金属电极置于溶有生物素修饰的发夹结构h1和生物素修饰的发夹结构h2的spsc缓冲液中，制备扩增目标dna的金属电极；

(4)将扩增目标dna的金属电极置于亲和素修饰的负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒溶液中，制备标记有负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒的电化学生物传感器。

步骤(1)中，金属电极为金电极，金属电极预先经打磨和清洗处理。

步骤(1)中，还原剂包括硫醇类化合物、三烷基膦类化合物或二硫苏糖醇(dtt)，优选硫醇类化合物三(2-羧乙基)膦(tcep)。

步骤(1)的pbs溶液中，pbs溶质的浓度为6～10mm，优选为8.8mm；巯基修饰的dna探针的浓度为0.8～10μm，优选为1μm；巯基修饰的dna探针与还原剂的摩尔比为1：300～800，优选为1：500。

步骤(1)，将金属电极置于溶有巯基修饰的dna探针和还原剂的pbs溶液中，于室温放置过夜，制备修饰dna探针的金属电极。修饰dna探针的金属电极用pbs溶液反复冲洗并用氮气吹干，pbs溶液的浓度为10mm。

步骤(1)中，巯基修饰的dna探针的dna序列为：5’-sh-ctttaggccaagaattctgctacc-3’。

步骤(2)中，封闭剂包括mch溶液、bsa溶液、吐温-20(tween-20)溶液、马血清溶液或无脂牛奶(no-fatmilk)溶液，优选mch溶液。mch溶液的浓度为0.8～5mm，优选为1mm。bsa溶液的浓度为5wt％，吐温-20溶液的浓度为0.2wt％，马血清溶液的浓度为10wt％，无脂牛奶溶液的浓度为5wt％。

步骤(2)中，目标dna溶液的浓度为1fm～1nm，优选为100fm～1nm。

步骤(2)中，目标dna的dna序列为：5’-atttgctcaacccacataccctgaggtagcagaattcttggcctaaag-3’；为前列腺癌dna。

步骤(3)的spsc缓冲液中，氯化钠的浓度为0.5～1.5mm，优选为0.8～1mm；磷酸氢二钠的浓度为28～50mm，优选为40mm；生物素修饰的发夹结构h1(biotin-h1)和生物素修饰的发夹结构h2(biotin-h2)的浓度均为0.05～1μm，均优选为0.2μm。

步骤(3)中，生物素修饰的发夹结构h1(biotin-h1)的dna序列为5’-biotin-tttttttcagggtatgtgggttgagcaaatcaaagtatttgctcaacccacata-3’；生物素修饰的发夹结构h2(biotin-h2)的dna序列为5’-atttgctcaacccacataccctgatatgtgggttgagcaaatactttgtttttt-biotin-3’。

步骤(4)中，亲和素修饰的负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒溶液的浓度为5～50μg/ml，优选为50μg/ml。

步骤(4)，亲和素修饰的负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒的制备方法包括：将均匀混合有负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒与亲和素的pbs溶液，于30℃～40℃反应，在负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒表面包被亲和素，制备亲和素修饰的负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒。

一种电化学生物检测装置，包括参比电极、对电极和工作电极，及过氧化氢与tmb底物液或含有过氧化氢的tmb底物液，以本申请制备的电化学生物传感器作工作电极。

参比电极为ag/agcl或hg/hgcl，对电极为pt电极。

一种使用电化学生物检测装置进行检测的方法，步骤包括：在含有过氧化氢的tmb底物液中放入参比电极、对电极和本申请制备的电化学生物传感器工作电极，使用循环伏安法进行定性检测，使用时间-电流测定法进行定量检测。参比电极为ag/agcl或hg/hgcl，对电极为pt电极。

本申请的优点在于：本申请制备的负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒具有与过氧化物酶相似的催化活性，可用于制备类过氧化物酶或过氧化酶模拟酶，催化过氧化物(尤其是过氧化氢)作为电子受体底物的氧化还原反应，进行过氧化物(尤其是过氧化氢)的定性和/或定量检测。

基于生物素-亲和素系统的桥梁作用，负镍碳化层包覆四氧化三铁核壳纳米棒与目标nda结合，将生物信号检测转换成基于过氧化物(尤其是过氧化氢)氧化还原反应的电学信号检测，可用于制备电化学传感器及基于该电化学传感器的检测装置，进行目标dna的定性和/或定量检测，并结合杂交链式反应的生物信号放大作用，提高检测的灵敏度。通过该电化学传感器进行检测，选择性高、特异型好，检测结果更直观、更易于准确统计，且更方便、省时、精度高、准确性好。

附图说明

图1为实施例1制备的fe3o4@c-ni的sem图。

图2为实施例2fe3o4@c-ni作为类过氧化物酶的催化效果图。

图3为实施例2不同温度下fe3o4@c-ni的催化效果图。

图4为实施例2不同ph下fe3o4@c-ni的催化效果图。

图5为实施例2不同fe3o4@c-ni用量的催化效果图。

图6为实施例3以h2o2浓度作为变量的fe3o4@c-ni动力学实验测试图。

图7为实施例3以tmb浓度作为变量的fe3o4@c-ni动力学实验测试图。

图8为实施例6裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极的制备路线图。

图9为实施例6至实施例10的各实施例自组装的电化学传感器的循环伏安法(cv)测试结果。

图10为实施例11不同浓度fe3o4@c-ni@sa自组装的au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电化学传感器的电化学检测效果图。

图11为实施例12不同浓度[h1/h2]自组装的au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电化学传感器的电化学检测效果图。

图12为实施例13分别捕获targetdna(au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa)与未捕获targetdna(au/c-dna/mch/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa)的自组装电化学传感器的电化学检测效果图。

图13为实施例14不同浓度targetdna自组装的au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电化学传感器的电化学检测效果图。

图14为实施例15无hcr扩增的不同浓度targetdna自组装的au/c-dna/mch/t-dna/fe3o4@c-ni@sa电化学传感器的电化学检测效果图。

图15为实施例16不同单碱基错配targetdna自组装的au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电化学传感器的电化学检测效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施实例对本发明进行详细说明。

实施例1fe3o4@c-ni的合成

(1)fe-nta络合物的制备

将2.6g六水合硫酸亚铁铵和0.6g次氮基三乙酸均匀溶于40ml水中，于180℃恒温反应720min，降至室温后，过滤取沉淀，用乙醇和蒸馏水交替洗涤数次，得到白色沉淀即为fe-nta。

(2)fe3o4@c-ni的制备

将200mg三羟甲基氨基甲烷均匀溶于5ml水中，形成a溶液。

将15mg多巴胺(da)和37.6mg六水合氯化镍均匀溶于2ml乙醇和1ml水组成的混合溶液中，形成b溶液。

将50mgfe-nta均匀溶于30ml无水乙醇和20ml水组成的混合溶液中，形成c溶液。

搅拌条件下，向c溶液中依次滴加a溶液和b溶液，滴加完毕后，所形成混合溶液ph值大约为8～9，继续搅拌20小时，过滤取沉淀，沉淀用乙醇和蒸馏水交替洗涤数次，得到黑色沉淀即为fe-nta@pda-ni²⁺。

将fe-nta@pda-ni²⁺在氮气保护下煅烧(500℃)，得到fe3o4@c-ni，其sem图如图1所示。

fe3o4@c-ni呈棒状，长度为1～10μm，宽度为80～100nm；四氧化三铁纳米棒位于fe3o4@c-ni棒状体内部，形成fe3o4@c-ni棒状体的内核；负镍碳化层包裹四氧化三铁纳米棒形成fe3o4@c-ni棒状体的外壳。

实施例2fe3o4@c-ni的类过氧化物酶活性

1.类过氧化物酶活性

(1)分别取285μl、290μl、290μl、295μl的0.2mph4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于各离心管中，依次向各离心管中加入6μl、0μl、6μl、0μlfe3o4@c-ni水溶液(5mg/ml)，6μl、6μl、0μl、0μl过氧化氢水溶液(0.01m)，3μl、3μl、3μl、3μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇液(tmb，10mm)，将上述溶液混合均匀；

(2)将步骤(1)制备的混合液在室温下反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。

结果如图2所示，fe3o4@c-ni+tmb+h2o2的紫外吸光度约为tmb+h2o2的二倍，是fe3o4@c-ni+tmb的四倍，单独的tmb几乎可以忽略不计，因此，本实验所合成的纳米材料fe3o4@c-ni具有类过氧化物酶活性。

2.反应温度对fe3o4@c-ni类酶活性的影响

(1)取290μl0.2mph4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于离心管中，依次向离心管中加入6μlfe3o4@c-ni水溶液(1mg/ml)、3μl过氧化氢水溶液(0.1m)、3μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇液(tmb，20mm)，混合均匀，平行制备9份；

(2)将步骤(1)制备的混合液分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。

结果如图3所示，从图中可以看出652nm处的吸光度随着温度的升高，先升高后降低，为了使fe3o4@c-ni在最佳的条件下工作，选择最大吸光度所对应的温度60℃为反应的最佳温度。

3.反应ph对fe3o4@c-ni类酶活性的影响

(1)分别取290μl0.2mph＝2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于各离心管中，依次向各离心管中加入6μlfe3o4@c-ni水溶液(1mg/ml)、3μl过氧化氢水溶液(0.1m)、3μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇液(tmb，20mm)，将上述溶液混合均匀；

(2)将步骤(1)制备的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。

结果如图4所示，从图中可以看出652nm处的吸光度随着ph的升高，先升高后降低，为了使fe3o4@c-ni在最佳的条件下工作，选择最大吸光度所对应的ph＝4.00为反应的最佳ph。

4.fe3o4@c-ni浓度对其类酶活性的影响

(1)平行取7份290μl0.2mph＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于各离心管中，依次向各离心管中加入fe3o4@c-ni水溶液形成不同终浓度(0、5、10、15、20、50、100μg/ml)、6μl过氧化氢水溶液(0.1m)、1.5μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb，10mm)，将上述溶液混合均匀；

(2)将步骤(1)制备的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。

结果如图5所示，从图中明显可以看出fe3o4@c-ni的浓度与652nm波长处的吸光度成线性相关，根据经验，选取20μg/ml作为fe3o4@c-ni溶液的最佳浓度。

实施例3fe3o4@c-ni的动力学实验

1.h2o2实验

[tmb]＝0.20mm

(1)分别平行取5份290μl0.2mph＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于各离心管中，依次向各离心管中加入6μlfe3o4@c-ni水溶液(1mg/ml)、不同浓度的过氧化氢水溶液(终浓度分别为50、100、200、500、1000μm)、3μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇液(tmb，20mm)，将上述溶液混合均匀，平行制备的各混合液中tmb的浓度为0.2mm；

(2)将步骤(1)制备的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱，以不同过氧化氢浓度的倒数为横坐标，以不同反应速度的倒数为纵坐标，绘制米氏常数的求解曲线，如图6所示。

[tmb]＝0.10mm

(1)分别平行取5份290μl0.2mph＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于各离心管中，依次向各离心管中加入6μlfe3o4@c-ni水溶液(1mg/ml)、不同浓度的过氧化氢水溶液(终浓度分别为50、100、200、500、1000μm)、3μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇液(tmb,10mm)，将上述溶液混合均匀，平行制备的各混合液中tmb的浓度为0.1mm；

(2)将步骤(1)制备的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱，以不同过氧化氢浓度的倒数为横坐标，以不同反应速度的倒数为纵坐标，绘制米氏常数的求解曲线，如图6所示。

[tmb]＝0.05mm

(1)分别平行取5份290μl0.2mph＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于各离心管中，依次向各离心管中加入6μlfe3o4@c-ni水溶液(1mg/ml)、不同浓度的过氧化氢水溶液(终浓度分别为50、100、200、500、1000μm)、1.5μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇液(tmb,20mm)，将上述溶液混合均匀，平行制备的各混合液中tmb的浓度为0.05mm；

(2)将步骤(1)制备的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱，以不同过氧化氢浓度的倒数为横坐标，以不同反应速度的倒数为纵坐标，绘制米氏常数的求解曲线，如图6所示。

由图6计算可知，纳米模拟酶fe3o4@c-ni对底物h2o2的米氏常数km＝0.21，最大反应速率vm＝2.64。

2.tmb实验

[h2o2]＝0.10mm

(1)分别平行取5份285μl0.2mph＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于离心管中，依次向离心管中加入6μlfe3o4@c-ni水溶液(1mg/ml)、3μl过氧化氢水溶液(0.01m)、不同浓度的3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇液(终浓度分别为200、300、400、600、800μm)，将上述溶液混合均匀，平行制备的各混合液中h2o2的浓度为0.1mm；

(2)将步骤(1)制备的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱，以不同3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度的倒数为横坐标，以不同反应速度的倒数为纵坐标，绘制米氏常数的求解曲线，如图7所示。

[h2o2]＝0.075mm

(1)分别平行取5份285μl0.2mph＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于各离心管中，依次向各离心管中加入6μlfe3o4@c-ni水溶液(1mg/ml)、3μl过氧化氢水溶液(0.01m)、不同浓度的3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇液(终浓度分别为200、300、400、600、800μm)，将上述溶液混合均匀，平行制备的各混合液中h2o2的浓度为0.075mm；

(2)将步骤(1)制备的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱，以不同3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度的倒数为横坐标，以不同反应速度的倒数为纵坐标，绘制米氏常数的求解曲线，如图7所示。

[h2o2]＝0.05mm

(1)分别平行取5份285μl0.2mph＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于各离心管中，依次向各离心管中加入6μlfe3o4@c-ni水溶液(1mg/ml)、1.5μl过氧化氢水溶液(0.01m)、不同浓度的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(终浓度分别为200、300、400、600、800μm)，将上述溶液混合均匀，平行制备的各混合液中h2o2的浓度为0.05mm；

(2)将步骤(1)制备的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将fe3o4@c-ni与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱，以不同3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度的倒数为横坐标，以不同反应速度的倒数为纵坐标，绘制米氏常数的求解曲线，如图7所示。

由图7计算可知，纳米模拟酶fe3o4@c-ni对底物tmb的米氏常数km＝0.35，最大反应速率vm＝1.13。

实施例4au电极的前处理

(1)电极打磨

在抛光绒布上倒适量的0.05μm氧化铝粉末，铺均匀，垂直au电极在氧化铝粉末中均匀画“8”字，用去离子水(q水)冲洗电极；au置于q水中超声5min，q水冲洗，乙醇溶液中超声5min，q水冲洗，再次于q水中超声5min，q水冲洗，氮气吹干待用。

(2)电极清洗

借助辰华电化学工作站，使用三电极体系进行检测，在0.5mh2so4中清洗电极。

①慢扫(检查金电极清洁度)

电位范围为-0.25-1.5v

扫描速率为0.1v/s

扫描段为2

②快扫(去除电极表面杂质、活化电极)

电位范围为-0.25-1.5v

扫描速率为4v/s

扫描段为60

将打磨后的au电极置于h2so4的电解池中，开始慢扫，如果在1v～1.5v出现三个连续的氧化峰，则证明电极表面干净。如果没有三个连续的氧化峰，则需要进行快扫，多次循环快扫-慢扫，直至出现连续的三个氧化峰。用q水冲洗au电极，氮气(n2)吹干电极以及电极帽，盖上电极帽，将电极垂直放于泡沫塑料上，待用。

实施例5fe3o4@c-ni包被sa(streptavidin)

将1ml20μg/ml的fe3o4@c-ni水溶液和25μl1mg/ml的sa-pbs溶液置于离心管中，于37℃过夜反应，在fe3o4@c-ni表面包被sa(fe3o4@c-ni@sa)，于10000rpm离心10min，收集上清液，用1×pbs(0.01m)冲洗多次，将所得物分散于1ml1×pbs中，超声均匀，备用。

实施例6制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极

按照图8所示的制备路线进行以下操作：

(1)au电极修饰capturedna

于离心管中加入10μl5mmtcep水溶液、2μl50μm巯基修饰的capturedna水溶液(sh-capturedna)、88μl1×pbs，室温反应30min，得混合液；滴加1μm6μl上述混合液于倒置的au电极上，盖上电极帽，室温下过夜，基于au-s键在au电极上修饰sh-capturedna。用1×pbs反复冲洗电极，氮气吹干。

(2)捕获targetdna

滴加10μl1mmmch水溶液(6-巯基己-1-醇)于sh-capturedna修饰的au电极上，室温反应1h；用1×pbs(0.01m)反复冲洗电极，氮气吹干；再滴加6μl1nm的targetdna水溶液于各自对应的电极上，室温下反应2h。用1×pbs(0.01m)反复冲洗电极，氮气吹干。

(3)扩增targetdna

离心管中加入80μl1×spsc(1mmnacl，50mmna2hpo4)缓冲液、10μl1μmbiotin-h1水溶液、10μl1μmbiotin-h2水溶液，混合均匀；将6μl上述混合液滴加到捕获targetdna的au电极表面，室温反应2h。用1×pbs反复冲洗电极，氮气吹干。

(4)修饰fe3o4@c-ni@sa

滴加6μl20μg/mlfe3o4@c-ni@sa水溶液于扩增targetdna的au电极上，室温反应1h，用1×pbs冲洗电极，制得au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图9所示。

由图9可知，au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极的氧化还原峰明显高于实施例7至实施例10其他类型的电化学传感器，其产生了显著的氧化还原信号。

实施例7.制备裸au/c-dna/mch/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：步骤(1)au电极修饰capturedna后，不进行步骤(2)捕获targetdna操作，直接扩增capturedna，并进行步骤(4)修饰fe3o4@c-ni@sa。扩增capturedna的操作为：离心管中加入80μl1×spsc、10μl1μmbiotin-h1、10μl1μmbiotin-h2，混合均匀；将6μl上述混合液滴加到修饰capturedna的au电极表面，室温反应2h。用1×pbs反复冲洗电极，氮气吹干，制备au/c-dna/mch/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图9所示。

实施例8.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2电极

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：不进行步骤(4)修饰fe3o4@c-ni@sa的操作，制备au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2电极，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图9所示。

由图9可知，au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2产生的信号几乎可以忽略不计。

实施例9.制备裸au/c-dna/mch/t-dna电极

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：不进行(2)捕获targetdna、步骤(3)扩增targetdna和步骤(4)修饰fe3o4@c-ni@sa的操作，制备au/c-dna/mch/t-dna电极，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图9所示。

实施例10.制备裸au/c-dna/mch电极

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：不进行步骤(3)扩增targetdna和步骤(4)修饰fe3o4@c-ni@sa的操作。只需滴加10μl1mmmch于sh-capturedna修饰的au电极上，室温反应1h；用1×pbs(0.01m)反复冲洗电极，氮气吹干，制备au/c-dna/mch电极，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图9所示。

由图9可知，hcr过程可以增强信号，是必不可少的。fe3o4@c-ni@sa可催化tmb底液，产生电化学信号。

实施例11.自组装不同浓度fe3o4@c-ni@sa电化学传感器

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：步骤(4)引入不同浓度的fe3o4@c-ni@sa，构建不同浓度fe3o4@c-ni@sa的电化学传感器，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图10所示。

由图10可知，随着fe3o4@c-ni@sa浓度的增加，自组装电化学传感器所检测的电流信号逐渐增加，但是当fe3o4@c-ni@sa的浓度达到50μg/ml时，电流信号减小，因此以20μg/ml作为fe3o4@c-ni@sa的优选浓度。

实施例12.自组装不同浓度[h1/h2]电化学传感器

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：步骤(3)引入不同浓度的[h1/h2](0.05、0.1、0.2μm)，构建不同浓度[h1/h2]的电化学传感器，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图11所示。

由图11可知，随着h1/h2浓度增加，自组装电化学传感器检测到的电流信号逐渐增大，并在[h1/h2]＝0.2μm达到最大值，故选取[h1/h2]＝0.2μm作为优选浓度。

实施例13自组装±targetdna的电化学传感器

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：步骤(2)分别选择捕获targetdna与不捕获targetdna，构建组装targetdna与未组装targetdna的电化学传感器，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图12所示。

由图12可知，加入1nmtargetdna自组装形成的电化学传感器可检测到2000na的电流信号，而不加targetdna自组装形成的电化学传感器只检测到90na左右的电流信号，因此，本申请构建的电化学传感器可实现dna的高灵敏检测。

实施例14自组装不同浓度targetdna的电化学传感器

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：步骤(2)引入不同浓度的targetdna，构建不同浓度targetdna的电化学传感器，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图13所示。

由图13可知，加入1fmtargetdna自组装形成的电化学传感器可以检测到200na左右的电流信号，比不加targetdna时高了一倍，检测灵敏度高。且随着targetdna浓度升高，检测灵敏度大幅上升。

实施例15自组装不同浓度targetdna且无hcr扩增的电化学传感器

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：步骤(2)引入不同浓度的targetdna，且无步骤(3)扩增targetdna，自组装不同浓度targetdna且无hcr扩增的电化学传感器，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图14所示。

由图14可知，随着targetdna浓度的增加，电化学传感器检测到的电流信号逐渐增强，灵敏度逐渐升高。结合实施例14的图13可知，由于缺少hcr扩增，同浓度targetdna，本实施例检测到的电流信号远远低于进行hcr扩增的实施例14。

实施例16自组装单碱基错配(snp)的targetdna的电化学传感器

本制备方法同“实施例6.制备裸au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa电极”，不同之处在于：步骤(2)分别引入一个碱基错配的targetdna(1mm)、两个碱基错配的targetdna(2mm)、三个碱基错配的targetdna(3mm)，分别对应形成自组装度一个碱基错配的targetdna、两个碱基错配的targetdna(2mm)、三个碱基错配的targetdna(3mm)的电化学传感器，采用“实施例17电化学检测方法”进行电化学检测，结果如图15所示。

由图15可知，本申请构建的电化学传感器对targetdna的选择性高。

实施例17.电化学检测方法

将实施例6至实施例16制备的不同种类的电化学传感器，按照下述电化学检测方法进行检测。

①借助辰华电化学工作站，使用三电极体系进行检测，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，自组装的au电极为工作电极，在1.5ml含过氧化氢的tmb底液中进行电化学检测。

②用循环伏安法对前列腺癌dna进行定性检测，参数范围如下：

电位范围为0-0.8v

扫描速率为0.1v/s

用时间-电流(i-t)对前列腺癌dna进行定量检测，参数范围如下：

时间范围为0-100s

扫描速率为0.1v/s

③根据所得时间-电流曲线中的电流i，以及targetdna的浓度，做出电流-浓度曲线。

利用电化学工作站检测自组装不同种类的电化学传感器的电流-电压曲线如图9所示，只有au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2/fe3o4@c-ni@sa产生了显著的氧化还原信号。au/c-dna/mch/t-dna/fe3o4@c-ni@sa产生的信号较小，证明hcr过程可以增强信号，是必不可少的。au/c-dna/mch/t-dna/h1-h2产生的信号几乎可以忽略不计，说明fe3o4@c-ni@sa可以催化含过氧化氢的tmb底液，产生电化学信号。

上述对实施实例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施实例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施实例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。