用于免疫组织化学的合成对照的制作方法

文档序号:23628899发布日期:2021-01-12 10:42阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种产生用于免疫组织化学(ihc)染色的固体抗原/载体蛋白凝胶的方法,所述方法包括:

(a)将纯化抗原与包含选自由白蛋白、蛋清蛋白或蛋清蛋白混合物和明胶组成的组的载体蛋白的液体溶液混合以产生抗原/载体蛋白液体溶液;以及

(b)加热所述抗原/载体蛋白液体溶液以形成所述固体抗原/载体蛋白凝胶。

2.如权利要求1所述的方法,所述方法在(b)之后还包括:使所述固体抗原/载体蛋白凝胶脱水以及将所述脱水的固体抗原/载体蛋白凝胶包埋于石蜡块中。

3.如权利要求2所述的方法,所述方法在将所述脱水的固体抗原/载体蛋白凝胶包埋于所述石蜡块中之后还包括:将包含所述抗原/载体蛋白凝胶的核心从所述石蜡块转移至接受体组织微阵列(tma)块。

4.如权利要求1所述的方法,所述方法在(b)之后还包括:在液体包埋介质中孵育所述固体抗原/载体蛋白凝胶以及在所述包埋介质中冷冻所述固体抗原/载体蛋白凝胶。

5.如权利要求1所述的方法,所述方法在(b)之后还包括:将所述固体抗原/载体蛋白凝胶包埋于塑料树脂中。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,所述方法在(b)之后还包括:将所述固体抗原/载体蛋白凝胶切成一个或多个厚度在约30nm与约50μm之间的固体抗原/载体蛋白凝胶切片。

7.如权利要求6所述的方法,其中将所述固体抗原/载体蛋白凝胶切成一个或多个厚度在约2μm与约30μm之间的固体抗原/载体蛋白凝胶切片。

8.如权利要求6所述的方法,其中将所述固体抗原/载体蛋白凝胶切成一个或多个厚度在约30nm与约100nm之间的固体抗原/载体蛋白凝胶切片。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,所述方法在(b)之前还包括在所述抗原/载体蛋白液体溶液中包括固定剂。

10.如权利要求8所述的方法,其中所述固定剂包括甲醛。

11.如权利要求10所述的方法,其中所述抗原/载体蛋白液体溶液包含最终浓度为至少约1%的甲醛。

12.如权利要求8所述的方法,其中所述固定剂包括戊二醛、戴维森氏固定剂、布安氏固定剂、1/2强度卡诺夫斯基氏固定剂或锌盐。

13.如权利要求8-12中任一项所述的方法,所述方法还包括对所述固体抗原/载体蛋白凝胶进行抗原修复。

14.如权利要求13所述的方法,其中对所述固体抗原/载体蛋白凝胶进行抗原修复包括加热液体溶液中的所述固体抗原/载体蛋白凝胶。

15.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括:

在(b)之前,在所述抗原/载体蛋白液体溶液中包括固定剂;

在(b)之后,使所述固体抗原/载体蛋白凝胶脱水;

将所述脱水的固体抗原/载体蛋白凝胶包埋于石蜡块中;

将具有所述包埋的抗原/载体蛋白凝胶的所述石蜡块切成一个或多个厚度在约30nm至约50μm之间的切片;

对所述包埋的固体抗原/载体蛋白凝胶的所述一个或多个切片进行抗原修复;以及

在抗原修复之后,封闭所述包埋的固体抗原/载体蛋白凝胶的所述一个或多个切片。

16.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括:

在(b)之后,在液体包埋介质中孵育所述固体抗原/载体蛋白凝胶;

在所述包埋介质中冷冻所述固体抗原/载体蛋白凝胶;

将所述冷冻的抗原/载体蛋白凝胶切成一个或多个厚度在约30nm与约50μm之间的切片;以及

封闭所述冷冻的抗原/载体蛋白凝胶的所述一个或多个切片。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述抗原是多肽抗原。

18.如权利要求17所述的方法,其中所述抗原包含n端酪氨酸、c端半胱氨酸或两者。

19.如权利要求18所述的方法,所述方法还包括在(b)之前,使用半胱氨酸反应性试剂使所述抗原与所述载体蛋白交联。

20.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述抗原包括非多肽抗原。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述载体蛋白是血清白蛋白。

22.如权利要求21所述的方法,其中所述血清白蛋白是牛、山羊、马或人血清白蛋白。

23.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述载体蛋白是蛋清蛋白或蛋清蛋白混合物。

24.如权利要求21-23中任一项所述的方法,其中(a)中产生的所述抗原/载体蛋白液体溶液包含浓度大于或等于2%(w/v)的所述载体蛋白。

25.如权利要求24所述的方法,其中(a)中产生的所述抗原/载体蛋白液体溶液包含最终浓度小于或等于约25%(w/v)的所述载体蛋白。

26.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述载体蛋白是明胶,并且所述方法在(b)之后还包括冷却所述经过加热的抗原/载体蛋白液体溶液以形成所述固体抗原/载体蛋白凝胶。

27.如权利要求26所述的方法,其中所述方法在冷却所述经过加热的抗原/载体蛋白液体溶液之后还包括:

将所述固体抗原/载体蛋白凝胶与固定剂一起孵育以形成固定的抗原/载体蛋白凝胶;以及

使所述固定的抗原/载体蛋白凝胶脱水。

28.如权利要求26或权利要求27所述的方法,其中(a)中产生的所述抗原/载体蛋白液体溶液包含浓度大于或等于约0.5%(w/v)的所述载体蛋白。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法,其中在(b)中将所述抗原/载体蛋白液体溶液加热至至少约65℃。

30.如权利要求29所述的方法,其中在(b)中将所述抗原/载体蛋白液体溶液加热至至少约65℃持续至少6分钟。

31.一种固体抗原/载体蛋白凝胶,所述固体抗原/载体蛋白凝胶是通过如权利要求1至30中任一项所述的方法产生。

32.一种组织微阵列(tma),所述组织微阵列至少包含通过如权利要求1至30中任一项所述的方法产生的第一固体抗原/载体蛋白凝胶和通过如权利要求1至30中任一项所述的方法产生的第二固体抗原/载体蛋白凝胶。

33.一种用于免疫组织化学(ihc)染色的固体抗原/载体蛋白凝胶,所述固体抗原/载体蛋白凝胶包含交联至选自由白蛋白、蛋清蛋白或蛋清蛋白混合物和明胶组成的组的载体蛋白的纯化抗原。

34.如权利要求33所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶的厚度在约30nm与约50μm之间。

35.如权利要求34所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶的厚度在约2μm与约30μm之间。

36.如权利要求34所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶的厚度在约30nm与约100nm之间。

37.如权利要求33-36中任一项所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶在包埋介质中冷冻。

38.如权利要求33-36中任一项所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶包埋于石蜡中。

39.如权利要求33-36中任一项所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶包埋于塑料树脂中。

40.如权利要求33-39中任一项所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶附着至固体基底。

41.如权利要求33-40中任一项所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶已经在固定剂中固定。

42.如权利要求41所述的固体凝胶,其中所述固定剂包括甲醛。

43.如权利要求42所述的固体凝胶,其中所述固定剂包括浓度为至少约1%的甲醛。

44.如权利要求41所述的固体凝胶,其中所述固定剂包括戊二醛、戴维森氏固定剂、布安氏固定剂、1/2强度卡诺夫斯基氏固定剂或锌盐。

45.如权利要求33-44中任一项所述的固体凝胶,其中已经对所述固体凝胶进行抗原修复。

46.如权利要求33-45中任一项所述的固体凝胶,其中所述抗原是多肽抗原。

47.如权利要求46所述的固体凝胶,其中所述抗原包含n端酪氨酸、c端半胱氨酸或两者。

48.如权利要求47所述的固体凝胶,其中所述n端酪氨酸和/或c端半胱氨酸交联至所述载体蛋白。

49.如权利要求33-45中任一项所述的固体凝胶,其中所述抗原包括非多肽抗原。

50.如权利要求33-49中任一项所述的固体凝胶,其中所述载体蛋白是血清白蛋白。

51.如权利要求50所述的固体凝胶,其中所述血清白蛋白是牛、山羊、马或人血清白蛋白。

52.如权利要求33-49中任一项所述的固体凝胶,其中所述载体蛋白是蛋清蛋白或蛋清蛋白混合物。

53.如权利要求50-52中任一项所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶包含浓度大于或等于2%的所述载体蛋白。

54.如权利要求53所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶包含浓度小于或等于约25%的所述载体蛋白。

55.如权利要求33-49中任一项所述的固体凝胶,其中所述载体蛋白是明胶。

56.如权利要求55所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶包含浓度大于或等于0.5%的所述载体蛋白。

57.如权利要求33-56中任一项所述的固体凝胶,其中所述固体凝胶含有浓度为至少约25nm的所述抗原。

58.一种组织微阵列(tma),所述组织微阵列至少包含第一固体抗原/载体蛋白凝胶和第二固体抗原/载体蛋白凝胶,其中所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶和所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶均包含交联至选自由白蛋白、蛋清蛋白或蛋清蛋白混合物和明胶组成的组的载体蛋白的纯化抗原。

59.如权利要求58所述的tma,其中所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶包含第一纯化抗原,并且其中所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶包含不同于所述第一纯化抗原的第二纯化抗原。

60.如权利要求58所述的tma,其中所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶包含处于第一浓度的第一纯化抗原,并且其中所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶包含处于不同于所述第一浓度的第二浓度的所述第一纯化抗原。

61.一种用于抗原的免疫组织化学(ihc)染色的方法,所述方法包括:

提供根据权利要求33-57中任一项所述或通过如权利要求1-30中任一项所述的方法产生的固体抗原/载体蛋白凝胶,其中所述固体抗原/载体蛋白凝胶含有所述抗原;

提供样品;

使所述固体抗原/载体蛋白凝胶和所述样品与特异性结合所述抗原的一级抗体接触;

在使所述固体抗原/载体蛋白凝胶和所述样品与所述一级抗体接触之后,使所述固体抗原/载体蛋白凝胶和所述样品与特异性结合所述一级抗体的二级抗体接触,其中可检测部分缀合至所述二级抗体;

从所述固体抗原/载体蛋白凝胶中检测所述可检测部分的信号;以及

从所述样品中检测所述可检测部分的信号,其中与从所述固体抗原/载体蛋白凝胶中检测到的所述信号相比,从所述样品中检测到信号指示所述样品中存在所述抗原。

62.如权利要求61所述的方法,其中所述样品是组织样品。

63.一种用于抗原的对照免疫组织化学(ihc)染色的方法,所述方法包括:

提供第一固体抗原/载体蛋白凝胶和第二固体抗原/载体蛋白凝胶,其中所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶和所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶中的每一者是根据权利要求33-57中任一项所述或通过如权利要求1-30中任一项所述的方法产生,其中所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶含有处于第一浓度的所述抗原,并且其中所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶含有处于高于所述第一浓度的第二浓度的所述抗原;

使所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶和所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶与特异性结合所述抗原的一级抗体接触;

在使所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶和所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶与所述一级抗体接触之后,使所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶和所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶与特异性结合所述一级抗体的二级抗体接触,其中可检测部分缀合至所述二级抗体;

从所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶中检测所述可检测部分的第一信号;以及

从所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶中检测所述可检测部分的第二信号,其中检测到大于所述第一信号的第二信号指示所述抗原的对照ihc染色。

64.如权利要求63所述的方法,其中所述第一浓度为onm,并且其中检测到第一信号的缺失指示所述抗原的对照ihc染色。

65.如权利要求63或权利要求64所述的方法,所述方法还包括:

提供样品;

使所述样品与所述一级抗体接触;

在使所述样品与所述一级抗体接触之后,使所述样品与所述二级抗体接触;

从所述样品中检测所述可检测部分的第三信号;以及

将所述第三信号与所述第一信号和所述第二信号进行比较,其中相对于所述第一信号和所述第二信号的量,所述第三信号的量指示相对于所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶和所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶中所述抗原的量,所述样品中所述抗原的丰度。

66.一种用于使用二级抗体的对照免疫组织化学(ihc)染色的方法,所述方法包括:

提供第一固体抗原/载体蛋白凝胶和第二固体抗原/载体蛋白凝胶,其中所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶和所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶中的每一者是根据权利要求33-57中任一项所述或通过如权利要求1-30中任一项所述的方法产生,其中所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶包含具有第一同型的第一抗体,并且其中所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶包含具有不同于所述第一同型的第二同型的第二抗体;

使所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶和所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶与特异性结合所述第一同型的二级抗体接触,其中可检测部分缀合至所述二级抗体;

从所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶中检测所述可检测部分的信号;以及

从所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶中检测所述可检测部分的所述信号的缺失,其中检测到与所述第一固体抗原/载体蛋白凝胶相关的所述信号以及与所述第二固体抗原/载体蛋白凝胶相关的所述信号的所述缺失指示使用所述二级抗体的对照染色。

67.如权利要求61-66中任一项所述的方法,其中所述可检测部分包括酶,并且其中检测所述可检测部分的所述信号包括将所述可检测部分暴露于所述酶的显色底物并且在与所述酶反应后检测来自所述显色底物的信号。

68.如权利要求61-66中任一项所述的方法,其中所述可检测部分包括荧光团、金属颗粒、金属离子、放射性同位素、核酸、电化学发光报告子或量子点。

69.一种用于抗原的对照免疫组织化学(ihc)染色的试剂盒,所述试剂盒包括:

(a)第一固体凝胶,所述第一固体凝胶包含交联至选自由白蛋白、蛋清蛋白或蛋清蛋白混合物和明胶组成的组的载体蛋白的纯化抗原,其中所述纯化抗原以第一浓度存在于所述第一固体凝胶中;以及

(b)第二固体凝胶,所述第二固体凝胶包含交联至所述载体蛋白的所述纯化抗原,其中所述纯化抗原以不同于所述第一浓度的第二浓度存在于所述第二固体凝胶中。

70.如权利要求69所述的试剂盒,其中将所述第一固体凝胶和所述第二固体凝胶各自切成在约30nm与约50μm之间的厚度。

71.如权利要求69或权利要求70所述的试剂盒,其中使所述第一固体凝胶和所述第二固体凝胶附着至一个或多个固体基底。

72.如权利要求69-71中任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括:

(c)第三固体凝胶,所述第三固体凝胶包含所述载体蛋白,其中所述第三固体凝胶不包含所述纯化抗原。

73.如权利要求72所述的试剂盒,其中将所述第三固体凝胶切成在约30nm与约50μm之间的厚度。

74.如权利要求72或权利要求73所述的试剂盒,其中使所述第三固体凝胶附着至固体基底。


技术总结
本公开涉及可用于例如免疫组织化学(IHC)的合成对照,以及与其相关的试剂盒和制造方法及用途。在一些实施方案中,合成对照包括固体抗原/载体蛋白凝胶,所述固体抗原/载体蛋白凝胶包含纯化抗原(例如,以已知量)和载体蛋白,例如白蛋白(例如,血清白蛋白)、蛋清蛋白或蛋清蛋白混合物、明胶或聚赖氨酸。在一些实施方案中,在固体抗原/载体蛋白凝胶中纯化抗原交联至载体蛋白。

技术研发人员:K·霍泽尔;小富兰克林·V·皮尔;C·哈弗德;L·兰赫尔;D·Y·邓拉普
受保护的技术使用者:基因泰克公司
技术研发日:2018.12.05
技术公布日:2021.01.12
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