本发明属于生物纳米磁珠应用和医学检验技术领域，特别涉及一种基于荧光编码磁珠的检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
临床医学检验的对象，主要包括细胞类和小分子物质两大类，小分子物质包括蛋白质或核酸等。细胞样品的检测仪器常见的有流式细胞仪、血细胞分析仪等，而小分子物质的检测仪器则包括化学发光检测仪、色谱分析仪等。在实际的应用中，小分子物质的检测，例如肿瘤标志物，常用的检测方式是化学发光法进行单项检测，但从临床意义上来说，肿瘤标志物和肿瘤不是完全意义上的对应关系，只是一种相关性，单项肿瘤标志物的检测，肿瘤检出率低，而多指标并行检测和诊断，增加了肿瘤检测的敏感性和特异性，大大提高了肿瘤的检出率，同理，其他多种小分子物质的联合检测对于临床疾病的诊断也具有重要意义。
近年来，有人将化学发光与纳米技术相结合，提出了化学发光磁酶免疫分析法，将磁性分离技术，免疫学方法与化学发光检测技术三者相结合，大大节省了抗体包覆的复杂过程，简化了操作，节省了时间。学者林金明等根据微流控芯片的制作原理，研制了中心混合的三流路化学发光流动注射芯片检测池，实现了三种物质的原位检测，然而，面对更多组分，或者更微量物质的联合检测，则难以实现准确灵敏的检测。
随着全自动、大数据和人工智能技术的发展，简化检测过程，实现多组分自动化同时检测成了一种发展趋势，而如上所述现有技术难以实现对高通量的多种组分自动化同时检测。
技术实现要素：
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术不能实现高通量、多组分、自动化检测，检测方法复杂，成本高更缺点，提供一种基于荧光编码磁珠的检测方法。
本发明公开了一种基于荧光编码磁珠的检测方法，包括以下步骤
捕获步骤：荧光编码磁珠与含有目标分子的待测品混合，捕获目标分子；
形成复合物步骤：加入荧光报告基团，特异性连接到被捕获目标分子上，形成荧光编码磁珠-目标分子-荧光报告基团复合物；
分离步骤：采用磁性柱吸附所述荧光编码磁珠-目标分子-荧光报告基团复合物，并转移到后续反应环境中；
激发和判定步骤：采用激发光照射所述荧光编码磁珠-目标分子-荧光报告基团复合物，根据光谱波形对所述荧光编码磁珠-目标分子-荧光报告基团复合物进行鉴别，根据荧光报告基团的荧光强度对被捕获的目标分子进行定量检测。
优选的，所述磁性柱为柱状结构，所述磁性柱工作端直径为1mm-5cm，由电流控制磁性状态。
优选的，所述反应环境包括缓冲液、封闭液或鞘液。
优选的，还包括样品前处理步骤，于捕获步骤前对样品中目标分子分离和富集。
优选的，还包括捕获步骤前荧光编码磁珠混合液的制备，采用至少两种不同荧光编码的荧光编码磁珠混合进行至少两种目标分子的同时捕获。
优选的，所述捕获步骤还包括捕获目标分子后的洗脱和封闭步骤以及形成复合物步骤中形成所述荧光编码磁珠-目标分子-荧光报告基团复合物后的洗脱和封闭步骤。
优选的，所述洗脱和封闭步骤采用磁性柱进行吸附和转移。
优选的，所述激发和判定步骤使用的检测仪器选自荧光分光光度计、流式细胞仪或液相悬浮阵列芯片。
本发明还公开了一种使用所述检测方法的检测试剂盒，包括，
包被目标分子的荧光编码微球；
荧光报告基团标记的检测抗体；
阴性对照品；
阳性对照品；
缓冲液。
优选的，所述荧光编码微球上荧光信号分子和所述荧光报告基团均选自中心发射波长各不相同的CdSe/ZnS量子点，所述CdSe/ZnS量子点中心发射波长为540-680nm。
本发明还公开了一种所述基于荧光编码磁珠的检测方法或所述检测试剂盒在荧光分析领域的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述基于荧光编码磁珠的检测方法，包括捕获步骤、形成复合物步骤、分离步骤和激发判定步骤，所述捕获步骤、形成复合物步骤和分离步骤采用荧光编码微球特异性结合捕获所需的目标分子，采用磁性柱作为复合物的运输工具，转移于不同的反应环境，可采用自动化进行控制，实现快速检测，所述激发和判定步骤可采用荧光分光检测、流式细胞检测法和液相芯片检测法，实现对不同目标分子的同时检测和高通量检测，特别是流式细胞检测法，可以通过存储荧光编码微球光谱波形数据库，实现智能自动化检测。
2.本发明所述的基于荧光编码磁珠的检测方法，采用磁性柱作为转移介质，通过电流来控制磁性柱磁性的有无和磁性的大小，磁性吸附作用温和，对生物分子影响小，而且通过控制磁性柱的运动就能实现荧光编码微球的转移，不需人工处理，有利于实现自动化和检测效率。
3.本发明所述的基于荧光编码磁珠的检测方法，包括捕获目标分子之后的洗脱和封闭步骤以及形成复合物步骤中的洗脱和封闭步骤，都可以采用磁性柱作为转移介质，以实现整个检测过程的自动化。
4.本发明所述的基于荧光编码磁珠的检测方法，所述激发和判定步骤使用的检测仪器选自荧光分光光度计、流式细胞仪或液相悬浮阵列芯片，结合磁性柱，实现自动化、高通量和快速的检测。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种检测试剂盒，包括1)包被鼠抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体的荧光编码微球；2)量子点标记的检测抗体；3)阳性对照品；4)阴性对照品；5)pH7.2-7.4的磷酸缓冲液。
其中，所述荧光编码微球为包埋有质量分数为2％Fe3O4超顺磁纳米粒子，粒径为15-20um的聚苯乙烯微球，表面包覆有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，可以与鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体上的氨基结合形成共价键，所述荧光编码微球上具有的用于荧光编码的荧光信号分子为采用氨基改性的中心发射波长为560nm和630nm的CdSe/ZnS量子点，两种中心发射波长的CdSe/ZnS量子点的质量比为1:1。
所述量子点标记的检测抗体为鼠抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体，其上饱和标记有为中心发射波长为680nm的CdSe/ZnS量子点。
所述阳性对照品为甲胎蛋白(AFP)标准品。
所述阴性对照品为不含有甲胎蛋白的血清样品。
本实施例还提供了一种基于荧光编码磁珠的检测方法，具体包括以下步骤：
样品前处理步骤：将待测全血样品进行以8000rpm离心15min，得到血清作为检测样品；将所述阳性对照品甲胎蛋白(AFP)标准品连续十倍稀释，待用；
捕获步骤：取300ul荧光编码微球试剂于96孔板中，平行3份，每份5孔，第一份加入离心后的血清10ul，第二份分别加入10ul经稀释的不同浓度的阳性对照品，第三份分别加入10ul阴性对照品，37℃摇床反应30min，使用直径为5mm磁性柱使得荧光编码磁珠固定于磁性柱上，然后随磁性柱转移至缓冲液中，控制电流，使磁性消失，捕获目标分子的荧光编码微球重新分散于缓冲液中，清洗后吸附于磁性柱，再随磁性柱转移至含1％wt BSA的PBS封闭液中，同上所述，分散，封闭后吸附于磁性柱；
形成复合物步骤：将吸附有荧光编码微球的磁性柱转移至装有500ul标记有量子点的检测抗体试剂中，分散，37℃反应摇床反应30min后形成荧光编码磁珠-目标分子-荧光报告基团复合物，吸附于磁性柱；
分离步骤：将吸附有荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物的磁性柱转移至缓冲液中洗脱未反应的检测抗体和背景物质，然后分散于缓冲液中；
激发和判定步骤：采用荧光分光光度计，采用波长为618nm的激发波长激发，检测阳性对照品、阴性对照品和所述缓冲液中荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物的荧光强度，根据所述荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物检测抗体上标记的量子点荧光强度和阳性对照品的量子点荧光强度标准曲线计算样品中待测分子的含量。
实施例2
本实施例所述的检测试剂盒和检测方法与实施例1基本相同，区别仅在于，采用流式细胞仪检测所述阳性对照品、所述阴性对照品和所述缓冲液中荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物的荧光强度，计算样品中待测分子的含量。
实施例3
本实施例提供了一种检测试剂盒，包括，1)包被5种不同目标分子的抗体的荧光编码微球；2)量子点标记的5种相对应的检测抗体；3)5种阳性对照品；4)阴性对照品；5)pH7.2-7.4的磷酸缓冲液；
所述荧光编码微球为包埋有质量分数为3％Fe3O4超顺磁纳米粒子，粒径为15-20um的聚苯乙烯微球，表面包覆有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，可以与目标分子的单克隆抗体上的氨基结合形成共价键，所述的包被5种不同目标分子的抗体的荧光编码微球信息如下：
荧光编码微球①：所述用于荧光编码的荧光信号基团为采用氨基改性的中心发射波长为540nm、570nm、600nm和630nm的CdSe/ZnS量子点，4种中心发射波长的CdSe/ZnS量子点的质量比为1:1:1:1；所述荧光编码微球上的目标分子抗体为鼠抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体，所述量子点标记的检测抗体为鼠抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体，其上标记的量子点为中心发射波长为680nm的CdSe/ZnS量子点；
荧光编码微球②：所述用于荧光编码的荧光信号分子为采用氨基改性的中心发射波长为540nm、570nm、600nm和630nm的CdSe/ZnS量子点，4种中心发射波长的CdSe/ZnS量子点的质量比为1:2:1:3；所述荧光编码微球上的目标分子抗体为鼠抗人前列腺特异抗原(PSA)单克隆抗体，所述量子点标记的检测抗体为鼠抗人前列腺特异抗原(PSA)单克隆抗体，其上标记的量子点为中心发射波长为680nm的CdSe/ZnS量子点；
荧光编码微球③：所述用于荧光编码的荧光信号分子为采用氨基改性的中心发射波长为540nm、570nm、600nm和630nm的CdSe/ZnS量子点，4种中心发射波长的CdSe/ZnS量子点的质量比为1:2:3:4；所述荧光编码微球上的目标分子抗体为鼠抗人癌胚抗原(CEA)单克隆抗体，所述量子点标记的检测抗体为鼠抗人癌胚抗原(CEA)单克隆抗体，其上标记的量子点为中心发射波长为680nm的CdSe/ZnS量子点；
荧光编码微球④：所述用于荧光编码的荧光信号分子为采用氨基改性的中心发射波长为540nm、570nm、600nm和630nm的CdSe/ZnS量子点，4种中心发射波长的CdSe/ZnS量子点的质量比为5:4:3:2；所述荧光编码微球上的目标分子抗体为鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体，所述量子点标记的检测抗体为鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体，其上标记的量子点为中心发射波长为680nm的CdSe/ZnS量子点；
荧光编码微球⑤：所述用于荧光编码的荧光信号分子为采用氨基改性的中心发射波长为540nm、570nm、600nm和630nm的CdSe/ZnS量子点，4种中心发射波长的CdSe/ZnS量子点的质量比为5:3:1:2；所述荧光编码微球上的目标分子抗体为鼠抗人CA199糖链抗原单克隆抗体，所述量子点标记的检测抗体为鼠抗人CA199糖链抗原单克隆抗体，其上标记的量子点为中心发射波长为680nm的CdSe/ZnS量子点；
所述阳性对照品为甲胎蛋白(AFP)标准品、前列腺特异抗原(PSA)标准品、癌胚抗原(CEA)标准品、经元特异性烯醇化酶(NSE)标准品、CA199糖链抗原标准品。
所述阴性对照品为不含有目标分子的血清样品。
本实施例还提供了一种基于荧光编码磁珠的检测方法，具体包括以下步骤：
样品前处理步骤：将待测全血样品进行以8000rpm离心15min，得到血清作为检测样品；取所述5种阳性对照品标准品混合，分别连续十倍稀释，待用；
捕获步骤：分别取100ul荧光编码微球①、②、③、④、⑤试剂混合形成混合磁珠于96孔板中，平行3份，第一份加入离心后的血清5ul，第二份分别加入5ul经稀释的不同浓度的阳性对照品混合液，第三份分别加入5ul阴性对照品，37℃摇床反应30min，使用直径为5cm磁性柱使得荧光编码磁珠固定于磁性柱上，然后随磁性柱转移至缓冲液中，控制电流，使磁性消失，捕获目标分子的荧光编码微球重新分散于缓冲液中，清洗后吸附于磁性柱，再随磁性柱转移至含1％wt BSA的PBS封闭液中，同上所述，分散，封闭后吸附于磁性柱；
形成复合物步骤：将吸附有荧光编码微球的磁性柱转移至装有500ul标记有量子点的检测抗体试剂中，分散，37℃反应摇床反应30min后形成荧光编码磁珠-目标分子-荧光报告基团复合物，吸附于磁性柱；
分离步骤：将吸附有荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物的磁性柱转移至缓冲液中洗脱未反应的检测抗体和背景物质，然后分散于缓冲液中；
激发和判定步骤：采用流式细胞仪，激发波长为488nm和618nm的激发光激发，检测所述缓冲液中荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物的荧光光谱波形和中心发射波长为680nm量子点的荧光强度，根据流式细胞仪参考光谱波形库中的参考光谱波形对所述荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物进行分类，根据检测抗体上标记的量子点荧光强度和阳性对照品的量子点荧光强度标准曲线计算样品中待测分子的含量。
实施例4
本实施例所述的检测试剂盒和检测方法与实施例3基本相同，区别仅在于，采用液相芯片检测所述缓冲液中荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物的荧光强度，激发波长为488nm和618nm，根据光谱波形对所述荧光编码微球-目标分子-检测抗体复合物进行分类，根据检测抗体上标记的量子点荧光强度和阳性对照品的量子点荧光强度标准曲线，从而计算出待测分子的含量。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。