基于环氧化及质谱鉴定不饱和脂质碳碳双键位置的方法与流程

本发明涉及质谱分析方法技术领域，具体涉及一种基于环氧化及质谱鉴定不饱和脂质碳碳双键位置的方法。

背景技术：

脂质具有许多重要的生物学功能，不饱和脂质是细胞中细胞膜的重要组成部分，参与诸如能量存贮、信号传导等生物体重要生理过程。研究表明，不饱和脂肪酸含量的上升与多种癌症的发生密切相关。例如，已有研究发现在卵巢癌干细胞中，脂类物质不饱和度的增加是其重要的代谢标记物，并可作为癌症治疗的靶点。利用脂质碳碳双键(c＝c)异构体的组成亦可用来是区分正常组织和癌症病变组织。因此，为了更好地理解脂质的代谢通路及生物学作用，对不饱和脂质的结构解析是非常有必要的。

质谱(ms)技术因其具有高灵敏度、高准确性、高特异性的特点而被广泛应用于分析领域中。尽管质谱已在脂质组学研究中显示出强大的分析能力，然而，目前质谱依然难以直接用于不饱和脂质碳碳双键(c＝c)位置的鉴定。原因是不饱和脂质中的c＝c键能高，不能直接在常规商用质谱仪的碰撞诱导解离(cid)碎裂模式下裂解，从而产生不了用于鉴定c＝c位置信息的特异性离子。为解决这一问题，研究者提出了许多不同的方法。其中一类方法是改用其他特殊的离子碎裂方式，例如采用臭氧诱导解离(ozid)和紫外光解离(uvpd)可实现对不饱和脂质c＝c位置鉴定；但这类方法需要对质谱仪器做相应的改造才能具备ozid或uvpd的特殊功能。另外一类方法是预先对不饱和脂质中的c＝c进行帕特诺-比希(pb)光化学衍生，使其衍生后的产物能在cid碎裂模式下产生用于鉴定c＝c位置信息的特异性离子；然而pb反应需要在紫外光下进行，会伴随着一定的副反应且其产率不会很高。因此，研究一种快速，有效的实现对不饱和脂质中c＝c位置的鉴定，对不饱和脂质结构解析的研究具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于环氧化及质谱鉴定不饱和脂质碳碳双键位置的方法。该方法简单易行，无需对质谱进行改造，通过低温等离子体(ltp)环氧化方法与串联质谱分析相结合即可准确、快速地鉴定不饱和脂质中碳碳双键(c＝c)的位置。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的一种基于环氧化及质谱鉴定不饱和脂质碳碳双键位置的方法，该方法包括：采用低温等离子体对待分析的不饱和脂质进行环氧化衍生，得到环氧化产物；对不饱和脂质环氧化衍生后得到的环氧化产物进行串联质谱分析，得到c＝c位置的特异性离子；根据特异性离子，鉴定出所述不饱和脂质c＝c位置。其中，不同的c＝c位置，其特异性诊断离子的质量数不同，且一一对应。例如根据一对质量数相差16da的特异性离子直接鉴定出不饱和脂质c＝c位置。环氧化衍生是指环氧化反应，环氧化反应是衍生反应中的一种。

优选地，所述低温等离子体通过喷羽吹扫不饱和脂质来进行环氧化衍生，其中吹扫时间为20s～30s。更优选地，吹扫时间可以为20s～25s；具体可以为20s。由于ltp能产生大量的自由基活性物质激发脂质中的有机溶剂，进而实现脂质c＝c环氧化的衍生。

优选地，对不饱和脂质衍生后得到的环氧化产物，采用在正模式下或者负模式下进行串联质谱分析，从而得到c＝c位置的特异性离子。

优选地，采用碰撞诱导解离的串联质谱进行分析，被环氧化衍生后生成c＝c位置的特异性离子，根据特异性离子的质量数，从而鉴定出所述不饱和脂质c＝c位置。具体地，采用碰撞诱导解离(cid)的串联质谱进行分析，在碰撞诱导解离碎裂模式下，被环氧化衍生的脂质分子生成c＝c位置的特异性离子，每对特异性离子相差16da，从而鉴定出所述不饱和脂质c＝c位置。

优选地，所述方法还包括：采用有机溶剂稀释所述不饱和脂质的步骤；其中，不同种类的不饱和脂质，选取不同的有机溶剂进行稀释，所述不饱和脂质的种类包括不饱和脂肪酸和不饱和磷脂。更优选地，所述不饱和脂质包括不饱和脂肪酸(fa)、磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰肌醇(pi)、以及磷脂酸(pa)等。

优选地，当所述不饱和脂质为不饱和脂肪酸时，采用丙酮作为有机溶剂；当所述不饱和脂质为不饱和磷脂时，采用乙腈作为有机溶剂。

优选地，当鉴定不饱和脂肪酸中的c＝c位置时，串联质谱分析在负模式下进行，从而得到c＝c位置的特异性离子。

优选地，当鉴定不饱和磷脂中的碳碳双键(c＝c)位置时，串联质谱在正模式或负模式下进行，其中，在正模式下直接串联质谱分析得到碳碳双键位置的特异性离子；在负模式下先进行二级质谱分析，得到不饱和磷脂中的脂肪酸链的信息，然后对二级质谱中被环氧化的脂肪酸链进行三级质谱分析，从而得到碳碳双键位置的特异性离子。

优选地，所述采用低温等离子体对待分析的不饱和脂质进行环氧化衍生的步骤，还包括：采用氦气作为载气，通入交流电产生低温等离子体的步骤；其中，通入氦气的流速为1l/min～1.5l/min；所述交流电的频率15khz～18khz，电压峰峰值为3.5～4.5kv。

本发明采用以上技术方案具有的优点是：本发明提供的鉴定不饱和脂质中c＝c位置的方法简单易行，无需对质谱仪器做改造。该方法采用低温等离子体的环氧化与串联质谱分析技术相结合，可准确、快速地鉴定不饱和脂质中c＝c的位置。其不饱和脂质衍生化后的环氧化产物经碰撞诱导解离(cid)可以生成高丰度c＝c特征离子用于指认c＝c位置，而且单不饱和脂肪酸的环氧化衍生的产率高(产率接近100％)，因此能有效地提高了检测灵敏度和定量准确性。

附图说明

图1是本发明基于环氧化及质谱鉴定不饱和脂质碳碳双键位置的机理示意图；

图2(a)是本发明实施例一fa18:1(9z)未经衍生在负模式下的质谱图；其中，横坐标为离子的质荷比值(m/z)，纵坐标为相对丰度(relative)。

图2(b)是本发明实施例一fa18:1(9z)经环氧化衍生后在负模式下的质谱图；

图2(c)是本发明实施例一fa18:1(9z)环氧化产物在负模式下的二级质谱图；

图3(a)是本发明实施例二pc16:0/18:1(9z)经环氧化衍生后在正模式下的质谱图；

图3(b)是本发明实施例二pc16:0/18:1(9z)未经衍生在正模式下的二级质谱图；

图3(c)是本发明实施例二pc16:0/18:1(9z)环氧化产物在正模式下的二级质谱图；

图4(a)是本发明实施例三pc16:0/18:1(9z)经环氧化衍生后在负模式下的质谱图；

图4(b)是本发明实施例三pc16:0/18:1(9z)未经衍生在负模式下的二级质谱图；

图4(c)是本发明实施例三pc16:0/18:1(9z)环氧化产物在负模式下的二级质谱图；

图4(d)是本发明实施例三pc16:0/18:1(9z)环氧化产物在负模式下的三级质谱。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例，对本发明基于环氧化及质谱鉴定不饱和脂质碳碳双键位置的方法的技术方案做清楚、完整地阐述。

图1是示意性地示出了本发明基于环氧化及质谱鉴定不饱和脂质碳碳双键位置的技术路线图(机理图)。如图1所示，该方法包括：首先，待分析的脂质分子经过基于ltp的环氧化得到衍生后脂质分子(即环氧化产物)。然后，采用鸟枪法进行对待测物的质谱检测，环氧化产物(epoxide)较原脂质(即衍生前的脂质分子)会增加16da。选取待分析物的环氧化产物进行串级质谱分析，选取依据是环氧化产物较衍生前的脂质分子的质量数增加16da。在cid碎裂模式下，被衍生的脂质分子会生成c＝c位置的特异性诊断离子(diagnosticions)，每对诊断离子会相差16da，从而实现对脂质c＝c位置的鉴定。

下面对鉴定方法进行具体描述，步骤如下：

1.获取待分析(鉴定)的不饱和脂质，可以是不饱和脂肪酸或不饱和磷脂。

2.采用有机溶剂丙酮或乙腈稀释所述不饱和脂质浓度至10微摩尔，得到不饱和脂质溶液。

3.通入氦气(helium)作为ltp的载气，流速为1.5l/min，通入频率16khz，电压峰峰值为3.5～4.5kv的交流电(ac)产生ltp，采用ltp的喷羽直接吹扫不饱和脂质溶液约20s，从而实现对不饱和脂质的环氧化衍生(环氧化衍生是指环氧化反应，其是衍生反应中的一种)，即不饱和脂质中的c＝c由环氧化反应衍生成为环氧丙烷。其中，ltp探针采用石英玻璃管(外径4mm,内径2mm)，内电极采用铜针电极，外电极采用铜带环电极。

4.选取质谱仪，采用鸟枪法，采用纳喷雾离子源(nanoesi)，(高压(hv)用于形成纳喷雾的电压)，在正模式(正离子模式)或者负模式(负离子模式)下对待分析物进行检测分析。其中，鸟枪法是指样品不经过色谱柱分离，直接进样分析；采用鸟枪法使得本发明具有样品用量少，分析时间短等特点。纳喷雾离子源是质谱离子源的一种，可以简单、方便地实现质谱分析。

5.选取待分析物的环氧化产物进行串级(二级)质谱检测得到二级质谱图；或者再选取待分析物的环氧化产物进行串级(三级)质谱检测得到三级质谱图；其中，采用碰撞诱导解离(cid)的串联质谱碎裂进行检测分析。碰撞诱导解离(cid)是质谱仪器中的离子解离方式，即让母体离子裂解得到碎片离子。

6.根据步骤5二级质谱图或三级质谱图中的质量数相差16da的特异性碎片离子来鉴定出脂质c＝c的位置。

优选地，在步骤4之后还可以包括：对未经衍生的不饱和脂质进行检测分析的步骤，以及将衍生前后进行对比分析步骤。其中，对未经衍生的不饱和脂质进行检测分析可以是：一级质谱检测；二级质谱检测，以及三级质谱检测中的一种或多种。

实施例一

该实施例基于本发明鉴定不饱和脂肪酸中c＝c位置。鉴定方法如下：采用丙酮作为有机溶剂，采用脂肪酸(fa)的标准品为油酸(oleicacid)，即fa18:1(9z)；样品前处理：采用丙酮：水(容积比：50/50)的溶剂稀释样品浓度至10微摩尔。ltp装置：ltp探针采用石英玻璃管(外径4mm,内径2mm)，内电极采用铜针电极，外电极采用铜带环电极。通入载气(氦气，流速为1.5l/min)，通入交流电(电压峰峰值为3.5～4.5kv，频率16khz)产生ltp。脂质环氧化衍生：采用ltp的喷羽对脂质进行吹扫20s完成环氧化衍生反应。选用thermo公司的ltq质谱仪，采用纳喷雾离子源在负模式下检测，负模式检测的是减氢峰[m-h]^-。该实施例中的质谱检测包括：(1)对环氧化衍生前的脂质样品溶液进行一级质谱检测；(2)对环氧化衍生后的样品溶液进行一级质谱检测；(3)对比fa18:1衍生前与衍生后的一级谱图，确定环氧化反应的发生。(4)选取油酸的环氧化产物m/z297进行cid碎裂，得到其二级质谱图。其中，图2(a)示出了fa18:1衍生前的一级质谱图；图2(b)示出了fa18:1基于ltp的环氧化衍生后的一级质谱图；图2(c)示出了选取环氧化产物m/z297做串级质谱分析的二级质谱图。如图2(c)所示，fa18:1的c＝c位置的特异性诊断离子为m/z155/171，从而鉴定本实施例的样品fa18:1的c＝c位置为δ9，即碳碳双键在碳链9号位上(从羧基端数)。

实施例二

该实施例基于本发明鉴定不饱和磷脂中c＝c位置。鉴定方法如下：采用磷脂酰胆碱(pc)的标准品为pc16:0/18:1(9z)。样品前处理：采用乙腈作为有机溶剂稀释样品浓度至10微摩尔。ltp装置：ltp探针采用石英玻璃管(外径4mm,内径2mm)，内电极采用铜针电极，外电极采用铜带环电极。通入载气(氦气，流速为1.5l/min)，通入交流电(电压峰峰值为3.5～4.5kv，频率16khz)产生ltp。脂质环氧化衍生：采用ltp的喷羽对脂质进行吹扫20s完成环氧化衍生反应。选用bruker公司的impactq-tof的质谱仪，采用纳喷雾离子源在正模式下检测，正模式检测的是加氢峰[m+h]^-。该实施例中的质谱检测包括：(1)对环氧化衍生前的脂质样品溶液进行一级质谱检测；(2)对环氧化衍生后的样品溶液进行一级质谱检测；(3)对比pc16:0/18:1衍生前与衍生后的一级谱图，确定环氧化反应的发生。(4)选取pc16:0/18:1m/z760.6进行cid碎裂，得到其二级质谱图。(5)选取pc16:0/18:1的环氧化产物m/z776.6进行cid碎裂，得到其二级质谱图。其中，图3(a)为pc16:0/18:1(9z)采用基于ltp的环氧化衍生后的质谱图。图3(b)为pc16:0/18:1的串级质谱图，如图3(b)所示，pc16:0/18:1(9z)衍生前cid没有产生c＝c位置的特征峰。图3(c)为选取环氧化产物m/z776.6的串级质谱图。如图3(c)所示，碰撞诱导解离(cid)产生了pc16:0/18:1的c＝c位置的特异性诊断离子为m/z634.4/650.4，从而鉴定本实施例的样品pc16:0/18:1的c＝c位置为δ9。

实施例三

该实施例基于本发明鉴定不饱和磷脂中c＝c位置。鉴定方法如下：采用磷脂酰胆碱(pc)的标准品为pc16:0/18:1(9z)。样品前处理：采用乙腈(含30毫摩尔的醋酸铵)为有机溶剂稀释样品浓度至10微摩尔。ltp装置：ltp探针采用石英玻璃管(外径4mm,内径2mm)，内电极采用铜针电极，外电极采用铜带环电极。通入载气(氦气，流速为1.5l/min)，通入交流电(电压峰峰值为3.5～4.5kv，频率16khz)产生ltp。脂质环氧化衍生：采用ltp的喷羽对脂质进行吹扫20s完成环氧化衍生反应。本实施例采用的质谱仪为sciex公司的qtrap4500，采用纳喷雾离子源在负模式下检测，负模式下检测的是醋酸根加合峰[m-ch3coo]^-。该实施例中的质谱检测包括：(1)对环氧化衍生前的脂质样品溶液进行一级质谱检测；(2)对环氧化衍生后的样品溶液进行一级质谱检测；(3)对比pc16:0/18:1衍生前与衍生后的一级谱图，确定环氧化反应的发生。(4)选取pc16:0/18:1与醋酸根的加合物m/z818.6进行cid碎裂，得到其二级质谱图。(5)选取pc16:0/18:1的环氧化产物与醋酸根的加合物m/z834.6进行cid碎裂，得到其二级质谱图。(6)对比pc16:0/18:1衍生前与衍生后的二级谱图，确定环氧化反应在脂肪酸链上发生。(7)选取环氧化产物的二级碎片离子m/z297作为三级质谱(ms³)的母离子进行cid串级质谱检测，得到三级质谱图。其中，图4(a)为pc16:0/18:1(9z)采用基于ltp的环氧化衍生后在负模式下的质谱图。图4(b)为pc16:0/18:1在负模式下的串级质谱图，如图4(b)所示，在负模式下，选取pc16:0/18:1衍生前与醋酸根的加合物m/z818.5进行cid产生了两条脂肪酸链的特征峰，分别是m/z255和281；其中m/z255代表是fa16:0，m/z281代表是fa18:1。图4(c)为选取pc16:0/18:1衍生后与醋酸根的加合物m/z834.5的串级质谱图；如图4(c)所示，cid依然产生了两条脂肪酸链的特征峰，分别是m/z255和297；其中m/z255代表是fa16:0，m/z297代表是fa18:1，被环氧化后质量数增加了16da。图4(d)为pc16:0/18:1环氧化产物的cid三级碎裂图。选取环氧化产物二级碎片离子m/z297作为三级质谱(ms³)的母离子进行cid。如图4(d)所示，在ms³中产生了pc16:0/18:1中不饱和脂肪链fa18:1的c＝c位置的特异性诊断离子为m/zm/z155/171，从而鉴定本实施例的样品pc16:0/18:1的c＝c位置为δ9。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。