一种快速检测过氧化氢含量的方法与流程

本发明涉及拉曼光谱快速检测技术领域，尤其涉及一种利用表面增强拉曼光谱技术快速检测细胞代谢产物——过氧化氢的含量的方法。

背景技术：

活性氧(ros)作为一类高反应活性的化学物质在生理和病理过程中起到了非常重要的作用。所谓的活性氧(ros)，概括地说，是指机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称。如果体内缺乏活性氧可能会诱发某些疾病(例如慢性肉芽肿病，某些自身免疫性疾病等)；而体内活性氧过度产生同样也会诱发疾病(例如癌症，关节炎，动脉硬化等)。生物体内的ros包括了中性分子(例如：h2o2，¹o2)、自由基(例如：羟基自由基)、离子(例如：超氧化物、次氯酸、过氧化亚硝酰)等。其中过氧化氢是ros的重要组成部分，在细胞中主要作为细胞生长，增殖和分化的重要信号分子，过量的过氧化氢会攻击细胞中的细胞器或活性生物分子，如蛋白质、脂质体和dna等。同时细胞中的过氧化氢还与衰老，阿尔茨海默病和癌症等生理病理过程有关。目前常用来检测过氧化氢的含量的方法主要有电化学分析方法、色谱法、分光光度法等。如在专利cn106404873b中就是通过制备了电化学生物传感器的方法来对过氧化氢进行定量检测的；在专利cn103712930b中，则是通过过氧化氢和硫酸铈标准溶液进行反应，然后再用分光光度计来对过氧化氢进行定量检测的。虽然上述方法都能够准确对过氧化氢进行定量分析，但是他们都存在一些缺点比如前处理复杂，仪器昂贵的价格，操作时间长等等。因此，发展一种快速、简便、廉价的方法来对细胞中的代谢产物——过氧化氢进行定量检测显得尤为重要。

表面增强拉曼光谱技术是一项拥有检测速度快、检测灵敏度高(能够达到单分子水平)、同时还能够提供分子指纹光谱等优点的技术。自该技术发现以来迅速广泛地应用在食品，医药，生物，化学等多个领域之中。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于快速检测过氧化氢含量的sers芯片及快速检测过氧化氢含量的方法，该检测方法具有前处理简单、快速、高效、特异性强的优点。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于快速检测过氧化氢含量的sers芯片，所述sers芯片包括基底以及滴加于所述基底上的增强纳米粒子，所述基底上修饰有苯硼酸类分子，所述增强纳米粒子包括金纳米粒子以及包裹于所述金纳米粒子表面的惰性壳层。

本发明中，惰性壳层主要起隔绝外界环境的作用，使得纳米粒子不受环境的影响。

进一步地，所述基底为硅基金膜或银膜。

进一步地，所述苯硼酸类分子为4-巯基苯硼酸或4-氰基苯硼酸。

进一步地，所述金纳米粒子的粒径为40～60nm。

进一步地，所述惰性壳层为二氧化硅壳层，其厚度优选为1～2nm。

本发明另一方面还提供了一种快速检测过氧化氢含量的方法，包括以下步骤：

(1)提供所述的sers芯片；

(2)将含有过氧化氢代谢产物的溶液滴在所述sers芯片上，进行拉曼光谱测试，得到过氧化氢与苯硼酸类分子反应后的拉曼图谱，与标准曲线对照，从而计算出过氧化氢的含量。

进一步地，所述标准曲线通过以下步骤建立：

(1)提供一系列不同浓度的过氧化氢标准样品溶液；

(2)将所述一系列不同浓度的过氧化氢标准样品溶液滴加于sers芯片上，通过拉曼光谱测试仪进行检测，记录检测结果，建立拉曼检测信号强度与过氧化氢标准样品溶液浓度之间的标准曲线。

进一步地，建立标准曲线时，以1023cm^-1特征峰的峰面积和1078cm^-1特征峰的峰面积的比值与过氧化氢的浓度来绘制标准曲线。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种快速检测过氧化氢含量的表面增强拉曼光谱方法，其优点在于：不需要前处理、不需要添加另外的内标物，可以快速、高效、无损地实现对过氧化氢进行定量分析。

附图说明

图1为4-巯基苯硼酸和过氧化氢反应生成4-巯基苯酚的反应式；

图2为4-巯基苯硼酸和4-巯基苯酚的分子式和拉曼光谱；

图3为不同浓度过氧化氢和4-巯基苯硼酸反应后的拉曼光谱；

图4为不同浓度过氧化氢的标准曲线；

图5为不同浓度葡萄糖分解产物和4-巯基苯硼酸反应后的拉曼光谱；

图6为不同浓度葡萄糖的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例

1.仪器、试剂及仪器工作条件

1)仪器

共聚焦拉曼光谱仪(xploraplus，638nm)

2)试剂

氯金酸，柠檬酸钠，过氧化氢，葡萄糖，4-巯基苯硼酸，硅酸钠，3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(aptms)

3)拉曼光谱条件

拉曼光谱仪的参数设置为：horiba公司的xploraplus，光源：638nm；功率：1.6mw；扫描范围：350～2000cm^-1；光栅：1200t；每个样品采谱10张，取平均值。

2.标准溶液的配制

首先准确配制浓度为100m的过氧化氢水溶液母液，分别稀释得到浓度为9m、7m、5m、3m、1m的过氧化氢标准水溶液。

3.sers芯片的制备

1)内核金纳米粒子的制备

往煮沸的质量分数为1％的氯金酸水溶液中加入1.4ml浓度为1％的柠檬酸钠水溶液，保存沸腾30分钟，即得到粒径为55nm左右的金纳米粒子。冷却，待用。

2)核壳结构纳米粒子的制备

取上述1)中制备的金纳米粒子为内核，来制备核壳纳米粒子。取30ml上述溶液，往里加入0.4ml浓度为1mm的aptms溶液，搅拌15分钟后，加入3.2ml浓度为1mm的硅酸钠溶液，加热搅拌20分钟，离心，清洗，浓缩，最终得到壳层厚度约为1-2nm的惰性二氧化硅壳层。

3)sers芯片的制备

将硅基金膜用食人鱼洗液进行清洗干净后，置于1mm的4-巯基苯硼酸乙醇溶液中进行浸泡组装2-3小时。然后取出，用乙醇冲洗掉表面的物理吸附，自然干燥。再将2)中浓缩的核壳纳米粒子滴在组装好4-巯基苯硼酸的硅基金膜上，干燥即的sers芯片。

4.标准曲线的制备

将不同浓度的过氧化氢标准溶液滴一滴在制备好的sers芯片上，然后用拉曼光谱仪直接检测，得到过氧化氢和4-巯基苯硼酸反应后的拉曼光谱图(附图2)。其中1023cm^-1为b-o-h的变形振动，1078cm^-1为c-h的面内变形振动。因此，可以通过观察1023cm^-1这个特征峰的减小来反映过氧化氢的浓度，并且1078cm^-1的特征峰的大小在反应前后不发生变化，所以以该特征峰为内标来对拉曼信号进行校准，从而来对过氧化氢进行定量分析，无需额外添加内标物。最终将过氧化氢和4-巯基苯硼酸反应后的拉曼特征峰1023cm^-1的峰面积和1078cm^-1的峰面积的比值与过氧化氢浓度来制备曲线，可以得到一条相关系数r²为0.99465的标准曲线(附图4)。

5.实际样品的检测

将不同浓度的葡萄糖和葡萄糖氧化酶进行混匀反应，葡萄糖被葡萄糖氧化酶分解，得到的代谢产物为过氧化氢。将分解后的溶液滴在制备好的sers芯片上，然后用拉曼光谱仪直接检测，得到代谢产物——过氧化氢和4-巯基苯硼酸反应后的拉曼光谱图。然后将反应后的拉曼特征峰1023cm^-1的峰面积和1078cm^-1的峰面积的比值与葡萄糖浓度来制备曲线，得到一条相关系数r²为0.9812的标准曲线(附图6)。

根据建立的标准曲线，即可对实际样品进行检测。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。