一种川芎乙酸乙酯部位的指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及中药指纹图谱技术领域，具体涉及一种川芎乙酸乙酯部位的指纹图谱检测方法。

背景技术：

川芎为伞形科植物川芎ligusticumchuanxionghort.的干燥根茎，是著名的川产道地药材，具有活血行气，祛风止痛的功效，用于胸痹心痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，月经不调，经闭痛经，癥瘕腹痛，头痛，风湿痹痛等证，被历代医家作为活血、止痛的良药使用。现代药理研究表明，川芎具有保护心脑血管、镇静镇痛、抗凝等药理活性，临床上被广泛用于冠心病心绞痛、缺血性脑损伤、偏头痛等的治疗。管佳妮等.《川芎治疗偏头痛有效部位筛选研究》公开了川芎中起镇痛作用的有效部位为乙酸乙酯部位，但也有文献，如杨薇等.《正交设计法对川芎镇痛活血有效部位的分析》报道川芎乙酸乙酯部位的镇痛作用欠佳。经试验验证，川芎乙酸乙酯部位镇痛作用的确效果显著，对于出现这种完全相反的结论在于：提取工艺不当，导致川芎乙酸乙酯部位中起镇静、镇痛、解热及抗炎作用的藁本内酯，和具有抗氧化损伤、抗炎镇痛、抗凝及抗血小板聚集、舒张血管、细胞毒的洋川芎内酯类化合物流失，含量低。

目前，由于缺乏对川芎乙酸乙酯部位的质量检测方法，使实验和生产得到的川芎镇痛有效部位中有效成分差异明显，从而出现了现有研究报道中关于川芎的镇痛有效部位结论不一至的情况，这限制了川芎乙酸乙酯部位的临床应用，也对川芎的进一步开发不利。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种川芎乙酸乙酯部位的指纹图谱检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，包括如下步骤：

1)对照品溶液制备：取藁本内酯对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；

2)供试品溶液制备：取川芎粉碎，加乙醇提取，过滤，滤液浓缩成浸膏，加水溶解，再加乙酸乙酯萃取，萃取液干燥后加甲醇溶解，过滤，即得；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以水为流动相a，以甲醇为流动相b；梯度洗脱程序如下：

。

进一步地，步骤1)所述对照品溶液每1ml含藁本内酯10～20μg。

进一步地，步骤1)所述对照品还包括洋川芎内酯i、洋川芎内酯h和/或洋川芎内酯a；所述对照品溶液每1ml含洋川芎内酯i20～30μg、洋川芎内酯h2～5μg、洋川芎内酯a15～25μg。

进一步地，步骤2)所述川芎，乙醇，水、乙酸乙酯和甲醇的质量体积比为0.5g：50ml：50ml：15ml：25ml。

更进一步地，所述乙醇是60～80％(v/v,ml/ml)乙醇，优选70％(v/v,ml/ml)乙醇。

进一步地，步骤2)所述川芎粉碎过4号筛。

进一步地，步骤2)所述提取为超声提取，超声提取时间30min。

进一步地，步骤2)所述浓缩为25℃减压浓缩。

进一步地，步骤2)所述干燥为25℃减压干燥。

进一步地，步骤2)所述色谱条件中检测波长：280nm，进样体积为20ul，流速为1ml/min，柱温为25℃。

进一步地，所述指纹图谱中共8个特征峰，与藁本内酯参照物相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±3％范围之内；规定值为峰1:0.421、峰2:0.443、峰3:0.535，峰4:0.760，峰5:0.912，峰6:0.926，峰7:1.000，峰8:1.060。

川芎各提取部位中，乙酸乙酯提取部位是其发挥镇痛作用的有效部位，利用本发明川芎乙酸乙酯部位的指纹图谱检测方法，能同时测定川芎中的洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、洋川芎内酯a、藁本内酯共4种成分，还能对其起镇痛作用的有效部位进行质量控制，方法简便、可靠，且完善了川芎的质量评价体系，保障了川芎的临床疗效，具备实际推广应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1混合对照品(a)(1：洋川芎内酯i；2：洋川芎内酯h；3：洋川芎内酯a；7：藁本内酯)和样品(b)的hplc图谱

图224批川芎乙酸乙酯部位hplc指纹图谱

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的试剂、试药、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明川芎乙酸乙酯部位的指纹图谱检测

1)对照品溶液制备：取洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、洋川芎内酯a、藁本内酯，精密称定，分别加甲醇溶解，制成适当质量浓度的对照品储备液，再精密量取上述储备液至同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、洋川芎内酯a和藁本内酯的质量浓度分别为0.0210mg/ml、0.0038mg/ml、0.0197mg/ml、0.0137mg/ml的混合对照品溶液；

2)供试品溶液制备：取川芎样品粉末(过4号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50ml70％乙醇浸润，称定重量，超声提取半小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液，滤过，滤液经25℃减压浓缩，回收乙醇，得浸膏；取50ml水将浓缩后的浸膏分散，加15ml乙酸乙酯萃取，重复两次，合并萃取液，25℃减压干燥成固体，加25ml甲醇溶解，过微孔滤膜，即得；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：gs-120-5-c18(250mm×4.6mm，5μm)柱；检测波长：280nm；进样体积为20μl，流速为1ml/min，柱温为25℃；以水为流动相a，以甲醇为流动相b；梯度洗脱程序如下：

4)川芎乙酸乙酯部位指纹图谱中共8个特征峰，与藁本内酯对照品相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±3％范围之内；规定值为峰1:0.421、峰2:0.443、峰3:0.535，峰4:0.760，峰5:0.912，峰6:0.926，峰7:1.000，峰8:1.060。

以下通过实验例来说明本发明的有益效果：

实验例1

1材料和方法

1.1药物

川芎，采集于四川省各主产区及省外引种地区，经成都中医药大学马逾英教授鉴定为川芎ligusticumchuanxionghort.，样品信息见表1。

表1川芎药材样品信息

1.2试剂

洋川芎内酯i(批号：chb170926)、洋川芎内酯h(批号：chb161228)、洋川芎内酯a(批号：chb160917)、藁本内酯(批号：chb170224)采购于成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均≥98％；

甲醇为色谱纯(美国fisher公司)，水为纯净水，乙醇，乙酸乙酯试剂均为化学纯，由成都市科龙化工试剂厂提供。

1.3仪器

lc-2010a高效液相色谱仪(岛津，日本)，sqp万分之一分析天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)，bt125d十万分之一分析天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)，kq-300超声波清洗机(昆山市超声设备有限公司)，re-5203旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，shb-ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，allegratmx-22rcentrifuge冷冻离心机(美国beckmancoulter公司)，varioskanflash2.4.3全波长多功能读数仪(美国thermo公司)。

2.方法

2.1川芎镇痛有效部位——川芎乙酸乙酯有效部位hplc指纹图谱的研究

2.1.1色谱条件

色谱柱为gs-120-5-c18(250㎜×4.6㎜，5μm)柱；流动相为a(水)-b(甲醇)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：280nm；进样量：20μl；由于川芎乙酸乙酯有效部位成分复杂，经过多次流动相梯度洗脱筛选，得到以下6个能分离出特征峰的洗脱程序：

①0～5min：30％b；5～10min：30％～55％b；10～35min：55％～65％b；35～45min：65％～85％b；

②0～10min：30％～60％b；10～35min：60％～65％b；35～40min：65％～85％b；40～50min：85％～85％b；

③0～10min：30％～60％b；10～15min：60％～65％b；15～20min：65％～85％b；20～25min：85％～85％b；

④0～10min：30％～60％b；10～15min：60％～65％b；15～20min：65％～85％b；20～30min：85％～85％b；

⑤0～15min：30％～65％b；15～40min：65％～75％b；40～50min：75％～85％b；

⑥0～5min：30％～30％b；5～10min：30％～55％b；10～35min：55％～65％b；35～45min：65％～85％b；

由于梯度洗脱程序②-⑥得到的色谱图中洋川芎内酯类化合物分离度差，不满足中国药典规定色谱系统性适用性试验中的分离度大于1.5的要求，故将梯度洗脱程序①用于方法学考察。

2.1.2对照品溶液的制备

取洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、洋川芎内酯a、藁本内酯适量，精密称定，分别加甲醇溶解，制成适当质量浓度的对照品储备液。精密量取上述储备液适量至同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、洋川芎内酯a和藁本内酯的质量浓度分别为0.0210mg/ml、0.0038mg/ml、0.0197mg/ml、0.0137mg/ml的混合对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备

取川芎样品粉末(过4号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50ml70％乙醇浸润，称定重量，超声提取半小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液，滤过，滤液经25℃减压浓缩，回收乙醇。取50ml水将浓缩后的浸膏分散，加15ml乙酸乙酯萃取，重复两次，合并萃取液，25℃减压浓缩，加25ml甲醇溶解，过微孔滤膜，即得。

2.1.4方法学考察

精密度试验：取同一川芎样品供试品溶液(c19)，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰的相对保留时间rsd小于1％，相对峰面积rsd小于3％，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一川芎样品(c19)，共6份，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样分析，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰的相对保留时间rsd小于1％，相对峰面积的rsd小于3％，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一川芎样品供试品溶液(c19)，按“2.1.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8和16h进样分析，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰的相对保留时间rsd小于1％，相对峰面积的rsd小于3％，表明供试品溶液在16h内稳定性良好。

2.1.5样品测定

24批样品按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液的制备，“2.1.1”项下色谱条件进行分析，记录45min的色谱图。

2.1.6数据分析

将24批川芎有效部位样品的hplc色谱图导入国家药典委员会—中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a)进行相似度评价。采用spss21.0软件对24批川芎有效部位样品指纹图谱中的共有峰进行主成分分析。

3.结果

通过将对照品和样品的色谱图和紫外光谱进行比对，对样品中的色谱峰进行确认，指认了4个色谱峰，结果见图1。

将24批川芎样品乙酸乙酯部位的hplc色谱图导入国家药典委员会—中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a)，设置s1号样品为参照图谱，对照图谱生成方法选择中位数，时间窗宽度设为0.5，通过多点校正和自动匹配，最终确定8个峰为特征峰，结果见图2，对其图谱数据分析得出：川芎乙酸乙酯部位指纹图谱中8个特征峰，与藁本内酯对照品相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±3％范围之内；规定值为峰1:0.421、峰2:0.443、峰3:0.535，峰4:0.760，峰5:0.912，峰6:0.926，峰7:1.000，峰8:1.060。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a)对24批样品色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，结果见表2。24批川芎乙酸乙酯部位的相似度在0.967～1.000之间，表明各地川芎乙酸乙酯部位的化学成分整体上是趋于一致的，但由于24批川芎样品在海拔、光照、降雨量、土壤等产地生态环境上存在差异，故而不同批次样品在该部位化学成分的含量上有一定的差异。

表224批川芎乙酸乙酯部位指纹图谱与对照指纹图谱的相似度结果

对24批样品中的8个共有峰进行kmo统计量和bartlett检验，结果表明可以进行主成分分析。通过主成分分析共获得4个主成分，累计贡献率为83.952％。计算24批样品中的4个主成分得分，并通过个体综合评判函数(c)对24批样品进行综合评判，评判结果见表3。由表可知，24批样品的综合评判得分在-0.584～1.145之间，根据该得分，可对其进行质量评控。

表324批川芎的主成分和综合评判得分

实验结果说明，本发明通过检测前述8个峰，可以用于川芎乙酸乙酯部位的质量控制，如果有这8个峰，可以判断为川芎乙酸乙酯部位，若没有这8个峰，则判断为不是川芎乙酸乙酯部位或者质量不合格的川芎乙酸乙酯部位；同时还可以同时检测洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、洋川芎内酯a、藁本内酯共4种成分的含量。

综上，川芎各提取部位中乙酸乙酯提取部位是其发挥镇痛作用的有效部位，不同产地川芎乙酸乙酯有效部位的hplc指纹图谱研究表明，各产地川芎乙酸乙酯有效部位中化学成分类型基本一致，但含量有所差异。本发明检测方法为川芎乙酸乙酯有效部位的质量控制提供了依据，完善了川芎的质量评价体系，保障了川芎的临床疗效，具备实际推广应用价值。