一种动态检测蛋白质O-GlcNAc糖基化的探针及其制备方法与应用与流程

本公开涉及分子生物学领域，尤其涉及一种动态检测蛋白质o-glcnac糖基化的探针及其制备方法与应用。

背景技术：

蛋白质o-glcnac糖基化是一种在蛋白质丝、苏氨酸残基上连接单个n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)的动态可逆的翻译后修饰，细胞内蛋白质o-glcnac糖基化的水平由n-乙酰氨基葡萄糖转移酶(ogt)和n-乙酰氨基葡萄糖苷酶(oga)两种互相拮抗的酶共同维持，它们分别催化glcnac在蛋白质上的添加和去除。这种修饰参与细胞众多生物学过程。

目前已知的蛋白质o-glcnac糖基化检测方法包括凝集素检测法、代谢标记检测法、酶标记检测法和抗体检测法：

1、凝集素检测法：小麦胚芽凝集素(wheatgermagglutinin,wga)是一种常见的植物凝集素，它不仅能与o-glcnac单结合，还能与末端含有n-乙酰氨基葡萄糖或壳聚糖的低聚糖结合。

2、代谢标记检测法：原理是将具有特殊修饰基团的glcnac类似物(如glcnaz，glcnalk)引入细胞中，该类似物进入体内代谢通路后将转化成udp-glcnac的类似物，最后以代谢方式将glcnac类似物传递到o-glcnac糖基化修饰的蛋白质中。glcnac类似物上还可以添加酮类、叠氮化物或巯基等基团，例如，利用叠氮化修饰的n-乙酰氨基葡萄糖(n-azido-acetylglucosamine，glcnaz)对活细胞进行代谢标记，由于glcnaz也可以被转移到蛋白质底物上，后续可以通过这个叠氮化物基团引入flag或者biotin等标签，从而用于o-glcnac糖基化底物的检测和富集。

3、酶标记检测法：β-1,4-半乳糖转移酶催化含有酮类基团的半乳糖转移到o-glcnac的羟基氧原子上，然后通过后续反应使生物素特异地连接到酮类基团上，最后利用hrp标记的链霉亲和素(streptavidin)抗体来识别生物素，从而达到富集和鉴定o-glcnac糖基化修饰的目的。

4、抗体检测法：目前常用的商业化o-glcnac抗体有两种：rl2和ctd110.6。rl2是针对核孔蛋白糖基化多肽序列制备的抗体，可以特异性地识别o-glcnac糖基化修饰的蛋白质；ctd110.6是针对rna聚合酶ii的c端结构域糖基化多肽序列制备而来的igg单克隆抗体，其肽段序列依赖性较小，所识别的o-glcnac糖基化修饰的蛋白质种类多。

然而，上述检测方法却各有各的缺陷：在凝集素检测法中，wga与o-glcnac单糖结合较弱，且在识别o-glcnac糖基化蛋白质时具有选择性，更倾向于与核膜以及核孔中的组分结合；代谢标记检测法则需要进行多步反应，局限性较大；酶标记检测法依赖于代谢标记，且需要在体外进一步对o-glcnac进行修饰，期间并未考虑到细胞识别底物的倾向性问题；而抗体检测法所使用的o-glcnac糖基化抗体对底物的识别有一定序列偏好性，不能用于活体检测。

因此，亟需提供一种可用于活体检测，并可对蛋白质o-glcnac糖基化进行动态监测的试剂和方法。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种动态检测蛋白质o-glcnac糖基化的探针及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种动态检测蛋白质o-glcnac糖基化的探针，包括oga失活突变体、蛋白标签和荧光分子标记；所述oga失活突变体的氨基酸序列如seqidno.1所示。

所述oga失活突变体为n-乙酰氨基葡萄糖苷酶的失活突变体的截短序列(31位-618位)，来源于产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)，所述失活突变体具体为在oga蛋白的全长氨基酸序列的第298位发生天冬氨酸→天冬酰胺的突变，因此简称cpogad298n，对应seqidno.1所示的氨基酸序列中的第268位。

所述oga失活突变体可以很好的识别o-glcnac糖基化的肽段，且与这些肽段结合的解离常数达到μm甚至nm级别。

所述探针中，所述蛋白标签为halotag，进一步地，所述蛋白标签连接在所述oga失活突变体的n端。

所述探针中，所述荧光分子标记为halotag-alexafluorligand。

第二方面，本发明提供一种前述探针的制备方法，包括如下步骤：

1)构建含有oga失活突变体-蛋白标签融合蛋白基因的表达载体；

2)将步骤1)构建的表达载体转入大肠杆菌中进行表达；

3)对表达得到的融合蛋白纯化并进行荧光分子标记，获得连接有荧光分子标记的oga失活突变体-蛋白标签融合蛋白。

在步骤1)中，所构建的融合蛋白基因表达的氨基酸序列如seqidno.2所示。

需要说明的是，步骤2)向大肠杆菌中转入表达载体并在大肠杆菌中表达、纯化出相应的融合蛋白，步骤3)对oga失活突变体-蛋白标签融合蛋白添加荧光分子标记，根据halotag的化学特性将融合蛋白标记上相应的halotag-alexafluorligand，均属于本领域常规技术手段，本发明对步骤2)和步骤3)的具体操作不再赘述。

第二方面，本发明提供一种动态检测蛋白质o-glcnac糖基化的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含本发明前述的探针。且事实上，包含本发明所述探针在内的所有产品均应属于本发明的保护范围，相关产品可以仅为本发明所提供的探针，即连接有荧光分子标记的融合蛋白，也可以为纳入其他与本申请所提供的探针搭配使用或促进其发挥作用的试剂，所述试剂包括但不限于化学试剂或生物试剂。

第三方面，本发明提供了所述探针在动态检测可逆性蛋白质o-glcnac糖基化方面的应用。

所述应用具体可表现为一种动态检测可逆性蛋白质o-glcnac糖基化的方法，具体为将所述探针通过显微注射方式导入待测样品中，对所述探针的荧光信号的动态变化进行实时成像观察，动态监测蛋白质o-glcnac糖基化的水平变化。

在本发明的一个具体实施方式中，所述待测样品为果蝇的活体早期胚胎。我们将o-glcnac新型荧光探针通过显微注射导入活体果蝇的早期胚胎中，并对荧光探针的动态变化进行实时成像观察，结果显示在果蝇早期胚胎有丝分裂过程中，可以动态的监测o-glcnac糖基化水平变化。

在细胞染色实验中我们观察到在低o-glcnac糖基化的背景/高o-glcnac糖基化背景的细胞中，本发明所述探针分别表现出低荧光信号和高荧光信号，本发明所提供的探针可以特异性地识别o-glcnac糖基化修饰底物；在果蝇三期幼虫唾液腺多线染色体的染色结果中，我们观察到新型荧光探针识别的o-glcnac糖基化修饰底物与目前已知底物的亚细胞定位相吻合。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种可在活体中对蛋白质o-glcnac糖基化进行动态检测和监测的探针，该探针在识别底物时序列偏好性较小，且不存在识别底物的倾向性问题，并具有高特异性、高灵敏度的特点。此外，本发明所提供的探针还具有低毒性的优势，在进行活体检测时，不会对果蝇早期活胚胎的有丝分裂造成明显损伤，而现有的o-glcnac糖基化探针wga会影响早期胚胎有丝分裂时间，尤其在高浓度时会对细胞核造成较大损伤。

本发明所提供的探针在使用时操作方便，通过对其荧光信号进行实时监测即可。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。

为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所述探针对固定后细胞的免疫荧光实验。

图2为本发明所述探针对果蝇三期幼虫唾液腺多线染色体的免疫荧光染色。

图3为不同探针在果蝇活体胚胎中的信号对比。

图4为本发明所述探针对活胚胎发育过程中的动态o-glcnac糖基化水平检测。

图5为本发明所述探针和已知探针wga的细胞毒性试验。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述探针的制备方法，具体包括如下步骤：

一、构建含有oga失活突变体-蛋白标签融合蛋白基因的表达载体。

1、构建含有oga失活突变体-蛋白标签融合蛋白基因

以产气荚膜梭菌clostridiumperfringens的基因oga(cpoga)的cdna为模板，根据目的片段两端的序列设计如下引物，正向引物与质粒骨架有32bp重叠，反向引物与halotag有20bp重叠。：

f：5’-catatgtcagtggtggtggtggtggtgctcgagacttaaagcttcttgtata-3’；

r：5’-cgacgctcgagatttccggcggatccgtaggacctaaaactgggga-3’。

通过pcr获得其cdna的截短片段(第38位氨基酸到第618位丝氨酸序列)，并pcr时在oga末端引入6×his标签蛋白序列(用于纯化融合蛋白时使用)。

再设计引物，从含有halotag的质粒上将halotag克隆出来，正向引物与cpoga有20bp重叠，反向引物与质粒骨架有20bp重叠，具体引物如下：

f：5’-tccccagttttaggtcctacggatccgccggaaatctcgagcgtcg-3’；

r：5’-tttaagaaggagatataccatggcagaaatcggtactgg-3’。

2、构建含有oga失活突变体-蛋白标签融合蛋白基因的表达载体

(1)以pet28halobackbone为载体，从载体的多克隆位点中选取合适的酶切位点进行酶切(ndei酶和ncoi酶)。将载体和目的片段按照摩尔比1:2-1:5的比例混合，总体积5μl，然后加入15μlmastermixture(商业产品，配方已知)，50℃15min；

(2)转化，涂抗性培养皿，37℃培养过夜；

(3)挑单克隆进行菌液pcr鉴定或酶切鉴定；

(4)选择正确菌落送公司测序；

(5)根据测序结果保存并扩增新构建的质粒；

(6)突变体的构建：

设计质粒突变引物，将上述克隆好的野生型cpoga序列进行突变，使其cdna第298位天冬氨酸变为天冬酰胺。引物设计如下：

f：5’-gctgcactcttatcttgaatatcatcccaatagattgcaaaac-3’；

r：5’-gttttgcaatctattgggatgatattcaagataagagtgcagc-3’。

在pcr产物中加入dpni酶处理模板质粒，只留下产物质粒。

转化，涂抗性培养皿，37℃培养过夜；

挑单克隆进行菌液pcr鉴定或酶切鉴定；

选择正确菌落送公司测序；

根据测序结果保存并扩增新构建的cpoga突变质粒。

二、将构建的表达载体转入大肠杆菌中进行表达。

(1)将构建好的质粒转化到rosetta菌中，37℃培养过夜；

(2)用3l的锥形瓶配1l的lb，灭菌备用；同时配两面sds胶备用；

(3)挑单克隆到3mllb中摇菌4h，吸出20μl菌液留待跑胶，然后1:2000加入1m的iptg，37℃诱导4h，留取20μl样品；

(4)将诱导前诱导后的菌液样品加入裂解液，95℃煮样5min，上样跑胶，然后根据考马斯亮蓝染色结果判断蛋白质诱导是否成功，诱导后目的蛋白表达量急剧增加；

(5)将能成功诱导蛋白质表达的菌液1：1000接种到3l的锥形瓶中，37℃培养4h左右；

(6)诱导：待锥形瓶中菌液摇至微浑浊(a600＝0.6)，吸出20μl菌液留待跑胶，然后1：2000加入1m的iptg，20℃诱导过夜，留取20μl；

(7)取出菌液，先将离心瓶称重记录在瓶身上，然后将菌液装进离心瓶，4000g，4℃离心15min；

(8)去上清液，称重，减去瓶子的重量，得出菌的重量，然后每克菌加入10mllysisbuffer，重悬，冰上放置约10min；

(9)压力破碎：放掉高压均质仪中的酒精，用水冲二遍，用lysisbuffer平衡一遍，加入菌液，橡胶管中有菌液出现时开始加压，(一定注意压力不要超过800kpa)菌液过三到五遍至不粘稠；

(10)12000g，4℃离心20min，上清留取20μl样品，沉淀留取20μl待跑胶；

(11)将2mlni-nta加入纯化柱，待乙醇滤过，用水冲洗，加入lysisbuffer平衡柱子(用中枪头做一个塞子塞住柱子底部，避免滤膜干太久)；

(12)将上清液与ni-nta混匀，4℃摇床孵育2h；

(13)450g离心，弃去大部分上清液；然后4℃过柱，滤过液收集20μl；

(14)用5mlwashbuffer洗柱子3次，收集滤过液样品；

(15)塞上柱子的塞子，加入1mlelutionbuffer，孵育5min，收集洗脱液，重复加入1mlelutionbuffer，孵育5min，收集洗脱液(于同一管)，留取20μl，一共得到5ml洗脱下来的蛋白质样品；

(16)将样品加入透析膜中，两端夹紧，4℃透析4小时，然后晚上换一次透析液透析过夜；

(17)浓缩：根据样品分子量大小选择合适的浓缩管，一般浓缩管能浓缩比管子标准分子量大三倍以上的蛋白质；浓缩以后测蛋白浓度，分装，标记好，在液氮中速冻，然后冻存于超低温冰箱；

(18)将纯化过程中搜集到的每一步的样品加入4μl5×samplebuffer，点离，95℃煮10min；取出配好的sds胶，配电泳液，点样，跑胶；

(19)考马斯亮蓝染色后分析结果，确定样品纯化成功。

三、对表达得到的融合蛋白的细胞进行荧光分子标记，获得连接有荧光分子标记的oga失活突变体-蛋白标签融合蛋白，即得本发明所述探针。

(1)先用透析液补齐且稀释halotag-alexafluorligand(该标记物在dmso中保存，为防止标记蛋白时dmso对蛋白质造成影响，提前稀释使得dmso仅占10％)；待标记的蛋白质与halotag-alexafluorligand按摩尔比1:1计算两者所需的量进行混合。室温避光孵育30min。

(2)选用ge-healthcareg50柱子分离标记蛋白：1、g-50预处理：涡旋以重悬树脂，拧断柱子下端cap，将柱子装入收集管中，2000g离心1min，加入透析液平衡柱子；2、样品处理：树脂转新dnase-freeep管中，将反应后的样品加入树脂中；3、2000g离心2min以分离游离的染料。

(3)收集标记好的蛋白质样品，分装标记好，在液氮中速冻，然后冻存于超低温冰箱。

实施例2

本实施例用于说明本发明所述探针的应用。

1、利用本发明所述探针对固定后的细胞进行免疫荧光实验。

实验方法：

(1)将细胞种于预先铺好细胞爬片的24孔板，提前加入适量多聚赖氨酸处理爬片4小时；

(2)在hela细胞中转染pcdh-gfp-cpoga质粒进hela细胞中(该质粒是由cpoga片段克隆进pcdh-gfp载体中的，在细胞表达gfp-oga融合蛋白，达到去o-glcnac糖基化的目的。)在另一组hela细胞中转染pcdh-gfp-ogt质粒(该质粒由人源ogt基因克隆进pcdh-gfp载体中，达到增加o-glcnac糖基化水平的目的。)；

(3)固定：去培养基，用1×pbs洗掉残余培养基，每个孔加入200μl细胞固定液，室温孵育15min；

(4)透化：去固定液，用1×pbs洗两次，加入pbst，室温下透化15min；

(5)封闭：用注射器小心挑出细胞爬片置于避光盒中，每个细胞爬片滴加50μl封闭液5％bsa(pbs配制)，室温封闭1h；

(6)除本发明所述探针外的其他抗体按1：100稀释比例配制一抗(5％bsa配制)，去封闭液，每个细胞爬片滴加100μl的一抗，室温孵育1h；

(7)洗一抗：回收一抗，用1×pbs轻柔冲洗5次，每次间隔5min；

(8)二抗：按1:200稀释荧光二抗于5％bsa中，同时本发明所述探针在5％bsa封闭液中按1：50比例稀释同时孵育，每个细胞爬片逐滴加入100μl，室温孵育1h；

(9)染dapi：二抗染色的最后5min，1:1000加入dapi储液，染色5min；

(10)洗二抗：去二抗，用0.1％pbst缓缓冲洗5次，每次间隔5min；

(11)封片：用去离子水冲洗一次细胞爬片，取3.8μl的50％甘油滴在载玻片上，将盖玻片成45度角扣在封片甘油上，细胞面贴于载玻片上，用移液器吸取指甲油封闭细胞爬片的边缘，4℃避光保存；

(12)成像：用激光共聚焦显微镜拍摄。

实验结果：

在过表达gfp-oga融合蛋白的hela细胞中，oga酶降低细胞内o-glcnac糖基化修饰水平，我们可以看到相对于对照细胞，本发明所述探针的荧光信号显著降低。同样在过表达gfp-ogt的hela细胞中，ogt增加了细胞内o-glcnac糖基化修饰水平，此时新型荧光探针染色的荧光信号明显增加(如图1所示)，绿色荧光代表oga或ogt，紫色代表alexa660-halotag-cpoga^d298n，红色代表tom20，蓝色代表细胞核。scalebar＝20μm。

2、利用本发明所述探针对固定组织(果蝇三期幼虫唾液腺)多线染色体进行免疫荧光染色实验。

实验方法：

(1)取几条三龄幼虫，于pbs中洗去食物残渣；

(2)在干净的解剖板上，滴上一滴pbs，hl3解剖液中解剖出唾液腺；

(3)解剖出唾液腺，将唾液腺转移至固定液1中，固定5min；

(4)将唾液腺转移至固定液2中，固定2min(时间不可过长，唾液腺会脆)；

(5)在18mm×18mm盖玻片上滴30μlacidsolution，将唾液腺转移到acidsolution中，立即用载玻片正面朝下倒吸盖玻片，翻转过来；

(6)用镊子轻轻翘起盖玻片再放下，重复三到四次，使唾液腺被压碎；

(7)用橡皮斜着敲击盖玻片(用手扶住盖玻片避免滑动)；

(8)立即用镊子夹住玻片浸入液氮，至不冒泡为止(约15s)；取出玻片，立即用刀片翘起盖玻片，并把载玻片浸入pbs中，或者将pbs滴加在pbs区域；

(9)本发明所述探针染色：pbst洗涤3次/5min，然后5％山羊血清(0.3％pbst)洗两次，然后封闭60min。上抗体(稀释于0.3％pbst配制5％山羊血清)，用30μl终浓度10ug/ml荧光标记的cpoga^d298n蛋白和一抗(p-h31:200)避光室温孵育30min，结束后用冷pbst洗3次/5min；1:500稀释荧光二抗，室温孵育10min。然后在用pbs洗5次，再用pbst，洗1次封片)切记不要干了；

(10)封片，激光共聚焦荧光显微镜成像。

实验结果：

我们观察到本发明所述探针识别的o-glcnac糖基化修饰底物与目前已知底物的亚细胞定位相吻合(如图2所示)。绿色代表alexa488-halotag-cpoga^d298n，红色代表ph3(磷酸化组蛋白h3)。scalebar＝20μm。

以上实验均证明了本发明所述探针具有较高的特异性。

实施例3

本实施例用于说明本发明所述探针在活体动态检测o-glcnac糖基化方面的应用。

首先，参照实施例1方法，构建同时发生d298n突变和d401a突变的oga失活双突变体(该突变产物即不能识别糖基化底物也失去了催化活性)，制备halotag-cpoga^d298n,d401a。

然后，将本发明所述探针通过显微注射导入his2av-mrfp果蝇中，并对halotag-cpoga^d298n荧光探针的荧光信号进行观察，并将halotag-cpoga^d298n,d401a与wga(已知的o-glcnac糖基化探针)共注射作为实验对照组，结果显示本发明所述探针与wga探针的定位相吻合(如图3所示)。说明本发明所述探针具有良好的特异性和灵敏度，而含有双突变体的halotag-cpoga^d298n,d401a既不具备去o-glcnac糖基化的催化能力，也无法结合o-glcnac糖基化的肽段。

接下来，我们将本发明所述探针通过显微注射导入his2av-mrfp果蝇中，并对活胚胎发育过程中荧光信号进行了实时观察。拍摄该胚胎cellcycle11～14次的动态荧光信号(如图4所示)。绿色代表alexa488-halotag-cpoga^d298n，红色代表组蛋白his2av。scalebar＝10μm。由此可以说明，本发明所述探针可以实现活体o-glcnac糖基化的动态检测。

实施例4

本实施例用于说明本发明所述探针在活体动态检测时的低毒性特点。

分别将蛋白质储存缓冲液、1250μg/ml的wga探针和800μg/ml的halotag-cpoga^d298n(本发明所述探针)注射导入至过表达his2av-mrfp的转基因果蝇胚胎region2中，并同时拍摄该胚胎region1和region2中cellcycle12～13的动态荧光信号，以探究该o-glcnac新型荧光探针是否会影响活体组织细胞的有丝分裂过程。绿色代表wga或alexa488-halotag-cpoga^d298n，红色代表组蛋白his2av。scalebar＝5μm。

结果如图5所示，由图可知，wga探针进行胚胎注射的区域相对于未注射区域的有丝分裂不同步，而注射本发明所述探针(o-glcnac新型荧光探针)和蛋白质储存缓冲液的相应位置未发现明显异常。且统计结果表明注射wga探针的实验组中细胞周期相对延长，而注射高浓度的o-glcnac新型荧光探针对细胞周期没有明显影响。

这些实验结果进一步证明了本发明所开发的o-glcnac新型荧光探针应用于活体组织细胞中检测蛋白质o-glcnac糖基化修饰相对于wga细胞毒性较低，对细胞的损伤程度比现有探针更小。

以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。