一种用于定量测定尿素的试纸及其制备方法与流程

本发明属于体外诊断领域，涉及尿素的检测，具体涉及一种用于定量测定尿素的试纸及其制备方法。

背景技术：

尿素（urea）是体内氨基酸分解代谢的终末产物。肝细胞可以使氨生成尿素，肝脏是生成尿素的最主要器官。尿素是血液中非蛋白氮的主要成分，正常情况下约占非蛋白氮总量的50%。尿素主要由肾脏排泄，血液中尿素全部由肾小球滤过，30%～40%被肾小管重吸收，肾小管亦分泌少量尿素，严重肾衰时分泌量增加。尿素的测定是常用的衡量肾小球功能的指标之一。

目前临床实验室测定尿素最常用的方法有二乙酰-肟显色法和酶偶联速率法（尿素酶法偶联谷氨酸脱氢酶）。二乙酰-肟法是根据二乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物的显色反应。由于二乙酰本身不稳定且反应中需加入腐蚀性的试剂，临床检测已经很少使用。酶偶联速率法仅能检测血清和血浆样本且需要专门的设备进行检测，操作也比较复杂。

有鉴于此，非常有必要开发一款操作简单且适用于多种样品类型的尿素定量检测产品。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种用于定量测定尿素的试纸，无需离心、也无需大型检测设备就能简单、快速的定量检测出尿素的含量。本发明的另一目的在于提供所述用于定量测定尿素的试纸的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于定量测定尿素的试纸，包括从上到下依次粘合的扩散层、滤血层、反应层、疏水透气显色层。

所述的扩散层选用亲水性网布材料，例如，具有亲水性的纱网、纱布、无纺布、聚酯纤维等。

所述的滤血层选用玻璃纤维膜材料，例如，市售palla/d玻璃纤维膜，palla/e玻璃纤维膜，whatmanfuson5玻璃纤维膜等。滤血层包含如下组分：缓冲盐、二价金属离子、聚乙烯吡咯烷酮、血凝素或抗红细胞抗体。滤血层的ph值优选为9.0～12.0。

所述的反应层选用滤纸材料，滤纸材料的厚度优选为0.3-0.6mm。反应层包含如下组分：缓冲盐、二价金属离子、表面活性剂、脲酶、多糖、抗坏血酸氧化酶、多元醇、聚乙烯吡咯烷酮和酶保护剂。反应层的ph值优选为9.0～12.0。

所述的疏水透气显色层选用丙烯酸共聚物膜，例如，市售的versapor-200r，versapor-450r，versapor-800r等，疏水透气显色层孔径优选为0.2-1.2μm。疏水透气显色层的上表面为疏水透气层、下表面为显色层，显色层包含如下组分：醇类和显色剂。显色层的ph值优选为3.0～6.0。

所述的缓冲盐优选为n-环己基-2-氨基乙磺酸（ches）、n-环己基-3-氨基丙磺酸（caps）、甘氨酸、三羟甲基甲胺基丙磺酸（taps）和tris-盐酸中的一种或几种。

所述的二价金属离子优选为镁离子、锌离子、亚铁离子、锡离子、铅离子、钙离子和锰离子中的任意一种。

所述的表面活性剂优选为吐温-20、吐温-80、曲拉通-100、brij-35、brij-58和ls-114中的一种或几种。

所述的多元醇和多糖可以选用本领域常用的多元醇和多糖，例如，多元醇可以选择山梨醇、木糖醇等，多糖可以选择海藻糖、蔗糖等，多元醇和多糖的具体种类在本发明中并不做特别的限定。

所述的酶保护剂可以选用本领域常用保护剂，例如，牛血清白蛋白、酪蛋白、山梨醇和聚乙二醇等，酶保护剂的具体种类在本发明中并不做特别的限定。

所述的醇类优选为甲醇、乙醇、正丁醇和正戊醇中的一种或几种。

所述的显色剂优选为溴酚蓝、溴甲酚绿和溴百里酚蓝中的一种或几种。

进一步地，所述的用于定量测定尿素的试纸还包括上板和下板，上板设有加样孔，下板设有透光孔。所述的试纸从上到下依次为上板、扩散层、滤血层、反应层、疏水透气显色层、下板。上板、下板采用abs材质的塑料。

所述的用于定量测定尿素的试纸的制备方法，包括如下步骤：

（1）按如下组成分别配制滤血溶液、反应液、显色剂溶液。

滤血溶液：缓冲盐为50-200mmol/l，二价金属盐为0.2%-2%（质量比），血凝素或抗红细胞抗体为0.1-0.8mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮为0.2%-2%（质量比），溶剂为纯化水，ph为9.0～12.0；

反应液：缓冲盐为100-500mmol/l，表面活性剂为0.2%-1.5%（质量比），二价金属盐为0.2%-2%（质量比），脲酶为50-500u/g，多糖为0.2%-4%（质量比），抗坏血酸氧化酶为200-800u/g，多元醇0.5%-5%（质量比），聚乙烯吡咯烷酮0.1%-5%（质量比），酶保护剂为0.1%-5%（质量比），溶剂为纯化水，ph为9.0～12.0；

显色剂溶液：醇类为98%-99.5%（质量比），显色剂为0.05%-2%（质量比），ph为3.0～6.0。

（2）分别将滤血层材料在滤血溶液中浸泡、反应层材料在反应液中浸泡、显色剂溶液喷涂在疏水透气显色层材料的一面（喷涂显色剂溶液的一面为显色层、另一面为疏水透气层），烘干，依次得到滤血层、反应层和疏水透气显色层，将滤血层、反应层和疏水透气显色层与其他组件组装，得到成品。

步骤（2）中，滤血层材料烘干的条件优选为：烘干温度为37～60℃，烘干时间为10～24h；反应层材料烘干的条件优选为：烘干温度为45～65℃，烘干时间为10～60min；疏水透气显色层材料烘干的条件优选为：烘干温度为45～75℃，烘干时间为5～20min。

本发明相对于现有技术具有如下优点和有益效果：

（1）本发明利用一种特殊材料将疏水透气层和显色层合二为一，使试纸结构更简单，同时检测时间也大大缩短。

（2）本发明提供的试纸结构简单，适用于全血、血浆和血清样本，操作方便3分钟就能得到尿素的检测结果，其适用于医院急诊和家庭检测。

附图说明

图1是本发明用于定量测定尿素的试纸的结构示意图；图中，100-加样孔，200-上板，300-扩散层，400-滤血层，500-反应层，600-疏水透气层和显色层，610-疏水透气层，620-显色层，700-下板，800-透光孔。

图2是本发明检测结果与医院检测结果的线性相关图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本发明中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

一种用于定量测定尿素的试纸，其结构如图1所示，包括上板200、扩散层300、滤血层400、反应层500、疏水透气显色层600、下板700。上板200设有加样孔100；疏水透气显色层600的上表面为疏水透气层610、下表面为显色层；下板700设有透光孔800。

扩散层300、滤血层400、反应层500、疏水透气显色层600从上到下依次粘合，然后和上板200、下板700组装在一起。

实施例1

本实施例的用于定量测定尿素的试纸，其由上板、扩散层、滤血层、反应层、疏水透气显色层、下板组成，其中：

上板采用abs材质的塑料，上板的中间开设有加样孔；

扩散层选用市售的亲水性纱网（选用市售纱帝的亲水系列纱网），将纱网裁切成尺寸4mm*8mm备用；

滤血层是玻纤材料（选用市售的pall系列玻纤材料）在滤血溶液中浸渍，浸渍处理量为495g/m²（即每平方米玻纤材料用495g滤血溶液浸渍），放入鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为37℃，烘干时间为12h，烘干后将玻纤裁切成尺寸4mm*4mm备用，其中滤血溶液的组分组成与配制如下：

纯化水90%（质量比）

氯化镁1%（质量比）

ches100mmol/l

抗红细胞抗体0.2mg/ml

聚乙烯吡咯烷酮1%（质量比）

用6mnaoh调整滤血溶液的ph至9.0±0.05，并用纯化水补足至100%。

反应层是厚度为0.5mm的滤纸在反应液中浸渍，浸渍处理量为50g/m²，放入鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为55℃，烘干时间为30min，烘干后将滤纸裁切成尺寸4mm*4mm备用，其中反应液的组分组成与配制如下：

纯化水90%（质量比）

ches100mmol/l

吐温-200.6%（质量比）

氯化镁0.3%（质量比）

海藻糖0.5%（质量比）

聚乙烯吡咯烷酮0.75%（质量比）

脲酶100u/g

抗坏血酸氧化酶200u/g

山梨醇1.5%（质量比）

牛血清白蛋白0.3%（质量比）

用6mnaoh调整反应液的ph至9.0±0.05，并用纯化水补足至100%。

疏水透气显色层共用一层材料，是孔径为0.2μm的丙烯酸共聚物膜（选用市售的versapor系列膜），将显色剂溶液喷涂在丙烯酸共聚物膜的一面（喷涂显色剂溶液的一面为显色层、另一面为疏水透气层），喷量为15g/m²，放入鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为50℃，烘干时间为5min，烘干后将丙烯酸共聚物膜切成尺寸4mm*4mm备用，其中显色剂溶液的组分组成与配制如下：

溴酚蓝0.1%（质量比）

乙醇90%（质量比）

用1mnaoh调整显色剂溶液的ph至3.0±0.05，加乙醇补足至100%。

下板采用abs材质的塑料，下板设有透光孔。

将上述制备好的扩散层、滤血层、反应层、疏水透气显色层自上而下粘合起来，组合成的试条与上板和下板组装在一起，制得用于定量测定尿素的试纸。

实施例2

本实施例试纸的制备，除滤血溶液的组成为0.5%的氯化镁、150mmol/l的taps、0.3mg/ml的血凝素（pha）、1%的聚乙烯吡咯烷酮外，其它步骤均同实施例1。

实施例3

本实施例试纸的制备，除反应液组成为120mmol/l的ches、0.8%的曲拉通-100、0.6%的氯化锌、150u/g的脲酶、2%的蔗糖、300u/g的抗坏血酸氧化酶、2%的山梨醇、1%的聚乙烯吡咯烷酮、0.5%的酪蛋白外，其它步骤均同实施例1。

实施例4

本实施例试纸的制备，除反应液组成为150mmol/l的ches、1%的曲拉通-100、1%的氯化锌、180u/g的脲酶、2.4%的蔗糖、400u/g的抗坏血酸氧化酶、2%的山梨醇、1.2%的聚乙烯吡咯烷酮、0.8%的酪蛋白外，其它步骤均同实施例1。

实施例5

本实施例试纸的制备，除反应液组成为200mmol/l的ches、1.2%的曲拉通-100、1.2%的氯化锌、200u/g的脲酶、2%的蔗糖、500u/g的抗坏血酸氧化酶、2.3%的山梨醇、1.8%的聚乙烯吡咯烷酮、1.2%的酪蛋白外，其它步骤均同实施例1。

实施例6

本实施例试纸的制备，除反应液组成为300mmol/l的ches、1.5%的曲拉通-100、1.6%的氯化锌、300u/g的脲酶、2.5%的蔗糖、600u/g的抗坏血酸氧化酶、3%的山梨醇、2.5%的聚乙烯吡咯烷酮、1.5%的酪蛋白外，其它步骤均同实施例1。

实施例7

本实施例试纸的制备，除显色剂溶液的组成为0.2%的溴甲酚绿、99.8%的甲醇外，其它步骤均同实施例1。

实施例8

本实施例试纸的制备，除滤血层的烘干温度为55℃、烘干时间为10h外，其它步骤均同实施例1。

实施例9

本实施例试纸的制备，除反应层的烘干温度为65℃、烘干时间为15min外，其它步骤均同实施例1。

实施例10

本实施例试纸的制备，除疏水透气显色层的烘干温度为55℃，烘干时间为6min外，其它步骤均同实施例1。

实施例11

本实施例试纸的制备，除用6mnaoh调整滤血溶液的ph至10.0±0.05外，其它步骤均同实施例1。

实施例12

本实施例试纸的制备，除用6mnaoh调整反应液的ph至10.0±0.05外，其它步骤均同实施例1。

实施例13

本实施例试纸的制备，除用1mnaoh调整显色溶液的ph至4.0±0.05外，其它步骤均同实施例1。

实施例14

本实施例试纸的制备，除疏水透气显色层选用孔径0.45μm丙烯酸共聚物膜外，其它步骤均同实施例1。

实施例15

本实施例试纸的制备，除疏水透气显色层选用孔径0.8μm丙烯酸共聚物膜外，其它步骤均同实施例1。

实施例16

本实施例试纸的制备，除疏水透气显色层选用孔径1.2μm丙烯酸共聚物膜外，其它步骤均同实施例1。

比较例1

本实施例试纸的制备，将疏水透气层和显色层分开，疏水透气层选用市售的纱帝疏水纱网，裁切成4mm*4mm备用。

显色层选用厚度为0.2mm透明pet为基材，将显色剂溶液涂布在透明pet上，涂布的厚度为200μm。涂布完后放入鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为55℃，烘干时间为2h，烘干后将显色层切成尺寸4mm*4mm备用，显色剂溶液由如下的组分组成：

纯化水91.3%（质量比）

醋酸纤维素5%（质量比）

二氧化钛2%（质量比）

曲拉通-1000.5%（质量比）

甘油1%（质量比）

溴酚蓝0.2%（质量比）

其它步骤均同实施例1。

比较例2

本实施例试纸的制备，将疏水透气层和显色层分开，疏水透气层选用市售的纱帝疏水纱网，裁切成4mm*4mm备用。

显色层选用厚度为0.2mm透明pet为基材，将显色溶液涂布在透明pet上，涂布的厚度为200μm。涂布完后放入鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为55℃，烘干时间为2h，烘干后将显色层切成尺寸4mm*4mm备用，显色剂溶液由如下的组分组成：

纯化水87.1%质量比）

羟丙基甲基纤维素6%（质量比）

二氧化钛4%（质量比）

曲拉通-1001%（质量比）

甘油1.5%（质量比）

溴酚蓝0.4%（质量比）

其它步骤均同实施例1。

比较例3

本实施例试纸的制备，将疏水透气层和显色层分开，疏水透气层选用市售纱帝的疏水系列纱网，裁切成4mm*4mm备用。

显色层选用厚度为0.3mm透明pet为基材，将显色溶液涂布在透明pet上，涂布的厚度为300μm。涂布完后放入鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为55℃，烘干时间为2h，烘干后将显色层切成尺寸4mm*4mm备用，显色剂溶液由如下的组分组成：

纯化水87.1%（质量比）

羟丙基甲基纤维素6%（质量比）

二氧化钛4%（质量比）

曲拉通-1001%（质量比）

甘油1.5%（质量比）

溴酚蓝0.4%（质量比）

其它步骤均同实施例1。

使用本发明用于定量测定尿素的试纸时，将10μl全血、血清或血浆样本从上板的加样孔中加入，全血、血清或血浆样本经过扩散层均匀扩散至滤血层，与滤血层内的试剂发生反应，红细胞停留滤血层上，样本继续扩散进入反应层，样本中的目标物质尿素经脲酶催化产生nh3，nh3透过疏水透气层，与显色层上的黄色显色剂反应生产蓝色复合物，蓝色复合物颜色的深浅与尿素的浓度呈正比。加样后将试纸直接插入干化学分析仪中，3分钟后结果可在仪器上显示出来。

采用如下方法测试实施例1～16以及比较例1～3中用于定量测定尿素的试纸的性能：分别配制尿素浓度为5mmol/l、50mmol/l和100mmol/l的全血、血清和血浆样本。采用实施例1～16以及比较例1～3中的试纸对这些样本进行测试，浓度相同的样本重复测试5次，测试结果见表1、表2和表3。

表1全血样本检测结果

表2血浆样本检测结果

表3血清样本检测结果

由表1、表2和表3可以看出，实施例1～16中试纸的测试结果偏差和一致性都较好，结果偏差都能保持在10%以内，说明本发明的试纸能够检测全血、血浆和血清中尿素的含量。比较例1、比较例2和比较例3的测试结果偏差都较大，且都是负偏差。可能是比较例中的疏水透气层和显色层分开后，反应的时间不够，导致结果偏差变大。因此，将比较例中的反应时间延长至6分钟，在进行测试。检测结果见下表4、表5和表6。

表4全血样本检测结果

表5血浆样本检测结果

表6血清样本检测结果

由表4、表5和表6可以看出，将比较例中的试纸反应时间延长后，检测结果的一致性和偏差明显变好，结果偏差都能保持在15%以内，这说明疏水透气层和显色层分开后需要更长的反应时间，才能得到比较理想的结果。而本发明将疏水透气层和显色层合二为一，制成的试纸能大大缩短检测时间，并且检测的准确性更佳。

使用实施例1中的试纸，随机选取分布不同浓度的50个尿素全血样本进行测试，然后与医院全自动生化分析仪的检测结果相比进行评价，其检测结果和线性相关性见下表7和图2。

表7本发明检测结果与医院检测结果的对比

通过上述内容可知，本发明用于定量测定尿素的试纸具有以下优势：试纸结构简单，将疏水透气层和显色层合二为一，3分钟就能得到尿素的检测结果，与传统方法比较准确度更高，同时适用于全血、血浆和血清样本，与便携式干化学分析仪一起使用，更适合于医院急诊和家庭用户。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。