一种t-PAI-C标志物检测试剂盒及其配制方法与流程

技术领域：

本发明涉及医疗器械生物类免疫体外诊断相关技术领域，尤其涉及一种t-pai-c标志物检测试剂盒及其配制方法。

背景技术：
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t-pai-c(组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物)是由血管内皮细胞产生的组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogenactivator，t-pa)与生理性抑制因子pai-11∶1结合形成的复合物，组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物不仅是纤溶系统激活的标志物，也是血管内皮损伤的标志物。冠心病患者机体内，t-pa和pai-1含量显著失衡，且与疾病的严重程度呈相关性，临床上可通过组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物判断疾病的预后状况。弥散性血管内凝血(dic)是许多疾病共同发展时凝血功能障碍，后期进展可伴随休克、多器官功能衰竭，病死率极高，目前已知的组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定方法较少，主要有放射免疫法(ria)、胶乳增强免疫比浊法等。但放射免疫法步骤繁琐，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速，但是灵敏度低、低值重复性差。因此，有待开发对组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物检测准确度高、灵敏度高、线性范围宽，能降低检测成本的检测试剂盒。

技术实现要素：
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针对现有技术存在的问题本发明的目的是：提供一种准确性高、灵敏度强、线性范围宽的一种t-pai-c标志物检测试剂盒及制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：应用磁微粒直接化学发光技术，采用双抗体夹心法。制备一种组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物检测试剂盒，包括相互独立包装的试剂1、试剂2、磁微粒试剂、校准品1、校准品2；所述试剂1是由组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物抗体加入缓冲液，经超滤膜超滤后，加入生物素和防腐剂，再加入所述缓冲液使抗体终浓度为1mg/ml，于4℃或室温透析生物素化抗体配制而成，所述试剂2由tris和氯化钠溶解于水后，加入表面活性剂和防腐剂，再与动物血清白蛋白混合溶解配制而成，所述磁微粒试剂由组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物标记抗体与缓冲液混合超滤稀释，再与吖啶酯混合、培养、纯化、再稀释配制而成，所述校准品1和校准品2皆由组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物用1％～5％动物血清白蛋白溶液配制成校准品并冻干，赋值而成。

本发明具有如下优点：

1.本发明的双抗体夹心法组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物检测试剂盒(磁微粒直接化学发光法)各试剂组分包括试剂1、试剂2、磁微粒试剂、校准品1、校准品2、各组分试剂具有稳定性好，效期可至18个月以上，有效降低成本；

2.检测灵敏度高，特异性能好、线性范围宽；

3.在本发明中，经过大量实验的工艺优化，得到完善统一工艺，并严格按照标准生产操作规程和质量控制规程进行生产；

4.用户仅需按照操作说明进行规范操作，就可得到可靠的结果，操作简便。

具体实施方式：

实施例1:

一种配制t-pai-c标志物检测试剂盒的方法如下：

1.1、校准品1的配制：

将组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物用1％～5％牛血清白蛋白溶液配制成校准品并冻干，进行赋值，配制浓度为5ng/ml。

1.2、校准品2的配制：

将组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物用1％～5％牛血清白蛋白溶液配制成校准品并冻干，进行赋值，配制浓度为50ng/ml

1.3、试剂1的配制

取1mg组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗体，用pb缓冲液(ph7.0～8.5)在4℃或室温超滤；将超滤后的组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗体加入0.05mg生物素，再加入pb缓冲液(ph7.0～8.5)使抗体终浓度为0.05～1μg/ml，混匀5min。将混合液置于恒温箱25±1℃，静置反应120±10min。使用pb缓冲液(ph7.0～8.5)于4℃或室温透析生物素化抗体16-24h。

1.4、试剂2的配制

室温条件下，向一定体积的纯化水中加入6.06gtris、9.0g氯化钠和3.8ml浓hcl，至少搅拌5min至完全溶解，然后加入1.0mltween20和5mlproclin300，最后缓慢加入10.0gbsa，至少搅拌10min至完全溶解。待所有成分完全溶解后，用ph计测ph值在7.2±0.1为合格，纯化水定容至1l。

1.5、磁微粒试剂的配制

取1mg组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物标记抗体，用pb缓冲液(ph7.0～8.5)于室温或2～8℃超滤一次。把超滤好的组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物标记抗体用pb缓冲液(ph7.0～8.5)将抗体稀释到1mg/ml，取0.1mg吖啶酯，把抗体与吖啶酯快速混合，再加入pb缓冲液(ph7.0～8.5)使抗体终浓度为0.5mg/ml，混匀5min。将溶液置于恒温箱25±2℃，静置反应120±10min，反应全程需避光。使用脱盐柱进行纯化，纯化好的吖啶酯标记抗体用t-pai-c吖啶酯标记保存液稀释至340～360ng/ml，2-8℃保存待用。

1.6、组装：

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

1.7、主要试剂和材料：

组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物和组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物抗体、牛血清白蛋白、pb缓冲液、生物素、tris、氯化钠、吖啶酯、tween20、proclin300均为sigma公司产品，氯化钠为国药集团化学试剂有限公司产品，hcl为广州化学试剂厂产品，所用化学试剂均为分析纯。

实施例2

一种配制t-pai-c标志物检测试剂盒的方法其如下：

2.1、校准品1的配制：

将组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物用1％～5％马血清白蛋白溶液配制成校准品并冻干，进行赋值，浓度分别为5ng/ml。

2.2、校准品2的配制：

将组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物用1％～5％马血清白蛋白溶液配制成校准品并冻干，进行赋值，浓度分别为50ng/ml

2.3、试剂1的配制：

取1mg组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗体，用tris缓冲液(ph7.0～8.5)在4℃或室温超滤；将超滤后的组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗体加入0.05mg生物素，再加入tris缓冲液(ph7.0～8.5)使抗体终浓度为0.05～1μg/ml，混匀5min。将混合液置于恒温箱25±1℃，静置反应120±10min。使用pb缓冲液(ph7.0～8.5)于4℃或室温透析生物素化抗体16-24h。

2.4试剂2的配制

室温条件下，向一定体积的纯化水中加入6.06gtris、9.0g氯化钠和3.8mlhcl，至少搅拌5min至完全溶解，然后加入1.0mltriton-x100和5ml0.1％～0.5％叠氮钠，最后缓慢加入10.0g马血清白蛋白，至少搅拌10min至完全溶解。待所有成分完全溶解后，用ph计测ph值在7.2±0.1为合格，纯化水定容至1l。

2.5、磁微粒试剂的配制：

取1mg组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物标记抗体，用tris缓冲液(ph7.0～8.5)于室温或2～8℃超滤一次。把超滤好的组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物标记抗体用tris缓冲液(ph7.0～8.5)将抗体稀释到1mg/ml，取0.1mg吖啶酯，把抗体与吖啶酯快速混合，再加入tris缓冲液(ph7.0～8.5)使抗体终浓度为0.5mg/ml，混匀5min。将溶液置于恒温箱25±2℃，静置反应120±10min，反应全程需避光。使用脱盐柱进行纯化，纯化好的吖啶酯标记抗体用t-pai-c吖啶酯标记保存液稀释至340～360ng/ml，2-8℃保存待用。

2.6、组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

2.7、主要试剂和材料：

组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物和组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物抗体、马血清白蛋白、生物素、tris、吖啶酯、triton-x100、叠氮钠均为sigma公司产品，氯化钠为国药集团化学试剂有限公司产品，hcl为广州化学试剂厂产品，所用化学试剂均为分析纯。

实施例3

一种配制t-pai-c标志物检测试剂盒的方法如下：

3.1、校准品1的配制：

将组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物用1％～5％山羊血清白蛋白溶液配制成校准品并冻干，进行赋值，配制浓度为5ng/ml。

3.2、校准品2的配制：

将组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物用1％～5％山羊血清白蛋白溶液配制成校准品并冻干，进行赋值，配制浓度为50ng/ml

3.3、试剂1的配制

取1mg组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗体，用hepes缓冲液(ph7.0～8.5)在4℃或室温超滤；将超滤后的组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗体加入0.05mg生物素，再加入hepes缓冲液(ph7.0～8.5)使抗体终浓度为0.05～1μg/ml，混匀5min。将混合液置于恒温箱25±1℃，静置反应120±10min。使用hepes缓冲液(ph7.0～8.5)于4℃或室温透析生物素化抗体16-24h。

3.4、试剂2的配制

室温条件下，向一定体积的纯化水中加入6.06gtris、9.0g氯化钠和3.8ml浓hcl，至少搅拌5min至完全溶解，然后加入1.0mlctac和5mlkrovin300n，最后缓慢加入10.0g山羊血清白蛋白，至少搅拌10min至完全溶解。待所有成分完全溶解后，用ph计测ph值在7.2±0.1为合格，纯化水定容至1l。

3.5、磁微粒试剂的配制

取1mg组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物标记抗体，用pb缓冲液(ph7.0～8.5)于室温或2～8℃超滤一次。把超滤好的组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物标记抗体用hepes缓冲液(ph7.0～8.5)将抗体稀释到1mg/ml，取0.1mg吖啶酯，把抗体与吖啶酯快速混合，再加入hepes缓冲液(ph8.1)使抗体终浓度为0.5mg/ml，混匀5min。将溶液置于恒温箱25±2℃，静置反应120±10min，反应全程需避光。使用脱盐柱进行纯化，纯化好的吖啶酯标记抗体用t-pai-c吖啶酯标记保存液稀释至340～360ng/ml，2-8℃保存待用。

3.6、组装：

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

3.7、主要试剂和材料：

组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物和组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物抗体，山羊血清白蛋白、生物素、hepes缓冲液、吖啶酯、ctac、krovin300n均为sigma公司产品，氯化钠为国药集团化学试剂有限公司产品，hcl、为广州化学试剂厂产品，所用化学试剂均为国产分析纯。

为进一步说明实施例1～3，进一步细化相关内容如下：所述牛血清白蛋白、所述马血清白蛋白、所述山羊血清白蛋白可概括为动物血清白蛋白；所述proclin300、所述叠氮钠、所述krovin300n可概括为防腐剂；所述pb缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液可概括为缓冲液；所述tween20、所述triton-x100、所述ctac可概括为表面活性剂。

实施例4

为进一步的说明具体实施例1～3，配制的t-pai-c标志物检测试剂盒其检验方法如下：

4.1、试剂处理

4.1.1、将组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定剂盒试剂，装载到深圳市巨东生物医学工程有限公司生产的全自动化学发光试剂仪器上。

4.1.2在软件操作系统上确定装载组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒试剂的名称，将检测样本装载在样本仓上，并在软件操作系统上确定样本检测项目，将反应杯装载满。

4.1.3、试剂在装载前，应轻轻混匀，但禁止上下颠倒已打开的试剂；每次检测样本量需要10μl，考虑检测系统死体积因素，应确保样本量在200μl以上，同时应考虑样本容器的死腔因素。

4.2、定标

4.2.1、每批试剂的试剂盒上都有条形码记录各批号试剂特异的定标信息及预先确定的主曲线。

4.2.2、定标间隔：对不同批号的试剂盒必须重新进行定标。除此之外，以下情况必须重新进行定标：每换一个试剂盒就要定标一次；同一试剂盒在测定仪上使用超过28天；根据需要，如质控数据超过额定的限值。

4.3、计算

仪器自动计算得出每份样本的测定浓度，单位为ng/ml。

4.4、检测结果：

4.4.1、检测曲线：

利用四参数方程绘制曲线，即为检测曲线。该试剂盒线性范围为2～100ng/ml时，线性相关系数≥0.99，见附图1-3。

4.4.2、灵敏度测试：对零校准点进行20次重复测试，计算20次测定值的平均值(m)及标准差(sd)，将m+2sd带入曲线，所得的浓度值即为该试剂盒的灵敏度。三个实施例的检测试剂盒的灵敏度均≤0.01ng/ml。

4.4.3、准确度测试：测量(10±2)ng/ml和(100±20)ng/ml的准确度参考品，三批实施例，相对偏差应在均在±10％区间内。详见表1-3

表1、实施例1准确度测试表

表2、实施例2准确度测试表

表3、实施例3准确度测试表

检验原理：

本产品应用磁微粒直接化学发光技术，采用双抗体夹心法。第一步，将样本和生物素化组织型纤溶酶原激活剂单克隆抗体及吖啶酯标记的纤溶酶原激活物抑制剂-1抗体进行反应，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物。第二步，加入链霉亲和素包被的磁微粒，免疫复合物在链霉亲和素和生物素相互作用下，形成固相。在磁场作用下洗涤后，加入预激发液和激发液，测定化学发光反应的发光值，其发光强度与样本中的组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物浓度成正相关。

附图说明：

图1为实施例1主曲线图

图2为实施例2主曲线图

图3为实施例3主曲线图

表1为实施例1准确度测试表

表2为实施例2准确度测试表

表3为实施例3准确度测试表

综上分析可见，本发明制备的组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒在2～8℃储存条件下能保证存放期限，提高了产品实际利用率；另外，该试剂盒线性范围可达到2～100ng/ml，实验结果表明本检测试剂盒的灵敏度≤0.01ng/ml，相对偏差应在均在±10％区间内，故本组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒具有准确性高、灵敏度强、线性范围宽的特点。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。