复方谷氨酰胺肠溶胶囊中人参皂苷的检测方法与流程

本发明涉及检测方法领域，特别是涉及复方谷氨酰胺肠溶胶囊中人参皂苷的检测方法。
背景技术：
：l-谷氨酰胺是一种具有多种重要生理功能的特殊氨基酸，它的主要功能在于维持肠黏膜结构完整、改善肠道吸收功能，是一种肠黏膜细胞代谢的主要能源物质及肠道必需免疫营养物。l-谷氨酰胺以往被认为是一种不必需氨基酸，如今已被作为“有条件”必需氨基酸。临床研究显示，在正常情况下，体内l-谷氨酰胺合成和利用基本平衡，而在严重应激状态下，l-谷氨酰胺消耗明显增加，使体内l-谷氨酰胺缺乏，从而增加患者感染的风险。四君子汤主要由人参、白术、茯苓和甘草四味中草药组成。人参性甘，为君药，具有补脾养胃、生津益气之效；白术甘苦性温，为臣药，可助君药燥湿健脾、益气助运；茯苓甘淡性平，为佐药，具有渗湿健脾的功效；甘草甘淡，为使药，可用于调和药材，和中益气。四味中草药均为平和之品，相辅相成，不偏不盛，补而不峻，全方配伍共奏健脾养胃、益气补中之效。四君子汤主治脾胃气虚证，现临床多用于治疗慢性胃炎、胃溃疡、功能性消化不良、慢性腹泻、溃疡性结肠炎等胃肠道疾病，且取得了良好的治疗效果。关于四君子汤的药理研究最早可追溯于20世纪70年代，研究者发现四君子汤在调节胃肠道运动、改善营养物质消化吸收等方面有很好的调节作用，可在不同程度上改善脾胃气虚患者胃肠功能紊乱。复方谷氨酰胺肠溶胶囊，是由l-谷氨酰胺和四君子汤为原料制成的复方制剂，可用于各种原因所致的急、慢性肠道疾病和肠道功能紊乱，如肠易激综合征、非感染性腹泻、肿瘤治疗引起的肠道功能紊乱和放疗性肠炎；亦可促进创伤或术后肠道功能的恢复。复方谷氨酰胺肠溶胶囊中l-谷氨酰胺和四君子汤对肠易激综合征治疗理具有协同增效的作用，且用肠溶胶囊进行给药，使得复方谷氨酰胺更能直接作用于肠道，相当于局部或靶向作用，能减少药物在消化道其它部位(主要是胃)的降解和吸收，使得更多的药物到达肠道较单方和普通剂型的复方谷氨酰胺具有更高的特异性和更好的效果，复方谷氨酰胺肠溶胶囊的市场需求正在悄然成长。但在目前的药典中未收载复方谷氨酰胺肠溶胶囊中人参皂苷的检测方法，可见，复方谷氨酰胺肠溶胶囊的质量控制方法，还需进一步开发改进和完善。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种含有人参、白术、茯苓和甘草4种原料和/或提取物的产品中人参皂苷的检测方法，可对复方谷氨酰胺肠溶胶囊更好地进行质量控制。复方谷氨酰胺肠溶胶囊为复方制剂，包含一味化药l-谷氨酰胺与四味中药：人参、茯苓、甘草和白术，人参皂苷检验波长为203nm，近紫外末端吸收，在四味中药基底下存在严重的杂质干扰，且人参皂苷对热敏感，容易发生转化，使得复方谷氨酰胺肠溶胶囊中人参皂苷的检测难度较大。目前，还未有药典、标准文件或文献公开复方谷氨酰胺肠溶胶囊中人参皂苷的检测方法，本发明发明人参考了药典及国内外许多关于检测人参皂苷的文献的方法对复方谷氨酰胺肠溶胶囊进行检测时，发现人参皂苷rg1、re附近有许多杂质干扰，采用现有的方法均无法将其中的人参皂苷rg1、re有效分离，干扰严重无法进行计算，且对人参皂苷损耗较明显(回收率低)。在本发明中，发明人开发了新的提取方法和检测方法，能够高效提取出复方谷氨酰胺肠溶胶中的人参皂苷，将复方谷氨酰胺肠溶胶囊中的人参皂苷rg1与人参皂苷re分离，进而可对复方谷氨酰胺肠溶胶囊进行很好地质量控制。本发明提供了含有人参、白术、茯苓和甘草4种原料和/或提取物的产品中人参皂苷的检测方法，采用高效液相色谱进行定性或/和定量检测含有人参、白术、茯苓和甘草4种原料和/或提取物的产品中的人参皂苷，液相色谱的检测条件包括：色谱柱：rp18或等效色谱柱；流动相：流动相a、流动相b；其中，流动相a为乙腈；流动相b为水；流动相采用如下梯度洗脱程序：表1时间(min)流动相a(vol.％)流动相b(vol.％)016～2278～8433～2716～2278～8453～5724～2674～76。进一步地，流动相采用如下梯度洗脱程序：表2时间(min)流动相a(vol.％)流动相b(vol.％)01981351981552575。在研发过程中发现，人参皂苷对流动相中乙腈的浓度十分敏感，即使乙腈的浓度略微改变，保留时间也漂移明显，发明人经过不断地对流动相的梯度变化进行尝试，终于得到了本发明可将复方谷氨酰胺肠溶胶囊中人参皂苷rg1、re有效分离的梯度洗脱程序。对于本发明的检测方法，由于检测难度是因为人参、白术、茯苓和甘草4种药材组合后基底下存在严重的杂质干扰，影响了人参皂苷的检测。因此，虽然本发明实施例中的检测产品为复方谷氨酰胺肠溶胶囊，但并不能因此限定本发明仅适用于复方谷氨酰胺肠溶胶囊的检测，本发明实际上是解决了含有人参、白术、茯苓和甘草的产品中人参皂苷无法与杂质有效分离、无法被准确检测的问题，只要是含有人参、白术、茯苓和甘草的原料和/或提取物产品中人参皂苷的检测，均可用本发明检测。所述流动相的梯度洗脱程序中，时间只限定到55min，并不代表所述梯度洗脱程序只包括0～55min，此处对梯度洗脱程序的限定应认为是开放式限定，梯度洗脱程序在55min以后还可继续包括其它的洗脱程序。进一步地，在本发明的具体实施方式中，流动相在55min以后采用如下梯度洗脱程序：表3时间(min)流动相a(vol.％)流动相b(vol.％)7029711004060100.119811201981。在本发明中，所述人参皂苷至少包括人参皂苷rg1和/或人参皂苷re。在本发明的具体实施方式中，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：i色谱柱规格：4.6×250mm，3～5μm；ii柱温：28～32℃；iii流速：0.8～1.2ml/min；iv检测波长：203±2nm。进一步地，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：i色谱柱规格：4.6×250mm，5μm；ii柱温：30℃；iii流速：1.0ml/min；iv检测波长：203nm。进一步地，色谱柱采用symmetryshieldrp18色谱柱；发明人在研发过程中，测试了十余根不同品牌和不同填料的色谱柱的出峰情况，发现只有使用symmetryshieldrp18色谱柱时，才能实现复方谷氨酰胺肠溶胶囊中人参皂苷rg1、re的有效分离。更进一步地，进样量为5～50μl。在本发明的具体实施方式中，进样量为10μl。进一步地，本发明检测方法还包括制备供试品溶液，包括如下步骤：(1)将含有人参、白术、茯苓和甘草4种原料和/或提取物的产品用水饱和正丁醇超声提取后，滤过得滤液；(2)将滤液用正丁醇饱和的氨试液碱洗1次，分别收集有机相与氨水相，将有机相在60～80℃下水浴蒸干后得到的残渣用甲醇溶解、滤过后得到供试品溶液。本发明的供试品溶液制备方法，与现有的人参的供试品溶液制备方法相比，能更好地将人参皂苷基本完全提出，几乎无损耗，且现有的一些方法中，碱洗的次数通常需要4次左右，人参皂苷仍然会有明显的损耗，本发明方法经过条件改良和优化，碱洗一次即可实现本发明的完全提取效果，简化了步骤，还提升了提取效果。进一步地，步骤(2)中的水浴温度为75℃。人参皂苷在高温条件下不稳定，会发生转化，发明人对不同水浴整干温度进行测试，综合蒸干时间与损耗两个因素考虑，最后定为75℃水浴蒸干。进一步地，所述超声提取的条件为30～50khz、100～300w超声2～4h，优选为40khz、200w超声3h。进一步地，步骤(1)、(2)中滤过均采用尼龙滤膜。进一步地，所述尼龙滤膜的孔径为0.45μm。进一步地，步骤(1)中待提取样品：水饱和正丁醇的料液比为1g:20～30ml，优选1g:25ml；步骤(2)中滤液：正丁醇饱和的氨试液的体积比为1:1～1.5，优选1:1.2。进一步地，步骤(2)中，用水饱和正丁醇对氨水相进行反萃，将反萃得到的有机相与碱洗得到的有机相合并后蒸干。通过反萃步骤，可进一步降低损耗。进一步地，步骤(1)超声结束后，加入水饱和正丁醇补足超声过程的重量损失部分，再滤过。进一步地，所述检测方法还包括制备对照品溶液：将样品用甲醇溶解并稀释到指定浓度即得。所述检测方法可使用面积归一化法、自身对照法、内标法、外标法等方法分析等本领域内常用的方法计算检测结果。在本发明的具体实施方式中，采用外标法计算待测物含量。本发明的有益效果是：(1)采用本发明检测方法对复方谷氨酰胺肠溶胶囊进行质量控制，可实现其中人参皂苷rg1、re的有效分离，可更好地对复方谷氨酰胺肠溶胶囊进行质量控制。(2)本发明首次实现了复方谷氨酰胺肠溶胶囊中人参皂苷rg1、re的有效分离，为复方谷氨酰胺肠溶胶囊的检测、质量控制提供了可靠的方法。附图说明图1是药典方法的检测谱图；图2是本发明检测方法的检测谱图。具体实施方法下面通过具体实施方式和实验对本发明检测方法做进一步说明。实施例11、采用药典的方法检测复方谷氨酰胺肠溶胶囊中的人参皂苷rg1与re：采用chp2015版中国药典一部，照高效液相色谱法(通则0512)测定。对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷rg1对照品、人参皂苷re对照品及人参皂苷rb1对照品，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，摇匀，即得。供试品溶液的制备：取复方谷氨酰胺肠溶胶囊中的粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250w，频率50hz)30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按表4中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论塔板数按人参皂苷rg1峰计算应不低于6000。分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。表4时间(分钟)流动相a(vol.％)流动相b(vol.％)0～35198135～5519→2981→7155～70297170～10029→4071→60采用药典中的方法的检测图见图1，人参皂苷rg1与re分离情况较差且峰内明显有杂质包裹，无法对结果进行计算，无法准确检测出产品中人参皂苷rg1与re的含量。2、本发明方法：对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷rg1、re对照品适量，加甲醇稀释成每ml中含rg1、re各0.06mg的混合对照品溶液，摇匀，即得。供试品溶液的制备：取复方谷氨酰胺肠溶胶囊20粒，称重后将内容物取出，研细，精密称取内容物约2g，移加50.0ml水饱和正丁醇，超声3小时(40khz，200w)，放冷后补足损失重量，滤过(0.45μm津腾尼龙膜)。精密移取上述续滤液25.0ml，加30ml正丁醇饱和的氨试液碱洗1次，适当振摇后静置分层，分别收集有机层与氨水层；用30ml水饱和正丁醇反萃收集的氨水层，适当振摇后静置分层，合并2次收集的有机层，75℃水浴蒸干，残渣用甲醇转移至10ml量瓶中，定容，摇匀，滤过(0.45μm津腾尼龙膜)，续滤液作为供试品溶液。色谱条件与系统适用性试验：指定色谱柱为symmetryshieldrp18，4.6×250mm，5μm，waters；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按表5中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃，检测波长为203nm。人参皂苷rg1与re达到基线分离以上，理论塔板数按人参皂苷rg1峰计算应不低于6000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。表5时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～35198135～5519→2581→7555～7025→2975→7170～10029→4071→60100～100.140→1960→81100.1～1201981采用本发明方法的检测图见图2，人参皂苷rg1的保留时间为45.912；人参皂苷的保留时间为re48.905，人参皂苷rg1与re能保持基线分离以上，附近杂质对其检测无明显干扰，计算结果可靠。对本发明方法进行方法学验证，验证通过，回收率在93％左右，符合药典要求(90％～108％)，证明本发明的整个检测过程中对人参皂苷无明显损耗。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12