一种检测HCV感染者血清中抗非结构蛋白抗体的化学发光试剂盒及检测方法与流程

一种检测hcv感染者血清中抗非结构蛋白抗体的化学发光试剂盒及检测方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，涉及化学发光免疫分析定性/定量试剂盒，具体涉及一种应用重组的丙型肝炎病毒(hepatitis c virus，hcv)非结构蛋白抗原(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)包被微孔板，检测生成的包被抗原-待测抗体-酶标二抗复合物，可以对hcv感染者血清中的抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体进行体外定性/定量测定，建立hcv感染者血清中抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体的检测技术并进行方法学评价，该试剂盒可应用于丙型病毒性肝炎的筛查诊断、病情监测、预后评估、疾病机理和流行病学研究。


背景技术：

[0002]
1974年golafield m首先报告输血后非甲非乙型肝炎，1989年choo ql，weiner aj等在houghton m领导下利用分子生物学技术克隆出了非甲非乙型肝炎的主要病原体随后被命名为丙型肝炎病毒(hcv)的基因序列，由此引起的疾病称为丙型肝炎(hepatitis c)。现已证实丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，50-85％感染者成为慢性感染，并可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，10-30％患者可发展为肝硬化，其中肝细胞癌(hcc)年发生率约1-7％，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。2014年世界卫生组织最新统计表明：全世界大约超过1.85亿人感染了hcv，其中感染率以东亚(3.8％)、中亚(3.7％)、北非/中东(3.6％)、南亚(3.4％)及东欧(2.9％)为最高，每年全球约35万人死于与丙肝有关的疾病。我国丙型肝炎每年发病人数呈逐年上升趋势，中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会公布的历年“全国法定传染病疫情情况”资料显示：从2007年发病人数不足9.2万上升到2014年的20.3万；据此推算国内大约有4000万hcv感染者，各省市感染率不尽相同，平均感染率约为3.2％，是hcv感染的高流行区。随着hcv感染治疗进入泛基因时代，重组蛋白酶抑制剂的直接使用(direct acting antiviral，daa)可大大提高患者实现持续病毒学应答的比例(＞95％)，有望改变hcv感染威胁的严峻局面，但目前daa治疗尚面临着诸多有待解决的问题：(1)“边缘人群”无法接受有效治疗，如注射毒品者、服刑人员以及男同性恋等，加剧了疾病的流行；(2)经规范化daa治疗后，仍有部分患者未出现持续病毒学应答或治疗失败，且daa治疗并不能防止hcv再次感染；(3)医保支付比例低、治疗费用昂贵，患者每疗程治疗费用在数万元-数十万元人民币。由此可知，慢性hcv感染在未来很长一段时间内依旧是人类健康和全球公共卫生安全的重大威胁。
[0003]
hcv属于黄病毒科，病毒体呈球形，基因组为单股正链rna，全长约9.6kb，有7个基因型(1-7)和67个基因亚型，在我国以1b和2a基因型常见，hcv基因组由两端的5
′
非编码区(5
′-
ncr)、3
′
非编码区(3
′-
ncr)和中间的一个开放读码框(orf)组成，orf与5
′-
ncr下游紧邻，其基因组排列顺序为5
′-
c-e1-e2-ns1-ns2-ns3-ns4-ns5-3
′
，能编码一个由3010～3030个氨基酸组成的多聚蛋白前体，如图1所示，在宿主细胞信号肽酶和病毒自身蛋白酶的作用下，裂解产生10种hcv蛋白，如图2所示，包括：3种结构蛋白，即核衣壳蛋白(core)、包膜糖蛋
白(e1，e2)、跨膜蛋白(p7)；6种非结构蛋白(ns2，ns3，ns4a，ns4b，ns5a，ns5b)。core、e1、e2、p7共同组装成完整的病毒颗粒，非结构蛋白在病毒的生活周期中发挥重要作用。
[0004]
hcv非结构蛋白由ns2(2769-3419nt，217aa)、ns3(3420-5312nt，631aa)、ns4a(5313-5474nt，54aa)、ns4b(5475-6257nt，261aa)、ns5a(6258-7601nt，448aa)及ns5b(7602-9371nt，591aa)6种蛋白质构成，其中ns2蛋白是一个强疏水性跨膜蛋白，与ns3蛋白共同组成具有自我切割功能的ns2-3蛋白酶复合体；ns3蛋白结合到hcv基因组的3
′
末端上，在病毒rna复制中发挥调节作用，且ns3基因为研发疫苗和抗hcv药物的重要靶点之一；ns4a蛋白作为ns3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，与ns3蛋白形成稳定的蛋白复合物，对丝氨酸蛋白酶活性有重要的调节作用；ns4b蛋白是一种高度疏水的膜相关定位蛋白，可调节ns5b蛋白rna依赖的rna聚合酶的活性；ns5a蛋白是磷酸化的非结构蛋白，参与了hcv多种蛋白的成熟和rna复制；ns5b蛋白rna依赖的rna聚合酶的活性，是hcv rna复制的关键酶，且哺乳动物细胞中不存在类似的rna依赖的rna聚合酶的活性指导的rna合成过程，因此rdrp及其编码基因ns5b成为抗hcv药物研究的一个理想靶位。非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)在病毒增殖和感染、慢性致病、肝细胞癌变、免疫功能障碍中起重要作用。因此，检测hcv病毒非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)刺激机体所产生的抗体来评价hcv感染者的病程进展、药物疗效具有十分重要的意义，该领域的研究受到了分子生物学、传染病学以及流行病学专家的广泛关注。
[0005]
然而，目前国内外对抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体单独检测的化学发光免疫分析试剂盒及相关技术的研究尚属空白，国外有学者采用重组core、e1、e2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b蛋白建立免疫印迹方法检测hcv感染者血清中相应蛋白抗体(m，mel
é
n k，porkka p，et al.hepatitis c virus core，ns3，ns4b and ns5a are the major immunogenic proteins in humoral immunity in chronic hcv infection[j].virol j，2009，6：84.)，结果表明：在hcv感染者中不同蛋白的抗体阳性率是存在差异的，我们分析可能与hcv感染者的不同病程进展、不同基因型、daa治疗前后以及血清中存在循环免疫复合物有关。由于免疫印迹法的灵敏度不高，常规用于临床诊断丙型肝炎的试剂盒又都是采用hcv核衣壳区重组蛋白c-22、非结构蛋白ns3区重组蛋白c-200抗原、非结构蛋白ns4区重组蛋白c-200和ns5等作为混合包被抗原的第四代试剂来检测抗体(warkad sd，song ks，pal d，et al.developments in the hcv screening technologies based on the detection of antigens and antibodies.sensors(basel).2019，19(19)：4257.)，检测抗体的方法主要有酶联免疫吸附试验(elisa)、胶体金方法，以及如申请公布号为cn103018455a公开的化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂盒，但这些试剂盒只能检测hcv感染者血清中混合抗体，不能区分是何种蛋白成分的抗体，无法全面揭示单个hcv蛋白成分在hcv感染者的病情监测、预后评估和流行病学研究等方面的临床意义；如非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)刺激机体产生抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体及其循环免疫复合物，在hcv感染者不同基因型及亚型、不同临床分期(慢性、肝硬化、肝癌)、抗病毒治疗前后是否存在差异？迄今为止，均未见相关报道。因此，建立检测hcv感染者血清非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)相应抗体或循环免疫复合物中相应抗体的高灵敏度检测方法用于hcv感染者病情监测、预后评估和流行病学研究具有重要意义。为此我们拟建立一种检测hcv感染者血清中抗非结构蛋白
(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体的化学发光免疫分析方法，并进行方法学评价，完成试剂盒的研制，为揭示其含量的变化与hcv感染者的不同临床分型、疾病进展、daa疗效的关系提供技术支持。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术存在的不足，本发明目的在于提供一种用于检测hcv感染者血清中抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体的化学发光试剂盒及检测方法，该试剂盒可以对hcv感染者血清中的抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体进行体外定性/定量测定，建立hcv感染者血清中抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体的检测技术并进行方法学评价，该试剂盒可应用于丙型病毒性肝炎的筛查诊断、病情监测、预后评估、疾病机理和流行病学研究。
[0007]
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008]
一种检测hcv感染者血清中抗非结构蛋白抗体的化学发光试剂盒，包括由重组的hcv非结构蛋白抗原包被得到的微孔板和分别独立包装的样本稀释液、阴性对照、阳性对照、酶标记物工作液、底物液a、底物液b及洗液，底物液a包括鲁米诺、邻苯基苯酚、4-咪唑苯酚及碳酸缓冲液(cb)；底物液b包括过氧化脲与磷酸缓冲液(pb)。
[0009]
优选的，底物液a包括质量浓度为0.8g/l的鲁米诺、质量浓度为0.008g/l的邻苯基苯酚、质量浓度为0.025g/l的4-咪唑苯酚及ph9.0且摩尔浓度为0.1mol/l的碳酸缓冲液(cb)；底物液b包括质量浓度为0.3g/l的过氧化脲、ph7.4且摩尔浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲液(pb)。
[0010]
作为优选，样本稀释液是含有体积浓度为20％的牛血清、ph7.4且摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)。
[0011]
作为优选，阴性对照为热灭活的非hcv感染者(抗非结构蛋白抗体阴性)血清或血浆，且人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性，含体积浓度为0.2％的proclin 300防腐剂。
[0012]
作为优选，阳性对照为热灭活的hcv感染者(抗非结构蛋白抗体阳性)混合血清或血浆，且人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性，含体积浓度为0.2％的proclin 300防腐剂。
[0013]
作为优选，酶标记物工作液是用酶标记抗体稀释液将酶标记物原液稀释至质量浓度为0.05μg/ml(酶标记物原液是质量浓度为1mg/ml的辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg标记物)；酶标记抗体稀释液是含有质量体积浓度为5％的牛血清白蛋白(bsa)、体积浓度为0.5％的酶稳定剂、体积浓度为0.1％的吐温-20、质量浓度为5μg/ml的抗鼠抗体阻断剂、质量浓度为1μg/l的红色色素、体积浓度为0.2％的proclin 300、ph7.4且摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)。
[0014]
作为优选，洗液是含有体积浓度为0.5％的吐温-20、体积浓度为0.2％的proclin 300、ph7.4且摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)；使用时，洗液是20倍浓缩洗液按照1∶19的比例稀释而成，20倍浓缩洗液是含有体积浓度为10％的吐温-20、体积浓度为4％的proclin 300、ph7.4且摩尔浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)。
[0015]
具体的洗涤方法为，弃去孔内液体，将稀释后的洗液300μl注满各孔，静置时间不
超过60秒，弃去孔内洗液，重复洗3-5次后拍干。
[0016]
一种检测hcv感染者血清中抗非结构蛋白抗体的化学发光检测方法，包括以下步骤：
[0017]
(1)在重组的hcv非结构蛋白抗原包被微孔板中，先加入样本稀释液100μl，再加入10μl待测样本，盖上封板膜，振荡混匀，37℃
±
1℃温度下温育30min，洗涤除去未结合的组分；
[0018]
(2)设抗体阳性对照1孔，阴性对照2孔，分别加入阴、阳性对照各100μl；设空白对照孔1孔，不加任何样本；盖上封板膜，振荡混匀，37℃
±
1℃温度下温育30min，洗涤除去未结合的组分；
[0019]
(3)除空白对照孔，其余孔内加入100μl酶标记物工作液，盖上封板膜，振荡混匀，37℃
±
1℃温度下温育30min，洗涤除去未结合的酶标记物工作液；
[0020]
(4)每孔依次加入底物液b、底物液a各50μl，振荡混匀室温避光放置15分钟；
[0021]
(5)用化学发光免疫分析仪测量每孔的相对发光强度值rliv，当样本rllv与阴性对照rliv均值的比值≥2.1时，为阳性；反之，为阴性。
[0022]
将待测样本分别加入到预先包被重组hcv非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗原微孔板中，温育后，洗涤除去未结合的组分，再加入酶标记物工作液温育，洗涤除去未结合的酶标记物工作液；再加入反应底物鲁米诺，鲁米诺在碱性环境下被辣根过氧化物酶氧化而处于激发态，当从激发态回到基态时，辐射出最大发射波长为425nm的光，酶促发光产生的光信号通过光电倍增管进行信号转换后得到相应的信号值，用相对发光强度比值(rlir)表示，相对发光强度比值(rlir＝样本rliv/阴性对照rliv，≥2.1为阳性)高低与hcv感染者血清中抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体浓度呈正比。
[0023]
作为优选，包被微孔板的抗原是重组的hcv非结构蛋白抗原(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)；包被微孔板的方法包括以下步骤：将重组的hcv非结构蛋白抗原采用包被液稀释至0.5μg/ml，将稀释后hcv非结构蛋白抗原按照100μl量加入到微孔板中，2-8℃过夜或37℃2h，洗板洗去没有吸附到板上的蛋白，使用时每孔300μl洗液，反复洗3遍，拍干；
[0024]
完成包被的微孔板洗板拍干后，立即封闭；
[0025]
将完成包被的微孔板按200μl每孔的量加入封闭液，2-8℃过夜或37℃2h封闭，封闭完成后，将封闭液甩掉，利于包被板密封长期保存。
[0026]
作为优选，包被液是ph7.4且摩尔浓度为0.02mol/l的磷酸缓冲液(pb)；封闭液是含有质量体积浓度为5％的牛血清白蛋白(bsa)、质量体积浓度为1％的蔗糖、质量体积浓度为4％的明胶、体积浓度为0.2％的proclin 300、ph7.4且摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)。
[0027]
作为优选，当试剂空白的rliv值应＜30000，否则实验无效，需重复检验；抗非结构蛋白ns2抗体的阴性对照值应≤115000，ns3抗体的阴性对照值应≤400000、ns4a抗体的阴性对照值应≤400000，ns4b抗体的阴性对照值应≤115000，ns5a抗体的阴性对照值应≤400000，ns5b抗体的阴性对照值应≤400000，且两个阴性对照孔读数与阴性对照平均值之间相差≤10％，否则实验无效，需重复检验；
[0028]
抗非结构蛋白ns2抗体的阳性对照值应＞241500，ns3抗体的阳性对照值应＞840000、ns4a抗体的阳性对照值应＞840000，ns4b抗体的阳性对照值应＞241500，ns5a抗体
的阳性对照值应＞840000，ns5b抗体的阳性对照值应＞840000，否则实验无效，需重复检验。
[0029]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0030]
本发明的试剂盒通过洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开；再加入辣根过氧化物酶标二抗结合在固相载体上。再加入反应底物鲁米诺，鲁米诺在碱性环境下被辣根过氧化物酶氧化而处于激发态，当从激发态回到基态时，辐射出最大发射波长为425nm的光，酶促发光产生的光信号通过光电倍增管进行信号转换后得到相应的信号值，用rlir(相对发光强度比值)表示，待测抗非结构蛋白抗体的浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系；由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法具有很高的敏感度。
[0031]
本试剂盒可以对hcv感染者血清中的抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体进行体外定性/定量测定，建立hcv感染者血清中抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体的检测技术并进行方法学评价，该试剂盒可应用于丙型病毒性肝炎的筛查诊断、病情监测、预后评估、疾病机理和流行病学研究。
附图说明
[0032]
图1为hcv的基因结构组成及编码的多聚蛋白。
[0033]
图2为hcv结构蛋白和非结构蛋白结构3d图。
[0034]
图3为抗非结构蛋白抗体检测试剂盒的线性评价
[0035]
图4(1)～(5)为质粒pgex-4t-1-ns2测序图。
[0036]
图5为ns2蛋白电泳图。
[0037]
图6为抗非结构蛋白抗体化学发光试剂盒示意图。
具体实施方案
[0038]
丙型肝炎病毒hcv的基因组为单股正链rna，全长约9.6kb，有7个基因型(1-7)和67个基因亚型，在我国以1b和2a基因型常见，hcv基因组由两端的5
′
非编码区(5
′-
ncr)、3
′
非编码区(3
′-
ncr)和中间的一个开放读码框(orf)组成，orf与5
′-
ncr下游紧邻，其基因组排列顺序为5
′-
c-e1-e2-ns1-ns2-ns3-ns4-ns5-3
′
，能编码一个由3010～3030个氨基酸组成的多聚蛋白前体，如图1所示。在宿主细胞信号肽酶和病毒自身蛋白酶的作用下，裂解产生10种hcv蛋白，如图2所示，包括：3种结构蛋白，即核衣壳蛋白(core)、包膜糖蛋白(e1，e2)、跨膜蛋白(p7)；6种非结构蛋白(ns2，ns3，ns4a，ns4b，ns5a，ns5b)。
[0039]
目前国内外对抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体单独检测的化学发光免疫分析试剂盒及相关技术的研究尚属空白，国外有学者采用重组core、e1、e2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b蛋白建立免疫印迹方法检测hcv感染者血清中相应蛋白抗体，结果表明：在hcv感染者中不同蛋白的抗体阳性率是存在差异的，我们分析可能与hcv感染者的不同病程进展、不同基因型、daa治疗前后以及血清中存在循环免疫复合物有关。由于免疫印迹法的灵敏度不高，常规用于临床诊断丙型肝炎的试剂盒又都是采用hcv核衣壳区重组蛋白c-22、非结构蛋白ns3区重组蛋白c-200抗原、非结构蛋白ns4区重组蛋白c-200和ns5等作为混合包被抗原的第四代试剂来检测抗体，检测抗体的方法主要有酶联免疫吸附试验
(elisa)、胶体金方法等，但这些试剂盒只能检测hcv感染者血清中混合抗体，不能区分是何种蛋白成分的抗体，无法全面揭示单个hcv蛋白成分在hcv感染者的病情监测、预后评估和流行病学研究等方面的临床意义；如非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)刺激机体产生抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体及其循环免疫复合物，在hcv感染者不同基因型及亚型、不同临床分期(慢性、肝硬化、肝癌)、抗病毒治疗前后是否存在差异？迄今为止，均未见相关报道。因此，建立检测hcv感染者血清非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)相应抗体或循环免疫复合物中相应抗体的高灵敏度检测方法用于hcv感染者病情监测、预后评估和流行病学研究具有重要意义。
[0040]
本实施方案提供一种检测hcv感染者血清中抗非结构蛋白抗体的化学发光试剂盒，用于体外辅助诊断或疾病机制研究，此检测试剂盒采用化学发光免疫分析法，基于elisa间接法原理：
[0041]
微孔内预先包被重组非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗原，受检标本血清中待测抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体与固相载体表面的相应抗原结合。通过洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入辣根过氧化物酶标二抗结合在固相载体上。再加入反应底物鲁米诺，鲁米诺在碱性环境下被辣根过氧化物酶氧化而处于激发态，当从激发态回到基态时，辐射出最大发射波长为425nm的光，酶促发光产生的光信号通过光电倍增管进行信号转换后得到相应的信号值，用rlir(相对发光强度比值)表示，待测抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体的浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法具有很高的敏感度。
[0042]
一、制备检测抗非结构蛋白抗体的微孔板
[0043]
1、微孔板：12
×
8(可拆)，采用固相载体为聚丙乙烯制成的96孔微孔发光板nunc；微孔板nunc购置美国thermo fisher公司。微孔板分别用重组的hcv非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗原包被，ns2重组蛋白为自主重组表达获取(详见附录四)，ns3购自以色列prospec-tany基因技术有限公司(规格：100ug/100ul，批号：612phcvns3)，ns4a购自英国abcam公司(规格：1mg/ml，批号：gr3249079-1)，ns4b购自以色列prospec-tany基因技术有限公司(规格：100ug/10ul，批号：407hcvns401)，ns5a购自以色列prospec-tany基因技术有限公司(规格：100ug/10ul，批号：612phcvns5)，ns5b购自以色列prospec-tany基因技术有限公司(规格：100ug/10ul，批号：814hcvns5b)；
[0044]
(1)ns2抗原制备过程
[0045]
①
基因：含有hcv1b基因型ns2核酸序列(accession no：aj238800)的质粒puc-ns2由杭州擎科生物技术有限公司合成。
[0046]
②
菌株：大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)，为本实验室保存。
[0047]
③
试剂：限制性内切酶bam hi、hind iii购自美国neb(new england biolabs)公司，kod-plus系列高保真性聚合酶酶购自日本toyobo生物公司，t4 dna连接酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司，蛋白mark(14.4-116.0kba)为美国thermo scientific公司，ni-nta-agarose亲和层析柱为德国qiagen公司。
[0048]
④
扩增全长ns2基因的引物(杭州擎科生物技术有限公司)：
[0049]
ns2-f：5
’-
atcggatctggttccgcgt ggatcc atggaccgggagatggcag-3
’
[0050]
ns2-r：5
’-
ttagtggtggtggtggtg gtggaggagtcgccacccctg-3
’
[0051]
ns2-r1：
[0052]
引物中分别引入bam hi和hindiii酶切位点(斜体部分)，在下游引物ns2-r1中引入6个his(组氨酸)及终止密码子taa(黑体部分)。
[0053]
(2)ns2抗原制备方法
[0054]
①
hcv全长ns2的pcr扩增：
[0055]
以合成的puc-ns2质粒为模板，以ns2-f和ns2-r为引物，进行第一轮pcr扩增，再以第一轮扩增的pcr产物为模板，以ns2-f和ns2-r1为引物进行第二轮扩增。两轮pcr扩增参数均为94℃2min预变性，然后以94℃15s，53℃30s，68℃30s，共进行30个循环，最后72℃7min延伸。
[0056]
②
pcr产物鉴定与重组质粒pgex-4t-1-ns2的构建：
[0057]
用限制性内切酶bam hi和hind iii酶切pcr产物和表达载体pgex-4t-1，酶切体系为50μl，酶切反应体系：pcr产物/pgex-4t-1 43μl，bam hi 1μl，hind iii 1μl，酶切缓冲液nebuffer 2.1 5ul(含有摩尔浓度为1mol/l的nacl、摩尔浓度为100mmol/l的mgcl2、摩尔浓度为10mmol/l的dtt、ph7.9且摩尔浓度为500mmol/l的tris-hcl缓冲液)。混合均匀后，置于37℃水浴消化3～4h，酶切完成后，琼脂糖凝胶回收所需的目的片段和载体片段。回收结束，取出pcr管，加入上样缓冲液6
×
loading buffer 9μl(含有质量体积浓度为0.05％的溴酚蓝，质量体积浓度为0.05％的二甲苯腈蓝ff，体积浓度为36％的甘油，摩尔浓度为30mmol/l的edta，用摩尔浓度为2mol/l的naoh调ph至7.0)，混匀，上样于质量体积浓度为1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，电压150v，时间8min，电泳完毕后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察pcr扩增片段大小是否约为651bp。然后切下含目的片段凝胶，转移到2个新的无菌1.5ml离心管中，将凝胶块切碎，用axygen胶回收试剂盒进行dna片段回收。限制性内切酶bamhi和hindiii酶切后的目的片段和表达载体pgex-4t-1用t4 dna连接酶连接，连接温度为16℃，连接时间8-12h。最后送杭州擎科生物技术有限公司测序，与ns2目的片段序列比较是否一致。
[0058]
③
ns2蛋白的诱导表达：
[0059]
将质粒ns2转化到大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，在含质量浓度为100mg/l氨苄青霉素(amp)的2
×
酵母膏蛋白胨琼脂培养基(yt)培养基中，37℃培养3-4hr，吸光度od600在1.0-2.0之间时，添加摩尔浓度为1mmol/l的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，诱导培养3hr。
[0060]
④
ns2蛋白的提取和纯化：
[0061]
离心收集菌体，重悬于ph8.0缓冲液a(含有摩尔浓度为200mmol/l的nacl、μh8.0且摩尔浓度为50mmol/l的tris-hcl缓冲盐溶液)中超声波破碎；离心后的包涵体沉淀用ph8.0缓冲液b(含有摩尔浓度为150mmol/l的nacl、体积浓度为1％的triton x-100、ph8.0且摩尔浓度为50mmol/l的tris-hcl缓冲盐溶液)洗涤1次；洗涤离心的沉淀用ph8.0缓冲液c(含有摩尔浓度为500mmol/l的nacl、摩尔浓度为8mol/l的urea、摩尔浓度为10mmol/l的imidazole、ph8.0且摩尔浓度为50mmol/l的tristris-hcl缓冲盐溶液)重悬溶解后经ni-nta-agarose亲和层析柱纯化，经过sds-page电泳，收集目标蛋白。
[0062]
⑤
ns2蛋白的复性：
[0063]
将步骤
④
收集的纯化蛋白进行处理后透析复性。纯化蛋白标定为1.0mg/ml，添加摩尔浓度为1mmol/l的二硫苏糖醇(dtt)，室温(rt)反应30min；再加入质量体积浓度为0.1％的sds，rt反应15min。反应结束后样品装入透析袋1∶100进行透析，透析缓冲液(ph7.5且摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲液)。
[0064]
(3)结果
[0065]
①
ns2基因的扩增及表达载体pgex-4t-1的构建：
[0066]
以合成的puc-ns2质粒为模板，经pcr扩增出含全长的ns2基因，酶切后电泳鉴定表明ns2核酸片段的插入大小约651bp，与预期大小相符，将pcr产物连接到pgex-4t-1载体上，经测序正确(图4)，获得质粒pgex-4t-1-ns2。
[0067]
②
ns2基因在大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中的表达、纯化及复性：
[0068]
将质粒pgex-4t-1-ns2转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，诱导表达产生分子量51kda的gst(glutathiones-transferases，谷胱甘肽s-转移酶)融合蛋白(图5)，表达量较高。菌体经超声波破碎后，sds-page检查发现，表达蛋白在沉淀中形成包涵体。通过包涵体裂解及ni-nta-agarose亲和层析柱层析后透析复性，得到稳定的蛋白。
[0069]
2、稀释：将重组的hcv非结构蛋白(ns2或ns3或ns4a或ns4b或ns5a或ns5b)抗原(原始标定质量浓度为1mg/ml)采用包被液[ph7.4且摩尔浓度为0.02mol/l的磷酸缓冲液(pb)缓冲液]稀释至0.5μg/ml；
[0070]
3、包被：将稀释后hcv非结构蛋白(ns2或ns3或ns4a或ns4b或ns5a或ns5b)抗原按照100μl量加入到微孔板中，2-8℃过夜(过夜时长为20-24h)，也可在37℃2h；
[0071]
4、包被后洗板：洗去没有吸附到板上的蛋白，每孔300μl，反复洗3遍，拍干；其中，浓缩洗液(20
×
)是含有体积浓度为10％的吐温-20、体积浓度为4％的proclin 300、ph7.4且摩尔浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)，使用前按照1∶19的比例进行稀释成洗液(1
×
)，洗液(1
×
)是含有体积浓度为0.5％的吐温-20、体积浓度为0.2％的proclin 300、ph7.4且摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)，待用；完成包被的微孔板洗板拍干后，要立即进行封闭，如果洗板后干燥时间超过半小时，包被抗原的活性会明显下降；
[0072]
5、封闭：将完成包被的微孔板按200μl每孔的量加入封闭液[含有质量体积浓度为5％的牛血清白蛋白(bsa)、质量体积浓度为1％的蔗糖、质量体积浓度为4％的明胶、体积浓度为0.2％的proclin 300、ph7.4摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)]，2-8℃20-24h，也可在37℃2h封闭；
[0073]
6、封闭后甩板：将封闭液甩掉，利于包被板密封长期保存。
[0074]
7、干燥：除去微孔板上残余的洗液，利于密封长期保存，如果是短期内使用，直接拍干就可使用，加入干燥剂置于2-8℃冷藏保存待用。
[0075]
二、制备试剂盒
[0076]
1、样本稀释液的制备：样本稀释液是含有体积浓度为20％牛血清、ph7.4且摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)，其配制方法为：将200ml牛血清加入1l定容瓶内，再加入na
2
hpo
4
·
12h
2
o 2.9g，nah
2
po
4
·
2h
2
o 0.296g，nacl 9g，防腐剂proclin 300 2ml，最后加入双蒸水定容1l，溶液的ph＝7.4
±
0.2，配置好的样本稀释液置于2-8℃冰箱冷藏待用。
[0077]
2、阴性对照制备：阴性对照为热灭活的非hcv感染者[抗非结构蛋白(ns2、ns3、
ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体阴性]血清或血浆，且人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性，含体积浓度为0.2％的proclin 300防腐剂。
[0078]
3、阳性对照制备：阳性对照为热灭活的hcv感染者[抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体阳性]混合血清或血浆，且人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性，含体积浓度为0.2％的proclin 300防腐剂。具体制备方法：收集hcv感染者混合血清或血浆(人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性)，采用u-tube蛋白超滤浓缩(30kd)管(购置于德国默克，型号为：u-tube 20-30)浓缩igg抗体(50ml浓缩至10ml)，浓缩后的hcv感染者混合血清或血浆中加入体积浓度为0.2％的proclin 300防腐剂。
[0079]
4、洗液：浓缩清洗液(20
×
)是含有体积浓度为10％的吐温-20、体积浓度为4％的proclin 300、ph7.4且摩尔浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)，其配制方法为：向1l定容瓶内加入na
2
hpo
4
·
12h
2
o 58.0g，nah
2
po
4
·
2h
2
o 5.92g，nacl 180g，吐温-20100ml，防腐剂proclin 300 40ml，最后加入双蒸水定容至1l，溶液的ph＝7.4
±
0.2，配置好的浓缩清洗液(20
×
)置于常温保存待用。
[0080]
5、酶标记物工作液制备：
[0081]
酶标记物工作液是用酶标记抗体稀释液将酶标记物原液稀释至质量浓度为0.05μg/ml(酶标记物原液是质量浓度为1mg/ml的辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg标记物，酶标记物原液购自杭州隆基生物科技有限公司)；酶标记抗体稀释液是含有质量体积浓度为5％的牛血清白蛋白(bsa)、体积浓度为0.5％的酶稳定剂、体积浓度为0.1％的吐温-20、质量浓度为5μg/ml的抗鼠抗体阻断剂、质量浓度为1μg/l的红色色素、体积浓度为0.2％的proclin 300、ph7.4且摩尔浓度为0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液(pbs)，其配制方法为：向1l定容瓶内加入na
2
hpo
4
·
12h
2
o 2.9g，nah
2
po
4
·
2h
2
o 0.296g，nacl 9g，防腐剂proclin 300 2ml，牛血清白蛋白(bsa)50g，酶稳定剂5ml，吐温-20 1ml，抗鼠抗体阻断剂5mg，红色色素1μg，最后加入双蒸水定容至1l，溶液的ph＝7.4
±
0.2，配置好的酶标记抗体稀释液置2-8℃冷藏待用。
[0082]
6、底物液b：底物液b是含有质量浓度为0.3g/l的过氧化脲、ph7.4且摩尔浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲液(pb)，其配制方法为：向1l定容瓶内加入na
2
hpo
4
·
12h
2
o 58.0g，nah
2
po
4
·
2h
2
o 5.92g，过氧化脲0.3g，最后加入双蒸水定容至1l，溶液的ph＝7.4
±
0.2。配置好的底物液b置室温保存待用。
[0083]
7、底物液a：底物液a是含有质量浓度为0.8g/l的鲁米诺、质量浓度为0.008g/l的邻苯基苯酚、质量浓度为0.025g/l的4-咪唑苯酚、ph9.0且摩尔浓度为0.1mol/l的碳酸缓冲液(cb)，其配制方法为：向1l定容瓶内加入无水碳酸钠0.56g，碳酸氢钠7.96g，鲁米诺0.8g，邻苯基苯酚0.008g，4-咪唑苯酚0.025g，最后加入双蒸水定容至1l，溶液的ph＝9.0
±
0.1，配置好底物液a置2-8℃避光冷藏保存待用。
[0084]
8、封板膜及自封袋(含干燥剂)。
[0085]
9、最后按照每盒试剂96个测试进行配对分装(如图6)，由分别独立包装的样本稀释液、阴性对照、阳性对照、酶标记物工作液、底物液a、底物液b、洗液、检测抗非结构蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)抗体的微孔板(96孔)、封板膜与自封袋(含干燥剂)等组成
[0086]
三、收集血清：采集静脉血收集血清，或用乙二胺四乙酸二钠盐或钾盐(edta)抗凝
收集血浆，一周内进行检测的血清或血浆样本可于2～8℃存放，如需长时间，应置于-20℃，应避免反复冻融和交叉污染。
[0087]
四、检测方法
[0088]
1、准备
[0089]
(1)将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温。
[0090]
(2)将浓缩洗液按照1∶19的比例加入到去离子水或蒸馏水中，混匀备用。
[0091]
2、检测
[0092]
(1)加样：将重组的hcv非结构蛋白抗原包被微孔板固定于板架。每次检验设阴性对照2孔、阳性对照1孔，分别加入阴、阳性对照各100μl；设空白对照孔1孔，不加任何样本；
[0093]
其余孔先加入样本稀释液100μl，再加入10μl待测样本，盖上封板膜，振荡混匀，37℃
±
1℃温度下温育30min，洗涤除去未结合的组分；
[0094]
(2)加酶标记物工作液：除空白对照孔不加酶标记物工作液，其余孔内加入100μl酶标记物工作液；
[0095]
(3)温育：盖上封板膜，振荡混匀，37℃
±
1℃温度下温育30min；
[0096]
(4)洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置时间不超过60秒，弃去孔内洗液，重复洗5次后拍干；
[0097]
(5)显色：每孔依次加入底物液b、底物液a各50μl，振荡混匀室温避光放置15分钟；
[0098]
(6)检测：用化学发光免疫分析仪(tzd-cl-200s)测量每孔的相对发光强度值(rliv)，计算每孔的相对发光强度比值(rlir＝样本rliv/阴性对照rliv均值)，当样本rliv与阴性对照rliv均值的比值≥2.1时，为阳性；反之，为阴性。
[0099]
(7)质量控制
[0100]
①
试剂空白值应＜30000，否则实验无效，需重复检验。
[0101]
②
该试剂盒每个阴性对照值：抗非结构蛋白ns2抗体应≤115000，ns3抗体应≤400000、ns4a抗体应≤400000，ns4b抗体应≤115000，ns5a抗体应≤400000，ns5b抗体应≤400000，且两个阴性对照孔读数与阴性对照平均值之间相差≤10％，否则实验无效，需重复检验。
[0102]
③
该试剂盒每个阳性对照值：抗非结构蛋白ns2抗体应＞241500，ns3抗体应＞840000、ns4a抗体应＞840000，ns4b抗体应＞241500，ns5a抗体应＞840000，ns5b抗体应＞840000，否则实验无效，需重复检验。
[0103]
五、检测仪器：半自动化学发光免疫分析仪(tzd-cl-200s，厦门天中达生物科技有限公司)
[0104]
六、实验数据
[0105]
1、精密度试验
[0106]
批内不精密度：取已筛查到的高、低两个浓度样本，分别重复检测20次(孔)，计算rlir均值和sd，计算批内cv％。
[0107]
批间不精密度：取已筛查到的高、低两个浓度样本，每天上午、下午各检测1次，共进行10天20批次检测，计算rlir均值和sd，计算批间cv％，结果见表1。
[0108]
表1精密度实验统计结果及性能判断(n＝20)
[0109][0110][0111]
由表1可知，批内变异系数cv％小于10％，批间变异系数cv％小于15％。
[0112]
2、空白限和检出限
[0113]
(1)空白限：选择5份未感染hcv受检者血清，每天测2批，共检测6天，记录rlir值，共获得60个结果；按i类错误(α＝0.05)，即lob有5％的可能性含有待测物；采用非参数检验将空白样品的结果由小到大排序，第95百分位数值即为空白限lob，结果见表2。
[0114]
表2空白样本测定结果(rlir)
[0115]
[0116][0117]
由表2可知，采用非参数方法估计空白样品测量结果第95百分位数，即第95百分位数的结果是：ns2：1.57rlir，ns3：1.72rlir，ns4a：1.34rlir，ns4b：1.37rlir，ns5a：1.62rlir，ns5b：1.49rlir。
[0118]
(2)检出限
[0119]
选择期望浓度为1～5倍lob的血清标本5份作为低浓度样本，每天检测2次，连续测定6天，采用非参数分析法计算lod；5个低浓度样本连续12次的测定，结果见表3，结果呈非正态分布，使用非参数程序估计lod，即：lod＝lob+ds.β，ds.β是低浓度样品测定值中位数(m)和第5个百分位数值的差值。
[0120]
表3系列稀释样本测定结果(rlir)
[0121]
[0122][0123]
由表3可知，系列稀释样本检测值的中位数＝(第30秩号值+第31秩值)/2，d
s-β
＝中位数结果-第5百分位数结果，lod吸光度＝lob+d
s-β
，所以该试剂盒的检出限lod浓度分别为：ns2＝4.8rlir，ns3＝5.31rlir，ns4a＝4.02rlir，ns4b＝4.21rlir，ns5a＝5.08rlir，ns5b＝4.63rlir。
[0124]
3、线性
[0125]
分析测量范围(amr)：按ep6-a2文件要求进行设计，取未感染hcv受检者血清(低值l：抗ns2抗体1.641.63rlir、抗ns3抗体1.86rlir、抗ns4a抗体1.65rlir、抗ns4b抗体1.58rlir、抗ns5a抗体1.94rlir、抗ns5b抗体1.81rlir)和hcv感染者血清(高值h：抗ns2抗体17.0644.5rlir、抗ns3抗体34.17rlir、抗ns4a抗体29.66rlir、抗ns4b抗体17.95rlir、抗ns5a抗体17.14rlir、抗ns5b抗体33.09rlir)，按照5l，4l+ih，3l+2h，2l+3h，1l+4h，5h的比例配制6份样本，每份标本检测2次取均值，以预期均值和实测均值分别为横坐标和纵坐标作回归分析，得到回归方程(见图3)：抗ns2抗体y＝0.9894x-0.5756，抗ns3抗体y＝1.0079x-0.2776，抗ns4a抗体y＝1.042x-0.1212，抗ns4b抗体y＝0.9887x+0.0041、抗ns5a抗体y＝1.0231x-0.3606，抗ns5b抗体y＝0.9597x+0.4362，b在0.95～1.05之间，相关系数r≥0.975(r2≥0.95)，则hcv非结构蛋白抗体的分析测量范围分别是ns2：1.63～44.5rlir；ns3：1.86～34.17rlir；ns4a：1.65～29.66rlir；ns4b：1.58～17.95rlir；ns5a：1.94～17.14rlir；ns5b：1.81～33.09rlir，可参见图3。
[0126]
4、干扰实验
[0127]
将类风湿因子、乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒e抗体、梅毒螺旋体抗体、人类免疫缺陷病毒i型和(或)ii型抗体阳性的血清标本分别与抗ns2(30.53rlir)、ns3(14.28rlir)、ns4a(12.75rlir)、ns4b(10.33rlir)、ns5a(14.91rlir)、ns5b(24.11rlir)抗体阳性血清等量混合，同时以样本稀释液作对照，结果均无交叉反应。
[0128]
5、实例应用
[0129]
采用研制的抗非结构蛋白抗体检测试剂，对hcv感染者(随机选取慢性hcv感染者
45例)血清相应抗体进行检测，统计抗非结构蛋白抗体在慢性hcv感染者中的阳性率，结果见表4、5。
[0130]
表4慢性hcv感染者血清抗非结构蛋白抗体(除ns2、rlir)阳性率调查
[0131]
[0132][0133][0134]
*注：采用厦门新创公司生产的抗hcv混合抗体筛查试剂盒。
[0135]
表5慢性hcv感染者血清抗ns2蛋白抗体阳性率调查
[0136]
[0137][0138]
*注：采用厦门新创公司生产的抗hcv混合抗体筛查试剂盒。
[0139]
由表4和表5可知，统计各蛋白抗体在慢性hcv感染者中的阳性率，抗非结构蛋白抗体阳性率(rlir≥2.1为阳性)分别为：抗ns2抗体20％(9/45)、抗ns3抗体71.11％(32/45)、抗ns4a抗体35.56％(16/45)、抗ns4b抗体84.44％(38/45)、抗ns5a抗体55.56％(25/45)、抗ns5b抗体6.67％(3/45)。
[0140]
6、最适酶标抗体浓度及抗原工作浓度的选择
[0141]
(1)将酶标抗体50μl，100μl，150μl分别加入已包被的孔中，保温、洗涤，加发光底物后，读取rliv，结果见表6。
[0142]
表6酶标抗体工作量的选择(rllv)
[0143][0144]
表6可知，加样量为50μl和100μl比较，对灵敏度影响较大而对阴性样本影响不大；加样量100μl和150μl相比，对灵敏度影响不大而对本底影响较大。50ul和100μl酶结合物的加样量都在包被的有效空间内发生作用，所以灵敏度呈较好的线性关系，本底也不受影响，而150μl酶加样量在包被板的有效空间之外，所以灵敏度影响不大，而酶结合物则有部分和未能完全封闭的的空白板非特异性吸附，造成本底高了很多。由此可知，抗非结构蛋白(ns2，ns3，ns4a，ns4b，ns5a，ns5b)抗体检测试剂盒的最适酶结合物加样量为100μl。
[0145]
(2)棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度
[0146]
①
包被液将抗原系列稀释(将抗原浓度为1mg/ml稀释为0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2ug/ml，4μg/ml后，按行进行包被2～8℃过夜、洗涤；
[0147]
②
将阳性对照、阴性对照加样，保温、洗涤；
[0148]
③
加按工作浓度稀释的酶标抗体，保温、洗涤；
[0149]
④
加底物显色，读取rliv值。
[0150]
表7非结构蛋白抗原包被浓度比较(rliv)
[0151][0152]
表7可以看出，抗原的包被浓度对包被结果影响比较大：在2-0.5ug/ml之间，吸附于包被板上的抗原均处于饱和状态，对结果影响较大；而继续往下稀释，则明显影响灵敏度，证明0.5ug/ml(1∶2000)处于抗原包被饱和的临界点，且以此包被浓度最为经济。