专利名称：一种测定雷公藤甲素含量的方法
技术领域：
本发明涉及雷公藤甲素，具体地说，是一种利用气相色谱定量测定雷公藤甲素的方法。
雷公藤甲素亦称雷公藤内酯醇(Tripdiolide)，分子式C20H24O6，分子量36016，化学结构式
雷公藤内酯醇是雷公藤的主要活性成分，含量仅为生药的0.00030％-0.0068％，(《中草药》1994，25(10)，359-341)，提取率更低，有两篇报道为25万分之一(《药学学报》1993，28(2)，110-115；《华东医药通讯》1996，7(10)，4-5)，有的报道更低。
报道雷公藤甲素的测定方法有薄层色谱-比色法，μg水平，显色斑点不稳定，分辨率差(《中药材》1991，14(11)，37-38)。放免法，分辨率差，放射源污染(《中药药理与临床》1991，7(3)，21-24)。高效液相色谱法，μg水平，远紫外区(218mm)检测，受条件限制测不准(《中国药学杂志》1991，26(8)，478-479；《中国医院药学杂志》1996，12(2)，76-78)。
本发明的目的是提供一种精确测定雷公藤制剂和血液中雷公藤甲素含量的方法。
本发明的技术方案如下一种测定雷公藤制剂中雷公藤甲素含量的方法，它是定量的取雷公藤制剂加入溶剂，与过量的三氟醋酐反应生成雷公藤甲素三氟醋酸衍生物，吹干，用定量溶剂溶解，然后用气相色谱法测定其含量。
上述测定雷公藤甲素含量的方法中，所加入的反应溶剂是四氢呋喃。
上述测定雷公藤甲素含量的方法，气相色谱法是采用电子捕获检测器测定雷公藤甲素三氟醋酸衍生物的峰高，用标准曲线校正方程换算成雷公藤甲素的量。
上述测定雷公藤甲素含量的方法，气相色谱法采用内填SE-30的Chromosorb WDMCS担体的不锈钢柱，高纯N2作载气。
一种测定血浆中雷公藤甲素含量的方法，它是定量的取血浆加入定量的乙醚-氯仿混合液和碳酸盐溶液提取，定量取上清液，吹干，加入溶剂与过量的三氟醋酐反应生成雷公藤甲素三氟醋酸衍生物，吹干，用定量溶剂溶解，然后用气相色谱法测定其含量。
上述测定血浆中雷公藤甲素含量的方法，乙醚-氯仿混合液是三份体积乙醚和一份体积氯仿组成的混合液。
上述测定血浆中雷公藤甲素含量的方法中，所加入的反应溶剂是四氢呋喃。
上述测定血浆中雷公藤甲素含量的方法，气相色谱法是采用电子捕获检测器测定雷公藤甲素三氟醋酸衍生物的峰高，用标准曲线校正方程换算成雷公藤甲素的量。气相色谱仪采用内填SE-30的Chromosorb W DMCS担体的不锈钢柱，高纯N2作载气。
本发明的测定雷公藤甲素含量的方法能精确的测定雷公藤制剂中雷公藤甲素的含量。最小检测量为20ng，相关系数r＝0.99993。日内RSD＜3.8％，日间RSD＜5.5％。
本发明的测定雷公藤甲素含量的方法还能精确地测定服用雷公藤制剂的患者血浆中雷公藤甲素的含量，其回收率达95％以上。
图1是雷公藤甲素的气相色谱图，其中A.雷公藤甲素标准品；B.雷公藤制剂；C.血浆样品。
实施例线性范围试验精密称取雷公藤甲素标准品，用甲醇溶解，配成0.5mg/mL的标准储备液，用时用甲醇稀释成25μg/mL标准液。分别取标准液2、4、10、20、40μL，分别含雷公藤甲素50、100、250、500、1000ng，吹干后，加入50μL四氢呋喃，50μL三氟醋酐，密闭40℃反应30min以上，冷却，N2吹干，以50μL甲苯溶解，进样1μL。分别测出峰高H，以H为纵坐标，以雷公藤甲素的量W为横坐标，作出标准曲线校正方程为H＝0.0174W＋0.0034，其中H为色谱峰高，W为雷公藤甲素标准品的量。
取空白血浆1mL，分别加入2、4、10、20μL雷公藤甲素标准品配成的标准液，使血浆中雷公藤甲素浓度成50、100、250、500ng/mL，分别加3.50mL乙醚-氯仿(3∶1)，加50μL饱和K2C03溶液，振荡，离心，取3.00mL上清液，40℃空气吹干，加50μL四氢呋喃，50μL三氟醋酐，密闭40℃反应30min以上，冷却，N2吹干，以50μL甲苯溶解，进样1μL，分别测出峰高H，以H为纵坐标，以血浆中雷公藤甲素浓度为横坐标，作出标出曲线校正方程。
样品制备取雷公藤制剂少许称重，于50mL容量瓶中，氯仿定容，取50μL，吹干溶剂，加入50μL四氢呋喃，50μL三氟醋酐，密闭40℃反应30min以上，冷却，N2吹干，以50μL甲苯溶解，进样1μL。
取1mL血浆，加3.50mL乙醚-氯仿(3∶1)，加50μL饱和K2CO3溶液，振荡，离心，取3.00mL上清液，40℃空气吹干，加50μL四氢呋喃，50μL三氟醋酐，密闭40℃反应30min以上，冷却，N2吹干，以50μL甲苯溶解，进样1μL。
血浆回收率试验空白血浆1mL，分别加入2、8、20μL雷公藤甲素标准品配成的标准液，使血浆中雷公藤浓度成50、200、500ng/mL，按“样品制备”项处理，测得峰高H，与同浓度的雷公藤甲素标准品直接进样所测得的峰高Hs相比较，(H/Hs)×100％即为回收率。测定结果见表1。
精密度试验分别配成50、200、500ng/mL的雷公藤甲素标准品，每种浓度7份，24小时内测定，计算每种浓度的平均色谱峰高(X1)，以及标准偏差(SD1)，日内RSD＝(SD1/X1)×100％。测定结果见表2。
上述浓度连续测定7天，计算每种浓度的7天平均色谱峰高(X2)，以及标准偏差(SD2)，日间RSD＝(SD2/X2)×100％。测定结果见表2。
色谱条件1001气相色谱仪-63Ni电子捕获检测器柱1m×3mmLD不锈钢柱，内填5％SE-30担体Chromosorb W DMCS(80-100目)温度进样口280℃，检测器300℃，柱箱260℃载气N2(99.999％)，流量30mL/min脉冲电流1.0nA雷公藤甲素的保留时间为7.36min，分析色谱图见图1。
表1.回收率浓度 峰高(cm) 回收率 平均回收率(mg/ml) 直接进样 血样提取 (％) (％)50 0.90 0.8695.56200 3.45 3.3095.6596.62±1.7580014.0013.8198.64表2.精密度(n＝7)浓度 日内日间(ng/ml)峰高±SD(cm) RSD(％)峰高±SD(cm)RSD(％)50 0.72±0.0273 3.80 0.69±0.038 5.50200 2.83±0.045 1.58 2.85±0.12 4.21800 13.4±0.37 2.76 12 9±0.65 5.0权利要求
1.一种测定雷公藤制剂中雷公藤甲素含量的方法，其特征是取一定量的雷公藤制剂加入溶剂与过量的三氟醋酐反应生成雷公藤甲素三氟醋酸衍生物，吹干，用定量溶剂溶解，然后用气相色谱法测定其含量。
2.根据权利要求1所述的测定雷公藤甲素含量的方法，其特征是所加的反应溶剂是四氢呋喃。
3.根据权利要求1所述的测定雷公藤甲素含量的方法，其特征是气相色谱法采用电子捕获检测器测定雷公藤甲素三氟醋酸衍生物的峰高，用标准曲线校正方程换算成雷公藤甲素的量。
4.根据权利要求1所述的测定雷公藤甲素含量的方法，其特征是气相色谱仪采用内填SE-30的Chromosorb W DMCS担体的不锈钢柱，高纯N2作载气。
5.一种测定血浆中雷公藤甲素含量的方法，其特征是定量的取血浆加入定量的乙醚一氯仿混合液和碳酸盐溶液提取，定量取上清液吹干，加入溶剂与过量的三氟醋酐反应生成雷公藤甲素三氟醋酸衍生物，吹干用定量溶剂溶解，然后用气相色谱法测定其含量。
6.根据权利要求5所述的测定血浆中雷公藤甲素含量的方法，其特征是乙醚-氯仿混合液是三份体积乙醚和一份体积氯仿组成的混合液。
7.根据权利要求5所述的测定血浆中雷公藤甲素含量的方法，其特征是所加的反应溶剂是四氢呋喃。
8.根据权利要求5所述的测定血浆中雷公藤甲素含量的方法，其特征是气相色谱法采用电子捕获检测器测定雷公藤甲素三氟醋酸衍生物的峰高，用标准曲线校正方程换算成雷公藤甲素的量。
9.根据权利要求5所述的测定血浆中雷公藤甲素含量的方法，其特征是气相色谱法采用内填SE-30的Chromosorb W DMCS担体的不锈钢柱，高纯N2作载气。
全文摘要
本发明公开了一种测定雷公藤制剂和人血中的雷公藤甲素的方法。采用气相色谱电子捕获检测器测定雷公藤甲素三氟醋酸衍生物。该方法能排除其它雷公藤二萜类的干扰,线性范围50—1000ng,最小检测量20ng。血浆中雷公藤甲素回收率95%以上,日内和日间RSD分别小于3.8%和5.5%。本发明十分精确地定量测定雷公藤甲素含量。
文档编号G01N33/50GK1222678SQ9710718
公开日1999年7月14日 申请日期1997年11月4日 优先权日1997年11月4日
发明者袁倚盛, 杨丽莉, 张昕 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院