卡那霉素、红霉素、林可霉素三合一金标微孔试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种同时检测动物源性食品（如牛奶等） 中卡那霉素、红霉素、林可霉素含量的卡那霉素、红霉素、林可霉素二启金标微孔试纸条。
【背景技术】
[0002] 卡那霉素（Kanamycin)属于氨基糖式类抗生素，对各种革兰氏阴性细菌及革兰氏 阳性细菌均有良好的抗菌作用，适用于治疗细菌性痢疾或其他细菌性肠道感染，是我国畜 牧业和水产业中常用的兽药之一，也常被添加到饲料中促进动物的生长发育。虽然卡那 霉素具有良好的药理作用，但是其耳毒性和肾毒性作用也较为严重，因此其在动物性产品 中的残留问题也日益引起人们的关注。为严格控制卡那霉素在动物源食品中的残留，保 证人类的身体健康，欧盟和日本均对牛奶中卡那霉素的最高残留限量进行了规定，分别为 150 μ g/kg 和 400 μ g/kg。
[0003] 红霉素（Erythromycin)属于大环内酯类抗生素,抗菌谱与青霉素近似,临床上主 要用于耐青霉素及对青霉素过敏的金黄色葡萄球菌感染，也用于溶血性链球菌及肺炎球菌 所致的呼吸道肺炎、军团菌肺炎、支原体肺炎、皮肤软组织感染等，此外红霉素与白喉抗毒 素联用对白喉疗效显著。红霉素临床滥用可导致胃肠道反应、肝脏损害、过敏反应、心血管 反应等副作用，并可导致细菌产生耐药性，其在动物性食品中的残留会严重影响人类健康。 欧盟和我国对红霉素的残留限量均有规定，其中我国农业部235号公告中规定红霉素在奶 中最大残留限量为40 μ g/kg。
[0004] 林可霉素（Lincomycin)为一般系抑菌剂，在高浓度下对高度敏感细菌具有杀菌作 用。林可霉素口服适用于葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎球菌及厌氧菌所致的呼吸道感染、 皮肤软组织感染和厌氧菌所致的腹腔感染等。临床广泛应用可导致细菌产生耐药性。因此 有必要对动物性食品中的林可霉素的残留进行检测。欧盟和我国均规定林可霉素在牛奶中 的最大残留限量为150 μ g/kg。
[0005] 现有的卡那霉素、红霉素和林可霉素检测方法多为仪器方法，如HPLC、HPLC-MS/ MS、GC-MS/MS等，这些仪器方法灵敏度高，可以提供定量及确证分析，但是前处理复杂，需要 昂贵的仪器，且对操作人员有专业的要求，不适合基层检测分析。此外，在实际养殖过程中， 动物可能同时使用了多种抗生素，现有检测技术一般仅能检测一种或一类药物，目前尚无 可同时检测卡那霉素、红霉素和林可霉素残留量的产品。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种卡那霉素、红霉素、林可霉素三合一金标微孔试纸条。
[0007] 本发明提供了一种用于检测卡那霉素、红霉素和林可霉素的试剂盒，包括至少具 有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；
[0008] 所述样品槽的底部附着有卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、红霉素特异性抗 体的胶体金标记物和林可霉素特异性抗体的胶体金标记物；
[0009] 所述试纸条包括底板1、反应膜2、样品吸收垫3和吸水垫4 ;所述样品吸收垫、所 述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始 端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；所述反应膜上由始端至末端依次具 有T 3线、T2线、T1线和C线，所述T3线、T2线、T 1线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述 T3线、T2线和T 1线上分别包被如下三种偶联物(三种偶联物可任意排序）：林可霉素-载体 蛋白偶联物、红霉素-载体蛋白偶联物、卡那霉素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与 卡那霉素特异性抗体和/或红霉素特异性抗体和/或林可霉素特异性抗体结合的抗抗体。
[0010] 所述卡那霉素特异性抗体可为卡那霉素单克隆抗体或卡那霉素多克隆抗体。所述 红霉素特异性抗体可为红霉素单克隆抗体或红霉素多克隆抗体。所述林可霉素特异性抗体 可为林可霉素单克隆抗体或林可霉素多克隆抗体。所述卡那霉素单克隆抗体具体可为卡那 霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株KANA-2B1ICGMCC No. 8403分泌的单克隆抗体。所述红霉素单 克隆抗体具体可为红霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株ERM-3F1CGMCC No. 8402分泌的单克隆 抗体。所述林可霉素单克隆抗体具体可为林可霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株LIN-6D2CGMCC No. 8405分泌的单克隆抗体。
[0011] 任一所述的载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白。
[0012] 所述卡那霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为BSA，卡那霉素与BSA 的摩尔结合比具体可为9:1。所述红霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为0VA， 红霉素与OVA的摩尔结合比具体可为8:1。所述林可霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋 白具体可为0VA，林可霉素与OVA的摩尔结合比具体可为10:1。
[0013] 所述卡那霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
[0014] (1)称取50mg卡那霉素原料药，溶于4. Iml碳酸盐缓冲液（ρΗ9· 5、0· 1M);
[0015] (2)称取 70mg BSA，溶于 5ml 碳酸盐缓冲液（ρΗ9· 5、0· 1Μ);
[0016] (3)将步骤（1)得到的卡那霉素溶液加到步骤（2)得到的BSA溶液中并混匀，然后 加入0· 9mll% (体积比）戊二醛水溶液并搅拌I. 5h，然后滴加NaBH4溶液（6mg NaBH4用Iml 纯水溶解)并反应2h，然后用PBS缓冲液（pH7. 2、0. 01M)进行透析，然后4500rpm离心6min 并取上清液(卡那霉素-载体蛋白偶联物溶液)。
[0017] 所述红霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
[0018] (1)称取IOOmg红霉素原料药，溶于6ml无水乙醇，称为A液；
[0019] (2)称取羧甲基羟胺半盐酸盐44mg，溶于2ml水，用IM碳酸氢钠水溶液调pH=5-6， 称为B液；
[0020] (3)将B液加到A液中，然后50°C恒温水浴中搅拌反应5h，冷却到室温，然后加水 淬灭反应，用二氯甲烷萃取2次，合并2次萃取的二氯甲烷层，加入无水硫酸钠振摇后静置 过夜，然后过滤并收集滤液，减压旋蒸，得到干物质；
[0021] (4)取88mg步骤（3)得到的干物质，溶于6ml DMF中，然后在冰水浴下加入24 μ L 三正丁胺，混匀后再加入24 μ L氯甲酸异丁酯，冰浴下搅拌反应3h ;
[0022] (5)称取30mg 0VA，溶于3ml0.1 M的碳酸钠水溶液；
[0023] (6)取步骤（4)得到的溶液，在冰水浴环境下加到步骤（5)得到的OVA溶液中，然 后4°C搅拌3h，然后用PBS缓冲液（pH7. 2、0. 01M)进行透析，然后4500rpm离心6min并取 上清液(红霉素-载体蛋白偶联物溶液)。
[0024] 所述林可霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：
[0025] (1)取126mg盐酸林可霉素原料药，溶于I. 5ml蒸馈水；
[0026] (2 )取53mg高碘酸钠，溶于0· 5ml蒸馏水；
[0027] (3)将步骤（2)得到的高碘酸钠溶液加到步骤（1)得到的溶液中并反应20min，然 后加入17 μ 1乙二胺并反应2h，然后滴加NaBH4溶液（2mg NaBH4用Iml纯水溶解）并反应 IOh ；
[0028] (4)称取60mg 0VA，溶于6ml的蒸馏水；
[0029] (5)取580 μ 1步骤（3)得到的溶液，加入步骤（4)得到的OVA溶液，然后加入 500 μ 12. 5% (体积比)的戊二醛水溶液并搅拌3. 5h，然后加入NaBH4溶液（4mg NaBH4用2ml 纯水溶解)并搅拌24h，然后用PBS缓冲液（pH7. 2、0. 01M)进行透析，然后4500rpm离心5min 并取上清液(林可霉素-载体蛋白偶联物溶液)。
[0030] 卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、红霉素特异性抗体的胶体金标记物和林可 霉素特异性抗体的胶体金标记物的制备方法均如下：
[0031] (1)在沸腾的IOOmL的0. 01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%柠檬酸三钠 水溶液，获得终浓度为〇. 01%的胶体金溶液(胶体金的直径为15-20nm);
[0032] (2)用0· lmol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8. 5 ;
[0033] (3)将lyL10mg/mL的特异性抗体溶液(所述卡那霉素特异性抗体溶液、所述 红霉素特异抗体溶液或所述林可霉素特异抗体溶液）加入ImL步骤（2)得到的胶体金溶 液中并搅拌30分钟，然后加入lOyl^Og/lOOml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入 10 μ L10g/100ml的PEG8cicici水溶液并搅拌15分钟，然后4°C、4000g离心15min取上清液，然 后4°C、12000g离心20分钟取沉淀；
[0034] (4)用PBS缓冲液（pH7. 2、2mM)溶解步骤（3)得到的沉淀，4°C、12000g离心20分 钟取沉淀，然后用200 μ L含lg/100ml BSA的PBS缓冲液（pH7. 2、20mM)重悬沉淀，得到特 异性抗体的胶体金标记物。
[0035] 所述卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、所述红霉素特异性抗体的胶体金标记 物和所述林可霉素特异性抗体的胶体金标记物均可以冻干品的形式附着于于所述样品槽 底部。这样做的优势是简化样品前处理过程，提高