作为表皮成熟标记的表面各向同性的制作方法
【专利说明】作为表皮成熟标记的表面各向同性
[0001] 皮肤是人体最大的器官，它有多种功能。最重要的功能是保护身体免受外界的影 响。
[0002] 皮肤的表面不是光滑的，而其特征在于反映皮肤三维组织结构的特殊纹理 (relief)。这种纹理由于环境和生理两种因素而经受变化。在这些因素中，通过药物和化 妆品的外用治疗当然是非常重要的。
[0003] 皮肤的机械特性在许多的化妆品和临床意义中是很重要的考量。例如，皮肤机械 特性的知识能够有助于量化化妆产品如霜或者洗剂（lotion)的效力，还有助于研宄皮肤 老化。最后，因皮肤疾病在皮肤的机械性质上的变化会对这些疾病的更好了解和治疗起到 作用。
[0004] 尤其是通过防止体液损耗和不良物质的渗透保护身体的皮肤屏障功能，其主要是 通过表层（top layer)实现的。该层，又叫作角质层，由角质细胞（由蛋白质和脂质构成） 组成，该角质细胞嵌入在由胆固醇、神经酰胺和脂肪酸组成的富含脂质的基质中。当接触 环境时另一类脂质也分泌在表皮的表面，该脂质与水相互作用形成对维持皮肤的水分含量 (moisture content)和感觉属性重要的亲水膜。该亲水膜的脂质部分也能够渗透进表皮的 上层，与表皮的屏障结合，并还有助于其功能。当设计化妆品时这是要考虑的相当重要的因 素，因为就是角质层与像霜和洗剂的化妆品界面结合。
[0005] 在过去的十年间，关于新生儿皮肤生理学（newborn skin physiology)的知识已 经逐步发展。现在清楚的是，出生后的生活是积极的功能成熟和皮肤对干燥的子宫外环境 适应的一段时期。不同的环境因素（例如，干冷气候、尿布和化妆品护理程序）影响尤其是 在早产儿中的皮肤功能参数如角质层水合作用和渗透屏障的出生后发育。
[0006] 本发明人已经显示在先前的研宄（Fluhr等，Br J Dermatol，166(3) :483-90, 2012)中表明角质层的湿度和水分含量低于出生时（婴儿1-15 天），而天然保湿因子（NMF)的比率最高。该比率随后在水合作用稳定时降低。作者假设皮 肤减少的酸化作用和更低的水合作用能够激活补偿调节机制（包括NMF的显著生成），这使 得新生儿能适应他的新环境。
[0007] 为了获得对屏障功能的全面评估，就不得不依赖参数如NMF，这要求大量的技术。 特别地，测量NMF用的设备成本会妨碍多数的生物实验室提供那种给付。
[0008] 因此仍然需要开发新的工具用于评估皮肤的屏障功能。
【发明内容】
[0009] 本发明人已经表明皮肤的成熟水平和随此水平的屏障组织结构/功能，能够通过 评价皮肤表面的各向同性/各向异性而轻易确定。在这方面，发明人已经开发了一种新的、 半定量的评分系统，其能够可靠且可重现地评估皮肤表面的各向同性。
[0010] 为阐明在新生儿中的主要皮肤生理功能，进行了两个临床研宄。这些研宄旨在无 创地研宄皮肤表面成熟，其是通过与不同的儿童年龄组和成人的皮肤比较来表征婴儿的皮 肤而进行的。
[0011] 因此本发明涉及用于确定受试者皮肤表面的成熟度的方法。特别地，本发明人已 经观察到皮肤表面的成熟度与所述皮肤表面渐增的各向同性密切相关，正如通过检测反映 细胞组织结构的各种参数所评价的。
[0012] 因此本发明的方法能够从出生时表征皮肤表面并能够监测其随时间的演变。"儿 童"根据本发明指年龄小于16岁的个体。尤其是，1-15天的初生儿（neonates)、5/6周的 婴儿、6个月± 1个月的婴儿及1-2岁的婴儿根据本发明包括在儿童分类内。如在本文使用 的"初生儿"可以是足月出生的也可以是早产的。为避免歧义，在本申请中使用的术语"儿 童"没有进一步的解释时必须在其最广泛的意义上理解，即指16岁以下的人。"成人"在本 发明的含义内指不是儿童的人，也就是超过16岁的人。
[0013] 优选地，可以使用本发明的方法而不考虑皮肤种族或地理，或其光类型 (phototype)。其可以是高加索、非洲、亚洲、南美、美拉尼西亚或任何其他来源的；其可具有 光类型I、II、III、IV、V或VI，并不因此而影响本发明。本发明的方法的确旨在确定皮肤表 面成熟，其不考虑皮肤类型，而只取决于供体年龄。
[0014] 因此本发明涉及用于确定受试者皮肤表面的成熟度的方法，所述方法包括评估所 述皮肤表面的各向同性的步骤。
[0015] 就"各向异性"而言，其在本文涉及依赖方向上的性质，而如在本文中使用的"各向 同性"意味着在所有方向上完全相同的性质。可以理解的是，各向同性和各向异性是相反 的，即当各向同性增加时，各向异性减少，反之当各向异性增加时，各向同性减少。
[0016] 皮肤是高度非线性的，各向异性的，粘弹性的，且几乎不可压缩的材料。它的性质 随着年龄、地点和人的不同而改变。这导致了难以获取皮肤机械性质的定量描述。第二个 问题是用到的大量的各式仪器、单位和测量条件使得难以比较结果。
[0017] 本发明人已经找到一种绕过这些不便的新途径。他们已经观察到通过检测皮肤表 面的细胞组织结构能够评估各向同性。根据该实施方案，通过评估细胞参数如细胞密度、细 胞团、粘附性/细胞形状及单个细胞的可辩性（differentiability)评估所述皮肤表面的 各向同性。
[0018] 本发明人已经设计了新的评分系统，EMI (Electron Microscopy Isotropy，电子 显微镜法各向同性）评分系统，其使得表面各向同性能够被半定量分析。
[0019] 所述评分系统包括使用基于细胞密度、细胞团、粘附性/细胞形状及单个细胞的 可辩性四个参数的适当的数值范围。这些标准每一个在0-3的数值范围上进行评分，其中 〇表明细胞是分离的，或者细胞团是完全不规则的，或者细胞形状非对称且完全不规则，或 者细胞不可辩，而分值3表明细胞是融合的，或者细胞团是规则的，或者细胞形状规则且对 称，或者细胞极易可辨。
[0020] 分值0-4表明各向异性，而分值5-7表明中等的各向同性，以及分值8-12表明良 好的各向同性。
[0021] 因此将皮肤的成熟度与EMI分值联系起来是可能的。分值0-4表明不成熟的皮肤 表面，分值5-7表明皮肤表面的中等成熟，且分值8-12表明完全成熟的皮肤表面。
[0022] 在此基础上，本发明人能够区分与儿童年龄相关的三类皮肤表面成熟：
[0023] -不成熟：0至5/6周；
[0024] -中等的成熟：多5/6周至1-2岁；以及
[0025] _成熟：多1-2岁。
[0026] 因此在优选的实施方案中，本发明涉及确定受试者的皮肤表面于其组织结构/功 能是成熟还是不成熟的方法，所述方法包括步骤：
[0027] a)取得所述受试者的皮肤样本㈧；
[0028] b)将所述皮肤样本评分至适当的数值范围，其中所述适当的数值范围基于细胞密 度、细胞团、粘附性/细胞形状及单个细胞的可辩性四个参数。
[0029] 优选地，所述数值范围是0-12的数值范围，其中分值0表明强烈的各向异性且分 值12表明良好的各向同性。
[0030] 所述皮肤表面样本的EMI分值通过从先前实验结果的汇编获得的参考而确定。的 确，如本发明人所示，显然EMI分值随着年龄而增加。例如，4或小于4的EMI分值与不成熟 的皮肤表面有关，而分值8或大于8则与成熟的皮肤表面有关。
[0031] 可替代地，将本发明的皮肤表面样本的EMI分值与来自参考受试者（reference subject)的皮肤表面样本的EMI分值相比较是可能的。就"参考受试者"而言，在本文表示 年龄已知的受试者。优选地，参考受试者是1-15天的新生儿，5/6周的婴儿，6个月±1个 月的婴儿，1-2岁的婴儿或者超过16岁的成人。
[0032] 使用为本领域技术人员已知的各种皮肤成像方法能够确定EMI分值的各种参数。 这样的方法包括，尤其是使本领域技术人员能够观察且区分角质层的细胞的所有技术。例 如，技术人员可以使用任意在实验室中常用的显微镜技术。这些技术包括，例如，光学显微 镜法如传统的光学显微镜法、荧光显微镜法、共焦/多光子显微镜法及受激发射损耗；扫描 探针显微镜法，包括扫描隧道显微镜法（STM)、原子力显微镜法（AFM)、近场扫描光学显微 镜法及其他；以及电子显微镜法。适于本发明方法的电子显微镜技术包括像透射电子显微 镜法（TEM)、扫描透射电子显微镜法（STEM)、聚焦离子束显微镜法（FIB)以及扫描电子显微 镜法（SEM)这样的技术。优选地，使用电子显微镜技术确定Emi分值参数。
[0033] 扫描电子显微镜法（SEM)呈现了非常精确的方法，该方法用于直接分析最外面的 皮肤层尤其是角质层的微结构。随着分辨率和可能从X 100直到X 100000的放大率，其能 够获得皮肤表面形貌和超微结构的高质量三维图片。更优选地，所述参数通过执行扫描电 子显微镜法来确定。根据该实施方案，使用SEM获取的皮肤样本的图像并由此对其进行检 测从而确定EMI分值的各种参数。
[0034] 因此，根据该实施方案，本发明涉及确定受试者的皮肤表面于其组织结构/功能 是成熟还是不成熟的方法，所述方法包括步骤：
[0035] a)取得所述受试者的皮肤样本（A);
[0036] b)通过扫描电子显微镜法获取所述皮肤样本的图像，以及
[0037] c)将所述皮肤样本评分至适当的数值范围，其中所述适当的数值范围基于细胞密 度、细胞团、粘附性/细胞形状及单个细胞的可辩性四个参数。
[0038] "皮肤样本"根据本发明包括含有皮肤细胞的任何样本。有利地，所述皮肤样本通 过从皮肤的表面剥离所述表面而获取。有助于这个目的的各种设备在市场上可买到，比如， 例如D-SQUAME li 皮肤取样 Disc