一种检测人肾损伤分子的酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶联免疫分析技术领域中的一种检测人肾损伤分子的酶联免疫试剂 盒。
【背景技术】
[0002] Iehimura 等于 1998 年米用表象差异分析（rep-resentational differenee analysis，RDA)在缺血一再灌注大鼠肾细胞中识别一种新的I型跨膜蛋白，命名为肾损伤 分子一 l(kidney injury molecule - 1，KIM-1)，其大量表达于缺血一再灌注损伤后再生 的近曲小管上皮细胞，而在正常肾组织中表达甚微。人类KM-I基因定位于第5号染色体 长臂（5q33. 2)，KM-I蛋白由334个氨基酸残基组成，蛋白结构表明，KM-I可能属于免疫 球蛋白超家族，其胞外区包括1个信号肽、1个Ig域和1个粘蛋白域，执行膜受体/粘附分 子的功能。KIM-I胞内区较短。含一个保守的酪氨酸磷酸化位点，可能为转导受体一配体相 互作用的细胞内信号转导通路。KM-I的表达具有极高的组织特异性。RNA印迹杂交分析 表明，KIM-I在胎肝、胎肾中不表达，在正常成人肝、肾、脾有微弱表达，而在缺血损伤后的肾 组织中表达显著增强。免疫组织化学染色及RNA原位杂交显示，KIM-ImRNA及蛋白分子表 达于外髓部外层及皮质髓射线的近曲小管S3区再生上皮细胞中，亚细胞定位大多在基底 膜细胞顶部。KIM-I的生物学功能，可能参与肾脏疾病的损伤及修复过程、对抗损伤性粘附 与免疫反应过程。
[0003] KM-I在临床上可作为检测急性肾损伤的灵敏、特异、定量的生物学标记物：急性 肾损伤（acute kidney injury，AKI)是涉及多学科的一种常见病症，早期发现和及时治疗 可防止病情进一步恶化，阻止其发展成肾衰竭。既往传统的血肌酐、尿素氮等指标无法满足 AKI的临床早期诊断需要。KIM - 1被认为AKI的标志物之一，KM - 1是一种新的I型跨 膜糖蛋白，在正常的肾组织中几乎不表达，但在缺血、肾毒性等所致的AKI的肾小管上皮细 胞呈高表达，其细胞外域在金属基质蛋白酶（matrixmetallopr-oteinases，MMP)的作用下 可裂解为可溶性片段释放到细胞外，并排入尿中。动物研究表明，尿KIM - 1的升高早于血 肌酐、尿素氮、尿蛋白等指标，当人类发生AKI时，尿KM-I升高也较明显，但KM - 1能否 最终被广大的临床医生所公认并成为早期确诊AKI的灵敏指标，还需在进一步的临床研究 中得到证实。
[0004] KM-I还可用于肾肿瘤的早期诊断。已有报道表明，可溶性KM-I的粘蛋白域可对 抗粘附，起细胞保护作用，肿瘤细胞上的粘蛋白过度表达，也可抑制淋巴细胞与肿瘤细胞的 粘附，从而保护肿瘤细胞，使其转移成为可能。肾细胞癌细胞株769-P能大量表达KIM-1， 肾细胞癌患者肾活检标本通过免疫组化显示，同样高度表达KIM-1，而在肾切除术后，尿 KM-I水平迅速下降或消失，表明KM-I及其可溶性成分可能在肾肿瘤的发展及转移中起 作用，可作为肾肿瘤的早期诊断指标。
[0005] 基于KM-I在临床研究和辅助诊断中可能具有的重要作用，准确测定不同尿液样 本中的KIM-I水平对于基础及临床研究均具有重要的意义。酶联免疫法由于检测设备要求 低，易于实现快速高通量，定量较为准确，因此是目前测定KM-I的主要手段，本发明完全 自主开发出了针对KM-I不同位点的新型鼠抗KM-I单克隆抗体，采用双抗夹心法组成了 KIM-I检测试剂盒，可以被广泛应用于KIM-I的基础及临床研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种检测灵敏度高、准确性强、低成本的人KIM-I双抗夹心 法检测试剂盒。
[0007] 本发明所提供的检测试剂盒包括特异性的KM-I包被抗体，酶标KM-I检测抗体 以及人KIM-I蛋白标准品。
[0008] 其中所述KM-I包被抗体和检测抗体皆为鼠源单克隆抗体，所述人KM-I蛋白标 准品为真核表达的重组人KM-I蛋白。
[0009] 所述单克隆抗体采用重组人KM-I蛋白免疫动物，利用杂交瘤技术制备获得。酶 标抗体按照常规方法利用辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP)标记抗体获得。 所述重组人KIM-I蛋白是真核表达后纯化获得。
[0010] 本发明的技术方案为优选针对KIM-I不同表位，具有高灵敏度、高特异性的单克 隆抗体配对组合，将一株单克隆抗体作为包被抗体吸附于固相载体上，包被抗体可以特异 性的捕获样本中的KM-I以及KM-I蛋白标准品，加入酶标检测抗体后，形成包被抗体、抗 原、检测抗体复合物，相应底物显色后终止，读取样本吸光值，通过与标准曲线比较即可得 出KM-I的含量。
[0011] 本发明采用双抗夹心法定量或定性检测样本中的KIM-I水平，检验方法方便易 行，检测灵敏度和准确度高、特异性强、能够同时快速检测大批样本，制备抗体所需免疫原 和筛选抗原以及试剂盒中的蛋白标准品全部采用重组人KIM-I蛋白，试剂盒主要组成部分 的抗体和蛋白标准品均为自主研发，因此成本低，可靠性强，预计将在KIM-I相关基础和临 床研究中发挥重要作用。
【附图说明】
[0012] 图1重组人KM-I蛋白标准品电泳鉴定图
[0013] 图2人KIM-I酶联免疫试剂盒检测标准曲线图
【具体实施方式】
[0014] 以下结合具体实施例对本发明做进一步的描述和说明。
[0015] 实施例1酶联免疫试剂盒的组分制备
[0016] 1.人KM-I蛋白小鼠单克隆抗体的制备：
[0017] 1)动物免疫
[0018] 采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以义翘神州生物技术有限公司生产的重组人 KM-I蛋白为免疫原，免疫剂量为SOyg/只，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制 成乳化剂，腹部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成 乳化剂，加强免疫两次，三次免疫后测定血清效价，取血清效价高的小鼠腹腔加强免疫一 次，4天后取脾细胞进行融合。
[0019] 2)细胞融合和克隆化
[0020] 取免疫小鼠脾细胞，按4 : 1比例与SP2/0骨髓瘤细胞混合，利用聚乙二醇法进行 融合，获得杂交瘤细胞。采用重组人KM-I蛋白作为包被抗原，用ELISA法测定细胞上清液， 选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化，直至得到稳定分泌KIM-I特异性单克隆抗体的杂交 瘤细胞株。
[0021] 3)单克隆抗体的生产与纯化
[0022] 选取杂交瘤细胞株，利用培养瓶或生物反应器进行细胞培养，收集细胞培养上清， 利用蛋白A进行亲和纯化，鉴定抗体纯度和浓度后分装，于_20°C低温保存。
[0023] 2.酶标抗体的制备：
[0024] 1)称取5mg HRP溶解于0. 5ml蒸馏水中。
[0025] 2)于上液中加入0. 5ml新配的0.1 M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
[0026] 3)将上述溶液装入透析袋中，对ImM的醋酸钠缓冲液（pH4. 4)透析，4°C过夜
[0027] 4)加0· 2M碳酸盐缓冲液（ρΗ9· 5)，使以上醛化HRP的pH升高到9. 0~9. 5,然后 立即加入5mg IgG在ImlO. OlM碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
[0028] 5)加 0.